一种铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种铅离子可视化检测方法及检测试剂盒，试剂盒包括试纸条检测平台、缓冲体系、和核酸序列A、B、C、D。利用ABCD依次部分互补，以及A具有铅离子特异性识别元件的特性，用A-B杂合双链与铅离子识别，A与铅离子形成G四聚体结构，将A解离下来；进而利用置换出来的B链滴于试纸条的样品垫上进行检测，B通过继续与C的结合，形成检测区肉眼可见的条带。本发明无需使用传统的8-17 DNAzyme，无需合成RNA及使用抗体；检测结果直接肉眼可见；操作简单，成本低廉，适于单位推广使用。本发明方法对铅的检测限为1 nM，低于美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量72 nM。

权利要求

1.一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其特征在于：核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中序列A：具有a 区域和 b 区域，a 和b 区域共同构成铅离子特异性识别元件，与铅离子识别后可形成 G 四聚体结构；

序列B：具有a*区域、c 区域和b*区域，其中B的 a*区域和 b*区域分别与A 的a区域和b区域互补，B的c区域位于a*区域和b*区域的中间，凸起，不与A互补；B的一端修饰有特异性亲和小分子物质；

序列C：具有a区域和c*区域，其中C 的a和c*区域分别与B的a*和c区域互补；C的一端用巯基修饰；

序列D：具有a*区域和c区域；D 的 a*和 c 区域分别与 C 的a 区域和 c*区域互补。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：核酸序列B的c区域含有 1-5 个碱基。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：核酸序列B中所述的特异性亲和小分子物质包括生物素、地高辛、Cy3。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试纸条检测平台的检测区固定的是能与特异性亲和小分子物质结合的配体或抗体；质控区固定的是核酸序列D。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：缓冲体系不与铅离子反应生成沉淀。

6.一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其特征在于：核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中核酸序列A：5'-GGGTGGGT-GGGTGGGT-3'；

核酸序列B：5'-biotin-AAAAAA-ACCCACCC-TAT-ACCCACCC-3'；

核酸序列C：5'-SH-AAAAAA-GGGTGGGT-ATA-3'；

核酸序列D：5'-biotin-AAAAAA-TAT-ACCCACCC-3'。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：核酸序列C固定在金纳米颗粒上，并喷射在试纸条检测平台的金标垫上。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：试纸条检测平台的检测区固定的是链霉亲和素；质控区固定的是链霉亲和素-核酸D。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：缓冲体系是10 mM Tris-Ac缓冲液，pH=

8.0。

10.一种铅离子可视化检测方法，其特征在于，利用权利要求1-9所述任一项的试剂盒来进行铅离子检测。

说明书

一种铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于环境分析化学领域，涉及一种铅离子检测方法及检测试剂盒。

背景技术

[0002] 铅离子对人体危害严重，是环境监测的重要指标。其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量不得超过 72 nM。目前，环境中痕量铅离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电化学方法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用对铅离子敏感的核酸酶(8-17DNAzyme)作为识别元件来检测铅离子的方法备受关注(D. Mazumdar, J. Liu, G.Lu, J. Zhou and Y. Lu, Chem. Commun., 2010, 46, 1416-1418)。 但是潜在的缺点需要合成含有 RNA 的 DNA 来检测，稳定性差，成本较高。因此，迫切需要选择一种新型的铅离子识别元件，无需涉及 RNA 的合成。

[0003] 据报道，有一种 DNA 核酸能与铅离子特异识别 （T. Li, S. Dong and E. Wang,J. Am. Chem.Soc., 2010, 132, 13156-13157），该 DNA 序列与铅离子具有很强的亲和力，可折叠成 G 四聚体。如果将该核酸 DNA 作为铅离子识别元件，开发一种操作简单、成本低廉、可快速检测在环境中铅离子的可视化检测方法以及检测试剂盒具有重要意义。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种可视化铅离子检测方法及检测试剂盒。

[0005] 本发明所采取的技术方案是：

[0006] 一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中

[0007] 序列A：具有a 区域和 b 区域，a 和b 区域共同构成铅离子特异性识别元件，与铅离子识别后可形成 G 四聚体结构；

[0008] 序列B：具有a*区域、c 区域和b*区域，其中B的 a*区域和 b*区域分别与A 的a区域和b区域互补，B的c区域位于a*区域和b*区域的中间，凸起，不与A互补；B的一端修饰有特异性亲和小分子物质；

[0009] 序列C：具有a区域和c*区域，其中C 的a和c*区域分别与B的a*和c区域互补；C的一端用巯基修饰；

[0010] 序列D：具有a*区域和c区域；D 的 a*和 c 区域分别与 C 的a 区域和 c*区域互补。

[0011] 优选的，核酸序列B的c区域含有 1-5 个碱基。

[0012] 优选的，核酸序列B中所述的特异性亲和小分子物质包括生物素、地高辛、Cy3。

[0013] 优选的，试纸条检测平台的检测区固定的是能与小分子物质结合的配体或抗体；质控区固定的是核酸序列D。

[0014] 优选的，缓冲体系不与铅离子反应生成沉淀。

[0015] 一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中

[0016] 核酸序列A：5'-GGGTGGGT（a）GGGTGGGT（b）-3（'SEQ ID NO：1）；

[0017] 核酸序列B：5'-biotin-AAAAAA-ACCCACCC（b*）TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（' SEQ ID NO：2）；

[0018] 核酸序列C：5'-SH-AAAAAA-GGGTGGGT（a）ATA（c*）-3（'SEQ ID NO：3）；

[0019] 核酸序列D：5'-biotin-AAAAAA-TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（'SEQ ID NO：4）。

[0020] 优选的，核酸序列C固定在金纳米颗粒上，并喷射在试纸条检测平台的金标垫上。

[0021] 优选的，试纸条检测平台的检测区固定的是链霉亲和素；质控区固定的是链霉亲和素-生物素-核酸D。

[0022] 优选的，缓冲体系是10 mM Tris-Ac缓冲液，pH=8.0。

[0023] 一种铅离子可视化检测方法，利用上述所述任一项的试剂盒来进行铅离子检测。

[0024] 本发明的有益效果是：

[0025] （1） 铅离子识别元件是普通的 DNA 序列，无需使用传统的 8-17 DNAzyme，无需涉及到合成 RNA，也无需使用抗体。

[0026] （2） 检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器即可获得使用数据。

[0027] （3） 操作简单，成本低廉，适于单位推广使用。

[0028] （4）本发明方法对铅的检测限为1 nM，低于美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量72 nM，检测灵敏度高，选择性好。

附图说明

[0029] 图 1 为本发明所述的检测方法的原理图；

[0030] 图 2 为对不同浓度的 Pb2+检测的结果图；

[0031] 图 3 为特异性实验结果图。

具体实施方式

[0032] 一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中

[0033] 序列A：具有a 区域和 b 区域，a 和b 区域共同构成铅离子特异性识别元件，与铅离子识别后可形成 G 四聚体结构；

[0034] 序列B：具有a*区域、c 区域和b*区域，其中B的 a*区域和 b*区域分别与A 的a区域和b区域互补，B的c区域位于a*区域和b*区域的中间，凸起，不与A互补；B的一端修饰有特异性亲和小分子物质；

[0035] 序列C：具有a区域和c*区域，其中C 的a和c*区域分别与B的a*和c区域互补；C的一端用巯基修饰；

[0036] 序列D：具有a*区域和c区域；D 的 a*和 c 区域分别与 C 的a 区域和 c*区域互补。

[0037] 优选的，核酸序列B的c区域含有 1-5 个碱基。

[0038] 更优选的，核酸序列B的c区域含有3个碱基。

[0039] 优选的，核酸序列B中所述的特异性亲和小分子物质包括生物素、地高辛、Cy3。

[0040] 优选的，核酸序列B通过连接臂与特异性亲和小分子连接，序列C通过连接臂与巯基连接。

[0041] 优选的，连接臂为多个A的碱基序列，其碱基数为3-12个。

[0042] 更优选的，连接臂为6个A的碱基序列。

[0043] 优选的，试纸条检测平台的检测区固定的是能与小分子物质结合的配体或抗体；质控区固定的是核酸序列D。

[0044] 优选的，质控区固定核酸序列D的方法为将核酸序列D喷射在试纸条的质控区后在紫外线下交联5分钟；或者将核酸序列D的一端用生物素修饰，质控区利用链霉亲和素将生物素修饰的核酸D固定。

[0045] 优选的，缓冲体系不与铅离子反应生成沉淀。

[0046] 一种铅离子可视化检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系和试纸条检测平台，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成；其中

[0047] 核酸序列A：5'-GGGTGGGT（a）GGGTGGGT（b）-3（'SEQ ID NO：1）；

[0048] 核酸序列B：5'-biotin-AAAAAA-ACCCACCC（b*）TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（' SEQ ID NO：2）；

[0049] 核酸序列C：5'-SH-AAAAAA-GGGTGGGT（a）ATA（c*）-3（'SEQ ID NO：3）；

[0050] 核酸序列D：5'-biotin-AAAAAA-TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（'SEQ ID NO：4）。

[0051] 优选的，核酸序列C固定在金纳米颗粒上，并喷射在试纸条检测平台的金标垫上。

[0052] 优选的，试纸条检测平台的检测区固定的是链霉亲和素；质控区固定的是链霉亲和素-生物素-核酸D。

[0053] 优选的，质控区固定核酸序列D的方法为将核酸序列D喷射在试纸条的质控区后在紫外线下交联5分钟；或者将核酸序列D的一端用生物素修饰，质控区利用链霉亲和素将生物素修饰的核酸D固定。

[0054] 优选的，缓冲体系是10 mM Tris-Ac缓冲液，pH=8.0。

[0055] 一种铅离子可视化检测方法，利用上述任一项的试剂盒来进行铅离子检测。

[0056] 下面结合附图(见图1)，进一步说明本发明的检测原理：

[0057] 一种铅离子可视化检测方法，包括以下步骤（：图1所示）

[0058] （1）核酸A与铅离子（Pb2+）具有高亲和力，能形成G四聚体。A先与B杂交，B的一端修饰生物素（biotin）。当有Pb2+存在时，A与Pb2+识别并相互作用，形成G四聚体，从而A从B上解离下来。置换出来的B链滴于试纸条的样品垫上进行检测。

[0059] （2）试纸条检测平台包含4个部分：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上。核酸C的一端用巯基(-SH)修饰，固定在金纳米颗粒(AuNPs)上，并喷射在金标垫上。硝酸纤维素膜上划有两个检测区域：检测区和质控区，其中检测区固定的是链霉亲和素(SA)；质控区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-核酸D。

[0060] （3）置换出来的B链滴于试纸条的样品垫后，通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，与C结合，继续向前移动，B-C复合物会被检测区的SA捕获（通过SA-biotin相互作用），在检测区聚集，聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的金纳米颗粒修饰的C会向前移动，与固定在质控区的D杂交，在质控区聚集，聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。当有Pb2+存在时，试纸条的检测区和质控区都会出现红色，而且检测区红色线条颜色的深浅与 Pb2+浓度呈正相关；而没有Pb2+存在时，只有质控区出现红色，而检测区没有红色。

[0061] 下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案，但不限于此。

[0062] 实施例 1

[0063] 一种铅离子可视化检测剂盒包括以下成分：

[0064] （1）核酸序列 A、B、C、D；A 一端修饰生物素（biotin）；C 的一端修饰巯基（-SH）；D 一端修饰生物素（biotin）。具体序列如下：

[0065] 核酸序列A：5'-GGGTGGGT（a）GGGTGGGT（b）-3（'SEQ ID NO：1）；

[0066] 核酸序列B：5'-biotin-AAAAAA-ACCCACCC（b*）TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（' SEQ ID NO：2）；

[0067] 核酸序列C：5'-SH-AAAAAA-GGGTGGGT（a）ATA（c*）-3（'SEQ ID NO：3）；

[0068] 核酸序列D：5'-biotin-AAAAAA-TAT（c）ACCCACCC（a*）-3（'SEQ ID NO：4）。

[0069] （2）铅离子标准溶液。

[0070] （3）试纸条检测平台：包含样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上。C 修饰金纳米颗粒，喷在金标垫上，硝酸纤维素膜的检测区固定的是链霉亲和素（SA）；质控区固定的是 SA-biotin-D；试纸条用密封袋密封。

[0071] （4）10 mM Tris-Ac 缓冲液（pH=8.0）。

[0072] 铅离子可视化检测方法，按照如下步骤进行：

[0073] (1) 500 nM 的 A 和 500 nM 的 B 用 10 mM Tris-Ac 缓冲液（pH=8.0）溶解，室温充分混匀，反应 30 分钟，形成 A-B 双链。

[0074] (2) 加入不同浓度的铅离子标准溶液，室温反应 45 分钟，然后将反应液滴加于试纸条的样品垫中，进行检测。

[0075] (3) 在试纸条流动 10 分钟后，直接用肉眼观察检测区和质控区是否出现红色线条，从而判断体系是否存在 Pb2+，其中检测区红色线条颜色的深浅与 Pb2+浓度呈正相关。

[0076] 对不同浓度铅离子的检测：

[0077] 配制铅离子标准溶液，浓度分别为 1 nM，10 nM，100 nM，500 nM 和 1μM，室温保存。将不同浓度的铅离子溶液分别加到实施例 1 中所述的反应体系中，充分反应后，将反应液（100 μL）滴加到试纸条的样品垫上，室温检测，10 分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。

[0078] 从图 2 的检测结果可以看出，1 nM 铅离子存在时，可在试纸条的检测区观察到明显的红色区域，其检测限为 1 nM，低于美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量 72 nM。并且，随着铅离子浓度的增加(从 1 nM 到 500 nM)，检测区的颜色也逐渐增加。当铅离子浓度超过 500 nM 时，颜色变化趋于饱和。同时，质控区在各种情况下都呈红色，说明试纸条体系运行正常，结果可信。

[0079] 特异性实验:

[0080] 配制 1 μM 不同离子的标准溶液， 它们分别是 Hg2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Ag+和 Cd2+。

[0081] 将 1 μM 不同的离子标准溶液和 100 nM 铅离子标准溶液分别加到实施例 1中所述的反应体系中，充分反应后，将反应液（100 μL）滴加到试纸条检测平台的样品垫上，室温检测，10 分钟后观察试纸条的检测区和质控区的颜色变化。

[0082] 从图 3 的检测结果可以看出，1 μM 的 Hg2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Ag+和 Cd2+对检测没有影响，试纸条的检测区没有出现红色区域；只有当加入铅离子后才会在试纸条的检测区出现红色区域。 这证明该方法对铅离子的检测具有很好的特异性。