基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片

摘要

本发明涉及一种基于磁微粒化学发光的多种目标物定量检测的微流控芯片；所述微流控芯片为双层结构，包括盖片(1)和底片(11)，其中盖片(1)上的气泵(3)、气流微通道(5)、加样孔(2)、样本液流通道(6)、第一生物标记物存储池(4)、微混合器(7)以及过渡区(10)依次连接；底片(11)上的过滤器(12)、反应室(13)、清洗区(14)、检测室(15)、溶液释放通道(18)依次连接，检测室(15)通过溶液释放通道(18)分别与发光液存储池(16)，清洗液存储池(17)连接。

权利要求

1.一种基于磁微粒化学发光的多目标分析物定量检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片为双层结构，包括盖片(1)和底片(11)，其中盖片(1)上的气泵(3)、气流微通道(5)、加样孔(2)、样本液流通道(6)、第一生物标记物存储池(4)、微混合器(7)以及过渡区(10)依次连接；底片(11)上的过滤器(12)、反应室(13)、清洗区(14)、检测室(15)、溶液释放通道(18)依次连接，检测室(15)通过溶液释放通道(18)分别与清洗液存储池(16)，发光液存储池(17)连接；所述第一生物标记物存储池(4)存储预封装酶标记的不同配体的溶液或发光剂标记的不同配体的溶液，所述反应室(13)包被预封装不同磁颗粒标记的不同配体，所述磁颗粒标记的不同配体使用的磁颗粒按照表面积与内部磁含量的平均比值的不同将磁颗粒进行编码，划分成不同的磁颗粒组，并对各组给出相应的编号；所述盖片(1)和底片(11)用胶带(20和22)密封。

2.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)为液囊或试剂槽，体积为5～500μL；所述微流控芯片的微混合器是宽度为20～300μm，深度为10～100μm的蛇形，折线形或方形结构。

3.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的过滤器(12)由腔体和滤血膜组成。

4.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的反应室(13)为毛细管微通道，该毛细管微通道为管状通道或矩形通道。

5.如权利要求4所述微流控芯片，其特征在于，所述毛细管微通道为管状通道时直径为

0.5～10mm；所述毛细管微通道为矩形通道时尺寸范围：宽为0.1～5mm，深度为0.01～2mm，长为5～40mm。

6.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒组的编码方法包括将具有相同表面积，但内部磁含量不同的一类磁颗粒进行组合，分别编码为不同磁颗粒组；或将表面积不同，而磁含量相同的一类磁颗粒进行组合，分别编码为不同磁颗粒组；或表面积和磁含量均不同的一类磁颗粒进行组合；所述磁颗粒组编码所用磁颗粒为顺磁性核壳结构，其中磁颗粒的磁核为Fe3O4或γ-Fe2O3的化合物，外壳为聚苯乙烯化合物，且磁颗粒表面经过修饰带有功能化基团，选自-COOH、-COH、-NH2、生物素，链霉亲和素中的一种，磁颗粒粒径为

0.1～10μm；所述酶标记配体使用的酶包含过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，所述发光剂标记配体使用的发光剂包含吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺及其衍生物和金刚烷。

7.一种应用微流控芯片进行同一样本中多目标物定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1)从加样孔加入样本，盖上血液盖，将微流控芯片放入配套仪器中，系统释放酶标抗体，然后按压气泵使样本和酶标抗体混合均匀且发生化学反应，形成一种免疫复合物，然后流入底片过滤器中；

步骤2)样本经过滤器后，到达反应室，复溶固化的磁颗粒标记的抗体，仪器系统相对于反应室位置以一定的速度移动外部磁铁，搅拌液体混合物，使它们充分参与反应，反应结束磁铁收集磁颗粒并移动至清洗区，系统释放清洗液，磁颗粒经充分洗涤，除去未参与反应的液体试剂和其他杂质；

步骤3)在磁铁作用下磁颗粒运动至检测室，系统释放发光基底液，移走磁铁，磁颗粒复合物按照一定的顺序先后释放，并沉降在检测室底部不同位置，采用光探测器以一定的方式采集发光信号，并以一定方式输出检测结果，从而实现同一样本中多目标分析物的定量检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述配套仪器主要包括磁铁和检测装置，磁铁装置对微流控芯片所施加的主要作用包括混合磁颗粒复合物，收集磁颗粒，洗涤二级反应混合物，在某一方向发生相对运动。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述磁铁的运动方式包括：匀速直线运动或加速运动，或两种运动方式的交替，运动的速度为0.5mm/s～50mm/s。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)所述磁颗粒的释放顺序为在外磁场的影响下根据运动速度的快慢先后沉降在检测室底部的不同位置，且速度大的磁颗粒组首先发生沉降；步骤3)所述发光信号的采集主要是一定的方式排列光学探测器，检测到的发光信号至少为双峰。

说明书

基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片，该芯片将微流控技术和磁性微球技术相结合，在微流控芯片中快速、便捷地实现多目标物的定量检测。本技术方案属于生物分析检测领域。技术背景

[0002] 近年来，生物分析技术领域得到了快速的发展，出现了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技术是其中最活跃的一支，在科研和应用领域都获得了广泛的重视。微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用。

[0003] 磁性微球(Microspheres，MS)，是近年来国内外研究比较热门的一类新型材料。磁性微球由于具有较大的比表面积，能够有效提高负载生物分子的效率；磁性微球多为液体状态，可与目标分子在均相中能更好的发生反应，可极大提高反应效率，并且磁性微球具有良好的生物相容性，被标记于磁性微球上的生物分子能很好的保持其原有的生物活性。将磁性微球与靶物质特异性地结合而形成具有磁响应性的复合物，此复合物可被磁场滞留，从而与样品中其他杂质分离。因此，磁性微球在医学及生物学检测、环境监测及食品安全检测等领域有着很好的应用前景。

[0004] 随着生物医学水平的不断提高，人们对体外诊断分析检测技术提出了更高，更新的要求，在实践中往往要求在同一条件下同时对多个指标进行快速检测，为满足这一需求，市场上出现了大量的联检产品和各种技术方法，如中国专利(CN 103675219A)所采用的方法为在同一试纸条上设置多个检测带，分别固定不同的抗体，从加样口加入待测样品液，当样品液依次流过检测带后，通过观察窗的颜色显示来判定结果。中国专利(CN 202974994U)采用的方法为在试剂卡内设置多个平行检测单元，和对应的多个加样槽，通过不同的加样槽加入等量的相同液体样品，通过观察窗的颜色显示来判定结果。这些产品多数采用胶体金免疫层析法，在一定程度上能实现多目标物同时检测，但这些方法试剂和样本消耗量大，信号相互干扰程度高，试剂交叉污染率高，检测的灵敏度和重复性低，检测范围有待进一步加宽。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明同时结合微流控技术和磁性微球技术提供了一种基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片，可在同一样本的一次检测过程中同时对多个指标进行快速测定，操作简单，检测成本低，交叉污染率低，准确度高。

[0006] 本发明的技术问题所采用的技术方案如下：

[0007] 一种基于磁微粒化学发光的多目标分析物定量检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片为双层结构，包括盖片1和底片11，其中盖片1上的气泵3、气流微通道5、加样孔2、样本液流通道6、第一生物标记物存储池4、微混合器7以及过渡区10依次连接；底片11上的过滤器12、反应室13、清洗区14、检测室15、溶液释放通道18依次连接，检测室15通过溶液释放通道18分别与清洗液存储池16，发光液存储池17连接；所述第一生物标记物存储池4存储预封装酶标记的不同配体的溶液或发光剂标记的不同配体的溶液，所述反应室13包被预封装不同磁颗粒标记的不同配体，所述磁颗粒标记的不同配体使用的磁颗粒按照表面积与内部磁含量的平均比值的不同将磁颗粒进行编码，划分成不同的磁颗粒组，并对各组给出相应的编号；所述盖片1和底片11用胶带20和22密封。

[0008] 具体地，本发明所述微流控芯片的第一生物标记物存储池4、清洗液存储池16和发光液存储池17为液囊或试剂槽，可通过刺穿或按压方式释放存储池内液体试剂，体积为5～500μL；优选体积为5～300μL；进一步优选体积为10～250μL。

[0009] 具体地，所述微流控芯片的微混合器是宽度为20～300μm，深度为10～100μm的蛇形，折线形或方形结构。

[0010] 优选地，微混合器是一个宽度为50～200μm，深度为20～100μm的方波形结构。

[0011] 具体地，本发明所述微流控芯片的过滤器由一个腔体和滤血膜组成，具有的功能包括：滤过血细胞和杂质，传递液体样本至下一腔室。

[0012] 具体地，所述微流控芯片的过滤器滤血膜材料为玻璃纤维，聚醚砜树脂。

[0013] 优选地，微流控芯片的过滤器滤血膜材料为玻璃纤维。

[0014] 具体地，所述微流控芯片的反应室为毛细管微通道，该毛细管微通道为管状通道或矩形通道，允许微液体流进或通过。所述毛细管微通道为管状通道时直径为0.5～10mm；

[0015] 优选地，毛细管微通道为管状通道时直径为5mm，进一步优选2mm或1mm。

[0016] 具体地，所述毛细管微通道为矩形通道时尺寸范围：宽为0.1～5mm，深度为0.01～2mm，长为5～40mm。优选地，毛细管微通道为矩形通道时尺寸范围：宽为0.3～2mm，深度为
0.2～1mm，长为5～20mm。

[0017] 具体地，本发明所述微流控芯片的进样通道的长度为3～10mm，深度为10～200μm。

[0018] 优选地，进样通道长度为5mm，深度为150μm。

[0019] 具体地，本发明所述磁颗粒组的编码方法包括将具有相同表面积，但内部磁含量不同的一类磁颗粒进行组合，分别编码为不同磁颗粒组；或将表面积不同，而磁含量相同的一类磁颗粒进行组合，分别编码为不同磁颗粒组；或表面积和磁含量均不同的一类磁颗粒进行组合；

[0020] 具体地，所述磁颗粒组编码所用磁颗粒为顺磁性核壳结构，其中磁颗粒的磁核为Fe3O4或γ-Fe2O3的化合物，外壳为聚苯乙烯化合物，且磁颗粒表面经过修饰带有功能化基团，如-COOH、-COH、-NH2等，或其他生物分子，如生物素，链霉亲和素等，磁颗粒粒径为0.1～10μm；所述酶标记配体使用的酶包含过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸(ALP)，所述发光剂标记配体使用的发光剂包含吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺及其衍生物和金刚烷等。

[0021] 优选地，所述磁颗粒为顺磁性的Fe3O4磁颗粒，且磁颗粒粒径为0.2～10μm。

[0022] 更优选地，所述磁颗粒粒径为颗粒尺寸为0.5μm～6μm。

[0023] 本发明所述微流控芯片的制备主要包括如下步骤：

[0024] 步骤1)磁颗粒的编码，根据磁颗粒表面积与内部磁含量的平均比值的不同将磁颗粒进行编码，划分成不同的磁颗粒组，并对各组给出相应的编号；

[0025] 步骤2)配体的标记，酶或发光剂标记可与目标分析物结合或竞争的一种配体，形成标记配体，磁颗粒标记可与目标分析物结合或竞争的另一种配体，同组磁颗粒标记同种配体，不同组磁颗粒标记不同配体，形成磁颗粒标记配体，所述两种用于标记的配体可相同或不同；

[0026] 步骤3)内部主要试剂的封存，将酶标记的不同配体的溶液或发光剂标记的不同配体的溶液放入盖片的第一生物标记物存储池中，密封，将磁颗粒标记的不同配体溶液加入底片的反应室中，干燥，固化，将一定体积的清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光液存储池中，密封。

[0027] 步骤4)微流控芯片的组装，分别组装盖片和底片的其他部件，用胶带20和22密封半成品盖片和底片组装形成一张完整的微流控芯片。

[0028] 本发明中所述微流控芯片加工成型方法包含但不限定于模具注塑法、模具热压法、激光刻蚀法和软光刻蚀法等，优选模具注塑法，本发明的实施例中所用微流控芯片均为通过模具注塑法加工制备，该方法制备的微流控芯片结构稳定，精密度高，成本低。

[0029] 本发明所述微流控芯片的反应室内部需进行一定的表面改性处理，所述表面改性处理方法可为化学反应，表面涂层，等离子处理等，从而获得良好的亲水性，促使液体样本自发流动，快速填充微通道，复溶固化的磁颗粒。

[0030] 本发明中所述磁含量指的是磁颗粒内部所含磁性材料的质量百分比。

[0031] 本发明中所述磁颗粒的磁含量决定了磁颗粒在外部磁场作用下的磁力大小，在表面积相同时，磁含量大的磁颗粒所具有的磁力强，在溶液中移动的距离大。

[0032] 本发明中所述磁颗粒表面积大小直接影响磁颗粒在液体环境中的粘滞阻力。磁颗粒的表面积越大所具有的粘滞阻力就越大，其他条件均相同时，在磁铁作用一定时间后，表面积大的磁颗粒在溶液中移动的距离比表面积小的磁颗粒小。

[0033] 本发明中所述磁颗粒组编码的重要依据是磁颗粒表面积与磁含量的平均比值这一重要参数，同一磁颗粒组是具有相同表面积与磁含量的平均比值的一类磁颗粒的集合，不同磁颗粒组之间表面积与磁含量的平均比值差异较大。在本发明的一个实施例中磁颗粒组的设计方法为不同磁颗粒组的磁颗粒表面积均相同，只是各组间磁含量不同，因为在粒径尺寸均匀的液相中能很好地混合均匀。

[0034] 本发明中所述磁颗粒组的设计综合了影响磁颗粒运动速度的两个因素，引进磁微粒表面积与磁含量的平均比值这一参数，共同影响磁颗粒在微流体通道中运动的速度和移动距离。在外部磁铁作用下，包含多目标分析物的混合磁颗粒移动至检测室，由于各磁颗粒组的磁颗粒运动速度不同，相同时间内所发生的位移不同，一段时间后，混合磁颗粒同组内发生聚集，各组间逐步发生组间分离，最终不同目标物所对应的磁颗粒沉降为不同的物质群，分布在检测室底部不同位置。

[0035] 本发明中所述酶，包含但不限定于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图2所示混合均匀后注入一个发光液存储池17；但当混合液保质期少于1年时应分开，如图4所示分别注入发光液存储池17和发光液存储池24，通过预混合通道23混合均匀。

[0036] 本发明所述微流控芯片的组装，盖片和底片通过密封胶带进行黏合，密封胶带可为普通双面胶，热敏胶和压敏胶等，作为优选密封胶带为热敏胶或压敏胶。

[0037] 本发明还涉及一种应用所述微流控芯片进行同一样本中多目标物定量检测的方法，具体操作如下：

[0038] 步骤1)从加样孔加入样本，盖上血液盖，将微流控芯片放入配套仪器中，系统释放酶标抗体，然后按压气泵使样本和酶标抗体混合均匀且发生化学反应，形成一种免疫复合物，然后流入底片过滤器中；

[0039] 步骤2)样本经过滤器后，到达反应室，复溶固化的磁标抗体，外部磁铁以一定的速度相对于反应室位置发生运动，搅拌液体混合物，使它们充分发生反应，反应结束磁铁收集磁颗粒并移动至清洗区，系统释放清洗液，磁颗粒经充分洗涤，除去未参与反应的液体试剂和其他杂质；

[0040] 步骤3)在磁铁作用下磁颗粒运动至检测室，系统释放发光基底液，移走磁铁，磁颗粒复合物按照一定的顺序先后释放，并沉降在检测室底部不同位置，采用光探测器以一定的方式采集发光信号，并以一定方式输出检测结果，从而实现同一样品中多目标分析物的定量检测。

[0041] 具体地，步骤1)所述配套仪器主要包括磁铁装置和检测装置，磁铁装置对微流控芯片所施加的主要作用包括混合磁颗粒复合物，收集磁颗粒，洗涤二级反应混合物，在某一方向发生相对运动。

[0042] 具体地，步骤2)所述磁铁的运动方式包括：匀速直线运动或加速运动，或两种运动方式的交替，运动的速度为0.5mm/s～50mm/s。

[0043] 优选地，磁铁运动为匀速直线运动，磁铁的运动速度为1mm/s～50mm/s，更优选磁铁的运动速度为4mm/s～20mm/s。

[0044] 具体地，步骤3)所述磁颗粒的释放顺序为在外磁场的影响下根据运动速度的快慢先后沉降在检测室底部的不同位置，且速度大的磁性微粒组首先发生沉降；步骤3)所述发光信号的采集主要是一定的方式排列光学探测器，检测到的发光信号至少为双峰。

[0045] 本发明的核心技术是将磁微粒技术、化学发光免疫检测技术和微流控芯片技术三者相结合，并非简单叠加磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术，磁颗粒大小的设定，各通道形状、大小等参数的细微改变都会导致分析结果准确度降低。本发明通过液体密封设计、沟道设计，气孔设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，配合小型便携设备，以外部磁铁作为液体流动的主动驱动力，有效地实现了液体样本在微流控芯片内部的智能控制，通过设计不同免疫化的磁微粒组，有效地在单通道内实现了磁微粒组的组间分离，从而实现同一样本中多目标分析物的准确、快速检测。

附图说明

[0046] 图1是本发明所述微流控芯片的盖片结构示意图，其中2为样本加样孔，3为气泵，4为第一生物标记物存储池，5为气流通道，6为样本液流通道，7为微混合器。

[0047] 图2是本发明所述微流控芯片的底片结构示意图，其中12为过滤器，13为反应室，14为清洗区，15为检测室，16为清洗液存储池，17为发光液存储池，18为溶液释放通道，19为废液回收池。

[0048] 图3是本发明所述微流控芯片的整体结构示意图，其中1为盖片，11为底片，20和22为胶带。

[0049] 图4是三个液体存储池的底片结构示意图，其中16为清洗液存储池，17和24为发光液存储池，18为清洗液释放通道，23为发光液释放通道。

[0050] 图5是多目标物分析检测原理示意图。

具体实施方式

[0051] 本发明公开了一种基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片，在体外诊断和生物传感器领域具有广泛的应用前景。本领域的技术人员可参考本方法，用于实际物质分析中。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0052] 实施例1.肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)联合检测[0053] 方法一

[0054] 采用本发明所述的方法进行心梗三项，即肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的同时检测。要完成该项目测试，具体步骤如下：

[0055] 1.磁颗粒组的编码

[0056] 选择粒径尺寸均为2.0μm，磁含量分别为0.5％，5％，30％的三种磁颗粒，分别标号1、2、3，分别对应用于cTnI、Myo、CK-MB的检测。

[0057] 2.抗体标记：.

[0058] 1)酶标抗体：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，配成浓度为5mg/ml HRP溶液，向该溶液中加入0.2ml新配制的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将溶液装入透析袋中，用1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，于4℃过夜；加20μl 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛基化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.3mg cTnI抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，于4℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH 7.4PBS透析1小时；回收透析液，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，于4℃放置1小时；3000rpm离心30分钟，弃上清液；沉淀物用50％饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用
0.15M pH 7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后，10，000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为HRP-抗体结合物，分装后，冷冻保存。Myo和CK-MB标记方法与此相同。

[0059] 2)磁标抗体：向1ml 10mM pH 7.4磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒、30μg EDC和15μg NHS溶液和10μg抗cTnI单抗(与HRP标记所用的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4小时，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的抗cTnI单抗，得到磁颗粒标记cTnI抗体。Myo和CK-MB标记方法与此相同。

[0060] 3.微流控芯片的组装

[0061] 将HRP标记的cTnI、Myo、CK-MB抗体溶液按1∶4.5∶2的摩尔比例混合均匀放入盖片的第一生物标记物存储池(4)中，密封。将磁颗粒标记抗体溶液放入底片反应室(13)中，室温干燥30分钟以上。将发光基底液和清洗液分别注入清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)中，密封。按图3所示，用胶带将盖片和底片组装形成一个完整的微流控芯片，装入铝箔袋中，密封，于4℃保存。

[0062] 4.检测

[0063] 1)用正常人血清作稀释液，将肌钙蛋白I标准品配制系列浓度如下：0ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；

[0064] 用正常人血清作稀释液，将肌红蛋白标准品配制系列浓度如下：0、2.0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、2500ng/mL；

[0065] 用正常人血清作稀释液，将肌酸激酶同工酶标准品配制系列浓度如下：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

[0066] 将50μl样本滴入加样孔，盖上血液盖。将微流控芯片放入配套仪器中，仪器将对微流控芯片施加一系列操作，检测15分钟后仪器将会显示待测物浓度，每个样本分别测定3次，取平均值，绘制标准曲线。分别滴加不同分析物的标准品，即可获得各分析所物对应的标准曲线。

[0067] 将50μl全血样本摘入加样孔，15分钟内仪器检测系统检测化学发光信号，依据所获得标准曲线得到样本中cTnI，Myo，CK-MB三种物质的各自浓度。

[0068] 2)结果表明，肌钙蛋白I最低检测限可达到0.05ng/ml，肌红蛋白最低检测限为1ng/ml，肌酸激酶同工酶的最低检测限为0.2ng/ml，在定量检测范围内，相关系数R2＞
0.99，未出现HOOK效应，与各标志物单项检测结果相比偏差小于4.2％，且批内与批间重复性较好。

[0069] 实施例2.肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)联合检测[0070] 方法二

[0071] 采用本发明所述的方法进行心梗三项，即肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的同时检测。肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)。要完成该项目测试，具体通过以下步骤：

[0072] 1.磁颗粒组的编码

[0073] 选择磁含量均为10％，但磁颗粒粒径分别为0.5μm、2.0μm、5.0μm的三种磁颗粒，分别标号1、2、3，分别对应用于cTnI、Myo、CK-MB的检测。

[0074] 2.抗体标记：

[0075] 1)酶标抗体：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，配成浓度为5mg/ml HRP溶液，向该溶液中加入0.2ml新配制的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将溶液装入透析袋中，用1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，于4℃过夜；加20μl 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛基化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.3mg cTnI抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，于4℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH 7.4PBS透析1小时；回收透析液，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，于4℃放置1小时；3000rpm离心30分钟，弃上清液；沉淀物用50％饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，对
0.15M pH 7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为HRP-抗体结合物，分装后，冷冻保存。Myo和CK-MB标记方法与此相同。

[0076] 2)磁标抗体：向1ml 10mM pH7.4磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒、30μg EDC和15μg NHS溶液和10μg抗cTnI单抗(与HRP标记所用的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4小时，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的抗cTnI单抗，得到磁颗粒标记cTnI抗体。Myo和CK-MB标记方法与此相同。

[0077] 3.微流控芯片的组装

[0078] 将HRP标记的cTnI、Myo、CK-MB抗体溶液按1∶4.5∶2的摩尔比例混合均匀放入盖片的第一生物标记物存储池(4)中，密封。将磁颗粒标记抗体溶液放入底片检测室(13)中，室温干燥。将发光基底液和清洗液分别注入清洗液存储池16和发光基底液存储池17中，密封。按图3所示，用胶带将盖片和底片组装形成一个完整的微流控芯片，装入铝箔袋中，密封于4℃保存。

[0079] 4.检测

[0080] 1)用正常人血清作稀释液，将肌钙蛋白I标准品配制系列浓度如下：0ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；

[0081] 用正常人血清作稀释液，将肌红蛋白标准品配制系列浓度如下：0、2.0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、2500ng/mL；

[0082] 用正常人血清作稀释液，将肌酸激酶同工酶标准品配制系列浓度如下：0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

[0083] 将50μl样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器中，仪器将对微流控芯片施加一系列操作，检测15分钟后仪器将会显示待测物浓度，每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。分别滴加不同分析物的标准品，将获得各分析物对应的标准曲线。

[0084] 将50μl全血样本滴入加样孔，15min内仪器检测系统检测发光信号强度，依据所获得标准曲线得到样本中cTnI，Myo，CK-MB三种物质的各自浓度。

[0085] 2)结果表明，肌钙蛋白I最低检测限可达到0.1ng/ml，肌红蛋白最低检测限为5ng/ml，肌酸激酶同工酶的最低检测限为1ng/ml，在定量检测范围内，相关系数R2＞0.98，未出现HOOK效应。

[0086] 实施例3：磁微粒颗粒尺寸筛选

[0087] 磁性微球的粒径小，比表面积大，表面含有活性基团，故偶联容量大，但磁颗粒尺寸过小不利于磁铁收集，故进行磁微粒尺寸筛选。

[0088] 其他的实验条件参见实施例2，磁微粒颗粒含量均为10％，尺寸按照以下方案进行。

[0089] 选择颗粒尺寸分别为0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、10μm六种磁颗粒标分别单独记抗肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗体，对三种目标物进行单独测定。检测时采用磁性大小经过优选的永磁铁，固定磁铁高度和运动速度。

[0090] 三种目标物单独检测实验结果如下：

[0091] 检测到的光学信号按照磁微粒粒径尺寸从0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、6μm依次增强，10μm开始减小，信号值最低。

[0092] 结果分析：磁微粒尺寸较小时，比表面积较大，表面所负载的生物分子量大，同时能够很好地分散在溶液中，但要保证磁性微球充分被收集所需的磁场强度大。在本实施例中由于磁珠所受的磁场力不能保证其充分被收集，导致部分有效磁珠在清洗过程中流失，从而导致最终检测信号值不高。当磁颗粒粒径较大时，比表面积小，表面生物分子的标记率相对较低，相同条件下，磁性粒子所受磁场力大，分散的磁珠能够得到充分的收集，但其由于极易发生沉降，导致生物分子间反应不充分，从而减弱发光信号。综合考虑，粒径为0.5～6μm磁性微球效果最好。

[0093] 实施例4：不同磁微粒颗粒互不干扰尺寸的筛选

[0094] 磁颗粒在液体样本中磁颗粒的尺寸与液体流体学阻力关系密切，因此有必要考察几种不同尺寸的磁颗粒混合使用时，尺寸差异对各配体可以被准确的分离出来效果的影响，此时不出现混淆，多种目标分析物同时检测不会出现干扰。

[0095] 选用磁含量均为10％，但颗粒尺寸分别为0.5μm、1μm、2.5μm、2.7μm、3μm、5μm的6种磁颗粒分别标记肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)抗体，其他试验条件同实施例1或2，试验结果为：

[0096] 颗粒尺寸为0.5μm、1μm的两种目标物检测信号有部分重叠，分离度不是很理想，该重叠区可经过一定的修正作用加以消除相互干扰；而颗粒尺寸1μm和2.5μm的两种目标物信号无重叠区域，分离度较好，两种目标物检测出现少量干扰。而颗粒尺寸1μm和2.7μm的两种目标物信号无重叠区域，分离度最好，两种目标物检测不会出现干扰。颗粒尺寸为2.7μm、3μm的两种目标物检测信号有部分重叠，颗粒尺寸为3μm、5μm的两种目标物检测信号有部分重叠，该重叠区无法经过修正作用加以消除相互干扰。

[0097] 因此，从试验结果初步判断，在最优选的磁颗粒尺寸范围内，各颗粒尺寸大小比值为2.5-2.7时，可减少检测过程中各物质间的相互干扰，达到在同一样本中同时准确检测各目标分析物的含量。

[0098] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。