参比材料中不稳定分析物的稳定化

摘要

本发明提供了包含稳定分析物和冻干不稳定分析物的试验对照材料，及其制备和使用方法。本发明提供了用于临床实验室的稳定多分析物质量对照材料。本发明所述的多分析物对照材料解决了不稳定对照溶液的问题，并且在使用时可快速并容易地制备，并可满足实验室关于分析物稳定性的质量需求。

权利要求

1.一种多分析物对照试剂盒，所述试剂盒包含

容纳冻干的至少一种不稳定对照分析物的第一容器，其中所述至少一种不稳定对照分析物包括肌酸酐；和在基础基质溶液中容纳至少一种稳定对照分析物的第二容器，所述基础基质溶液来自已经去除了所述不稳定对照分析物的生物样品，其中所述基础基质溶液是尿液，所述稳定对照分析物选自：钙、氯化物、葡萄糖、镁、磷、蛋白质、钠、尿素氮和尿酸。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白质选自淀粉酶、hCG、和微白蛋白。

3.如权利要求1所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述不稳定对照分析物以珠的形式冻干。

4.如权利要求1所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述基础基质溶液包含至少一种选自下组的组分：蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂。

5.如权利要求4所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述抗氧化剂是抗氧化酶。

6.如权利要求1-4中任一项所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含至少一个其它容器，其容纳与所述第一容器中浓度不同的所述至少一种不稳定对照分析物，以及至少一个其它容器，其容纳与所述第二容器中浓度不同的所述至少一种稳定对照分析物。

7.如权利要求1-4中任一项所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述容器选自：样品管、安瓿和瓶。

8.一种组装权利要求1所述的多分析物对照试剂盒的方法，所述方法包括在所述第一容器中对所述不稳定对照分析物进行冻干；和

向所述第二容器中加入所述多分析物对照试剂盒中的稳定对照分析物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述不稳定对照分析物以珠的形式冻干。

10.如权利要求8-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述容器选自：样品管、安瓿和瓶。

11.一种制备用于测试的权利要求1所述的多分析物对照试剂盒的方法，所述方法包括重悬冻干形式的所述不稳定对照分析物，并且将所述不稳定对照分析物与溶液中的所述稳定对照分析物合并。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述重悬和合并步骤是同时的。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述重悬和合并步骤是分开的。

14.如权利要求11或13中任一项所述的方法，其特征在于，向基础基质溶液中加入所述不稳定对照分析物和稳定对照分析物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述基础基质溶液包含至少一种选自下组的组分：蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂是抗氧化酶。

17.一种多分析物对照试剂盒，所述试剂盒包含

容纳以珠形式冻干的不稳定对照分析物肌酸酐的容器(1)；和容纳于尿液溶液的至少一种稳定对照分析物的容器(2)，所述尿液溶液的至少一种稳定对照分析物选自：钙、氯化物、葡萄糖、镁、磷、蛋白质、钠、尿素氮和尿酸，所述尿液溶液中已经去除了所述不稳定对照分析物肌酸酐。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白质选自淀粉酶、hCG、和微白蛋白。

19.如权利要求17所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含容纳以珠形式冻干的肌酸酐的容器(3)，其中容器(1)和(3)中肌酸酐的量不同。

20.如权利要求17或19所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含在溶液中容纳所述至少一种稳定对照分析物的容器(4)，其中，容器(2)和(4)中所述至少一种稳定对照分析物的浓度不同。

21.如权利要求19所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含容纳以珠形式冻干的肌酸酐的容器(5)，其中容器(1)和容器(3)中肌酸酐的量与容器(5)中肌酸酐的量不同。

22.如权利要求20所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含在溶液中容纳所述至少一种稳定对照分析物的容器(6)，其中，容器(2)和容器(4)中所述至少一种稳定对照分析物的浓度与容器(6)中所述至少一种稳定对照分析物的量不同。

23.如权利要求17所述的多分析物对照试剂盒，其特征在于，所述容器选自：样品管、安瓿和瓶。

24.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述基础基质溶液是经处理的尿液。

25.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种稳定对照分析物还包括以下的一种或多种：酮类、亚硝酸盐、和尿胆素原。

26.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述基础基质溶液包括PEG、HAS、BSA、人血红蛋白、蛋白酶抑制剂、螯合剂、抗氧化剂、冷冻保护剂、表面活性剂或抗生物剂。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，所述抗氧化剂是抗氧化酶。

说明书

参比材料中不稳定分析物的稳定化

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请要求于2013年5月6日提交的美国临时申请号61/819,758的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。

背景技术

[0003] 在临床诊断实验室中常规使用市售的质量对照材料以监测人工和自动化临床测试方法和过程的精密度和准确度。然而，由于对照中生物标记物/分析物的化学和物理性质(分子量、溶解性、反应性、稳定性、来自其它分析物的相互干扰等)的差异，开发多分析物和多级质量对照材料是非常复杂的。

[0004] 多分析物和多级质量对照材料通常具有对至少一种分析物的稳定性和性能限制，因为可能改善一种分析物稳定性的条件可能对于另一种分析物的稳定性是有害的。例如，
朗道多项液体化学(Randox Liquid Chemistry Premium Plus)具有对总胆红素和直接型
胆红素的性能限制，并且说明手册表示总胆红素和直接型胆红素值在产品保存期间逐渐减
少。另外， Chem 液体不定值化学对照(Liquid Unassayed Chemistry 
Control)(热科学公司(Thermo Scientific))的说明显示胆红素可能在产品保存期间减少
并且磷、水杨酸酯和甘油三酯可能在产品保存期间增加。

[0005] 市售的尿液化学质量对照可能缺陷在于肌酸酐的弱稳定性。这种生物标记物是市售尿液化学对照中的重要临床分析物，因为其用于评价肾功能。具有肌酸酐弱稳定性的尿
液化学质量对照的示例是 Urichem (热科学公司)。这种质量对照的使用说
明显示肌酸酐值可能在产品保存期间减少。

发明内容

[0006] 本文提供了用于监测临床实验室中各种诊断测试方法的性能的稳定多分析物质量对照材料。本文所述的多分析物对照材料解决了不稳定对照溶液的问题，可在使用时快
速便捷地制备，并且可满足实验室对分析物稳定性的质量对照要求。除了满足对质量对照
材料的稳定性要求以外，本文所述的材料满足其它要求，如通过使用人基础基质，以相同的方式响应患者样品中发现的相同分析方差。

[0007] 提供了多分析物对照试剂盒，该试剂盒包含：容纳至少一种不稳定对照分析物的第一容器(例如，管、安瓿瓶或药瓶)，其中通过例如干燥或冻干来使该至少一种不稳定对照分析物稳定化。在一些实施方式中，第一容器容纳稳定化形式的2、3、4或5种不稳定分析物。
在一些实施方式中，第一容器包含超过一种例如稳定或不稳定的分析物，并且该分析物全
部都是稳定化性质，例如，干燥的或冻干的。在一些实施方式中，第一容器容纳至少2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、1-5、3-10、10-15、10-20或更多种稳定化形式的分析物。在一些实施方式中，该至少一种不稳定分析物以珠(例如，微珠或微球)的形式冻干。在一些实施方式
中，珠的直径为1-15mm。在一些实施方式中，该至少一种不稳定分析物选自：肌酸酐、胆红素、水杨酸酯、甘油三酯、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、高密度脂蛋白、拟胆碱酯酶、叶酸和高半胱氨酸。

[0008] 在一些实施方式中，试剂盒还包含容纳至少一种稳定对照分析物的第二容器。在一些实施方式中，至少一种稳定分析物在溶液中。在一些实施方式中，该溶液是衍生自生物样品的基础基质溶液，例如，经处理的尿液、血浆、血清、唾液、滑液、淋巴、乳、粘液、CSF、细胞裂解液或组织培养上清。在一些实施方式中，至少一种稳定分析物选自：淀粉酶、钙、氯化物、葡萄糖、hCG、镁、微白蛋白、磷、蛋白质、钠、尿素氮和尿酸。在一些实施方式中，至少一种稳定分析物在渗透压为50-1000mmol/kg(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、
550、600、650、700、750、800、850、900、950、200-800、250-750、400-600等)的溶液中。在一些实施方式中，至少一种稳定分析物在pH 4-9(例如，约4-5、约5-6、约6-7、约7-8或约8-9)的溶液中。在一些实施方式中，基础基质溶液包含至少一种选自下组的组分：PEG、HAS、BSA、人血红蛋白、蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂(或抗氧化酶)、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂(例如，叠氮化钠、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和两性霉素B)。

[0009] 在一些实施方式中，试剂盒还包含容纳用于重悬第一容器中的至少一种不稳定分析物的溶液的第三容器。在一些实施方式中，第三容器容纳衍生自生物样品的基础基质溶
液。在一些实施方式中，溶液的渗透压为50-1000mmol/kg。在一些实施方式中，溶液的pH为
4-9。在一些实施方式中，基础基质溶液包含至少一种选自下组的组分：PEG、HAS、BSA、人血红蛋白、蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂(或抗氧化酶)、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂(例如，叠氮化钠、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和两性霉素B)。在一些实施方式中，多分析物对照试剂盒包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1-5、
3-10、10-15、10-20或更多种分析物。

[0010] 还提供了多级、多分析物对照试剂盒，该试剂盒包含第一组容器，其中第一组容器中的各容器容纳不同量的至少一种不稳定分析物，并且其中该至少一种不稳定分析物例如通过干燥或冻干稳定化。在一些实施方式中，该试剂盒还包含第二组容器，其中第二组容器中的各容器容纳不同量的至少一种稳定分析物。本领域技术人员会理解，通常对多级多分
析物对照进行设计使得所有给定水平的分析物处于相对较高的量，而所有另一水平的分析
物处于相对较低的量，等等，这取决于考虑多少种水平。在一些实施方式中，多级多分析物试剂盒是双水平或三水平试剂盒。在一些实施方式中，多级多分析物对照试剂盒包含至少
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1-5、3-10、10-15、10-20或更多种分析物。

[0011] 在一些实施方式中，多分析物对照试剂盒用于测试尿液化学、血清化学、糖尿病标记物、癌症标记物、免疫功能或心血管健康的试验。

[0012] 还提供了组装如上所述的多分析物对照试剂盒的方法，所述方法包括：(i)在多分析物对照试剂盒中选择至少一种不稳定分析物并在第一容器中使该至少一种不稳定分析
物稳定化(例如，干燥或冻干)和(ii)将多分析物试剂盒中的至少一种稳定分析物加入第二
容器中。在一些实施方式中，该至少一种不稳定对照分析物以珠的形式冻干。在一些实施方式中，至少一种稳定分析物在溶液中。在一些实施方式中，该至少一种不稳定对照分析物选自：肌酸酐、胆红素、水杨酸酯、甘油三酯、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、高密度脂蛋白、拟胆碱酯酶、叶酸和高半胱氨酸。

[0013] 还提供了用于制备用于试验中的如上所述的多分析物对照试剂盒的方法，所述方法包括：(i)重悬稳定化(干燥或冻干)形式的至少一种不稳定分析物和(ii)将该至少一种
不稳定分析物与溶液中的至少一种稳定分析物合并。在一些实施方式中，重悬和合并步骤
是同时的，例如，在包含至少一种稳定分析物的溶液中重悬至少一种不稳定分析物。在一些实施方式中，重悬和合并步骤是分开的，例如，在溶液中重悬至少一种不稳定分析物，然后与至少一种稳定分析物合并。在一些实施方式中，重悬溶液是基础基质溶液。在一些实施方式中，向基础基质溶液中加入至少一种不稳定分析物和至少一种稳定分析物。在一些实施
方式中，该基础基质溶液是生物样品或衍生自生物样品，例如，经处理的尿液、血浆、血清、唾液、淋巴、乳、粘液、CSF、细胞裂解液或组织培养上清。在一些实施方式中，溶液包含至少一种选自下组的组分：PEG、HAS、BSA、人血红蛋白、蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂(或抗氧化酶)、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂(例如，叠氮化钠、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和两性霉素B)。

[0014] 附图的简要说明

[0015] 图1.肌酸酐珠的珠与珠之间的差异(一式四份测试20个珠)。

[0016] 发明详述

[0017] A.引言

[0018] 本发明提供了解决多分析物对照产品内分析物的不同稳定性的组合物和方法。在标准即用溶液中提供已知保持稳定的分析物，而以稳定化，例如冻干形式提供在标准溶液
中较不稳定的那些分析物。该方法能够使例如临床测试机构得到更可靠的结果，并延长多
分析物对照的保存期。

[0019] B.定义

[0020] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL《( 分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任
何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

[0021] 术语“分析物”是指待检测或定量的物质。“多分析物”试验是指对超过一种分析物进行检测或定量的试验。类似地，多分析物对照可包含超过一种已知(控制)量的分析物。“多级”对照是指多种对照，各对照含有相同的分析物，而各对照中分析物的量不同。例如，双水平对照可具有两种分开的对照，一个具有低水平的所包含分析物而另一个具有高水平
的所包含分析物。三水平对照将具有3个分开的对照，例如，低水平、中等水平和高水平。

[0022] 术语“不稳定分析物”可定量定义或相对于旨在联用(例如在多分析物试剂盒中)的其它分析物来定义。不稳定分析物是在与稳定分析物相同的储存条件下在特定时间间隔
之后降解(可检测性降低)至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的分析物。在一些情况中，不稳定分析物是在溶液中室温下6个月后降解(可检测性降低)至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的分析物。在一些情况中，不稳定分析物是在溶液中4℃下6个月后降解(可检测性降低)至少0.5％、1％、2％、3％、
4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的分析物。在一些情况中，不稳定分析物是在相同条件下储存时以比旨在联用的其它分析物快至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍的速度降解的分析物。本领域技术人员会理解特定类别的分子可能落入该分类，这取决于储存条件。当储存于液体中时，潜在不稳定的分析物包括蛋白质(例如，酶、激素、肽)、有机分子、甚至随时间变得可检测性降低的元素。

[0023] 类似地，可定量或相对定义术语“稳定的分析物”。稳定性在“《体外诊断方法产物的稳定性评价；认证指南》(Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Method Products；Approved Guideline)”(临床和实验室标准文件EP25A)中定义为IVD产品随着时间维持其性能特性一致的能力。在一些情况中，稳定的分析物在推荐的储存条件下在显著比例的计划保存期之后(例如，在溶液中室温下6或12个月之后)没有可检测地降解。在一些情况中，稳定的分析物在溶液中4℃下6或12个月之后没有可检测地降解。在一些实施方式
中，稳定的分析物的降解比旨在联用的至少一种其它分析物的降解至少低1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍。

[0024] 本文所用的“基础基质溶液”是指用于携带用于检测的分析物的溶液。组合物中的基础基质溶液在化学上与待测试的临床样品(例如，尿液、血液、淋巴等)相似，包含相同组分中的至少一些，并且有相似的pH范围。通常，从基础基质溶液中去除会干扰分析物的检测的临床样品的组分，例如，高度内源性水平的分析物、待测试的其它分析物、纤维蛋白、或其它蛋白质或脂质组分。

[0025] 术语“标记”、“可检测部分”等术语是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如32P、3H)、高电子密度试剂、酶(如ELISA中常用的那些)、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋白质或其他实体，例如通过将放射性标签整合至与目标分析物特异性反应的肽或抗体中。可以采用本领域已知的用于使抗体偶联所述标记的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物结合技术》(Bioconjugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)。术语“标签”和与术语“标记”作为同义词使用，但是一般指基于亲和性的部分，例如，用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。

[0026] “带标记的”分子(例如，核酸、蛋白质或抗体)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记来检测是否存在该分子。

[0027] “对照”样品或值是指用作参比，通常是已知参比的样品，其用于与测试样品比较。例如，测试样品可取自测试条件，例如，在测试化合物存在下或稳定化条件下，并且与来自已知条件的样品比较，例如，在没有测试化合物或稳定化条件下(阴性对照)，或存在已知化合物或条件下(阳性对照)。对照也可代表从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术
人员会认识到可设计对照来评价任意数量的参数。例如，可设计对照来比较给定条件中的
信号强度，例如在稳定化(例如，冻干的)分析物存在下，在没有稳定化分析物的情况下(阴性对照)，或在存在已知稳定分析物的情况下(阳性对照)。本领域技术人员会理解可在给定的情况中评估对照，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。也可评估对照来确定数据
的显著性。例如，如果给定的参数在对照中是变化的，则不认为测试样品中的变化是显著
的。

[0028] C.稳定化组合物的配制

[0029] 稳定的分析物可储存在稳定化的组合物中，如干粉。可使用任意合适的方法完成对包含至少一种不稳定分析物的溶液的干燥，如本文所述的那些、冻干、冷冻干燥或流化床干燥。冻干一般包括将溶液添加到真空室中，或另外向溶液施加真空(参见，例如，美国专利号7588942、7354597和7073349)。在一些实施方式中，施加热或干燥气。冷冻干燥一般包括通过雾化喷嘴将溶液喷洒到冷气相如液氮中(参见，例如，美国专利号7007406，
Leuenberger(2002)J.Nano.Res.4:111)。例如，在美国专利号4624058，Sellers等
.J.Pharm.Sci.90:785和Frake等.(1997)Int J.Pharm.151:75中描述了流化床干燥。一旦
获得稳定化的干燥组分，其可储存于密封容器中以维持稳定性并避免水分或污染。

[0030] 在一些实施方式中，向微珠或微球中加入溶液中的不稳定分析物，该微珠或微球设计为容纳预定体积的液体。微球的溶液然后经过干燥。溶液中可有超过一种分析物，使得各微球容纳超过一种分析物。在一些实施方式中，以已知浓度加入各分析物，使得各微球容纳已知量的分析物。在一些实施方式中，用多个分析物浓度形成稳定化的组合物以得到多
级试剂盒，例如，用多个管，各自代表不同量的分析物。

[0031] D.溶液和组分

[0032] 本文提供了分析物的溶液或重悬稳定化(例如，干燥或冻干)的分析物的溶液。这类溶液通常pH受到控制，例如，用缓冲剂如PBS、Tris或HEPES，使得pH对溶液中的分析物没有过度的负面影响。这类溶液还可具有稳定化试剂，如PEG或HAS。溶液可具有添加剂，如蛋白酶抑制剂、螯合剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂(或抗氧化酶)、冷冻保护剂、表面活性剂和抗生物剂(例如，叠氮化钠、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和两性霉素B)。

[0033] 分析物的溶液可基于待测试的样品的组成和性质，例如生物样品如唾液、血清、血浆、淋巴、尿液、乳、粘液、CSF、细胞裂解液、组织培养上清等。例如，用于尿分析多分析物对照的溶液将基于尿液的组成以最小化混淆差异，如pH或盐浓度。在一些实施方式中，从合成或生物来源的纯化的组分中组合溶液以模拟生物样品(例如，含5％HAS的0.9％PBS或含150mg/dL纯化的牛胆固醇的50mM Tris缓冲剂)。在一些实施方式中，溶液衍生自生物样品
并经加工以去除会干扰与分析物的检测的组分，例如，待检测的分析物(例如，高度内源性的量)、纤维蛋白、外源性蛋白质、脂质、污染物或其它组分。加工可包括碳提取以去除内源性激素、热处理以降低蛋白酶活性、或硅藻土处理以减少脂质。

[0034] E.分析物和试验的类型

[0035] 本文提供了用于设计具有增加的稳定性的多分析物对照的组合物、试剂盒和方法。多分析物对照可与任意标准生物测定或试验形式联用。多分析物对照可用于比较和定
量生物样品的组分(例如，唾液、血清、血浆、淋巴、尿液、乳、粘液、CSF、细胞裂解液、组织培养上清)并监测试验性能。

[0036] 本文所述的多分析物对照可与任意多分析物试验联用。已经设计这类试验用于诊断或表征多种条件，例如用于肾和肝功能的尿分析、抗核抗体(ANA测试)、癌症(例如，膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌)、血脂障碍、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、糖尿病、心脏功能、免疫功能等。

[0037] 在一些实施方式中，多分析物对照用于多分析物尿液测试。在一些实施方式中，用于多分析物尿液测试的稳定对照分析物包括以下中的任意一种或多种(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或全部13种)：任意组合的淀粉酶、钙、氯化物、皮质醇、葡萄糖、hCG、镁、微白蛋白、磷、钾、钠、尿素氮和尿酸。在一些实施方式中，用于多分析物尿液测试的稳定对照分析物还包括以下中的任意一种或多种(1、2、3、4或全部5种)：酮类、白细胞酯酶、亚硝酸盐、蛋白质和尿胆素原。在一些实施方式中，用于多分析物尿液测试的稳定对照分析物包括以下
的任意一种或多种(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或全部37种)：任意组合的3-甲氧酪胺、5-氨基乙酰丙酸、5-HIAA、17-羟皮质类固醇、17-生酮类固醇、17-类固酮、醛固酮、AMP(环状)、砷、钙、氯化物、粪卟啉、皮质醇、多巴胺、肾上腺素、葡萄糖、HVA、羟脯氨酸、铁、铅、镁、汞、变肾上腺素、微白蛋白、去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、磷、卟啉、钾、蛋白质、钠、尿素、尿素氮、尿酸、尿卟啉、VMA和锌。

[0038] 在一些实施方式中，用于多分析物尿液测试的不稳定分析物包括肌酸酐。肌酸酐包含于用于Beckman Coulter DxC上的检测的尿酸、BUN、淀粉酶、钙、镁和肌酸酐测试中，并且被认为相对于测试中的其它分析物是不稳定的。在一些实施方式中，用于多分析物尿液
测试的不稳定分析物包括胆红素。在一些实施方式中，用于多分析物尿液测试的不稳定分
析物包括肌酸酐和胆红素。在一些实施方式中，多分析物尿液测试的不稳定分析物包括以
下中的任意一种或多种(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或全部17种)：任意组合的11-β-羟基-雄酮、11-β-羟基-本胆烷醇酮、11-酮基雄酮、11-酮基本胆烷醇酮、雄酮、巴比妥盐、胆红素、铜、粪卟啉、肌酸、肌酸酐、胱氨酸、脱氢表雄酮、雌三醇、本胆烷醇酮、羟脯氨酸、孕三醇。

[0039] 多分析物对照通常包装或用作多级对照，即，在存在含有不同水平的相同分析物的多个管。本文所述的多分析物对照可包括容纳至少一种稳定化形式的不稳定对照分析物
(1级不稳定对照)的容器和在溶液中容纳至少一种稳定分析物的容器(1级稳定对照)。多级
对照可包括其它容器，例如，2级不稳定对照，和在一些实施方式中的3级不稳定对照，和在一些实施方式中的4级不稳定对照等。多级对照也可包括含有，例如，2级稳定对照、3级稳定对照，和在一些实施方式中的4级稳定对照。

[0040] 在一些实施方式中，制备多级对照以覆盖一定范围，例如，包含的分析物的正常水平范围。例如，对于成人，在24小时尿液收集测试中钠浓度的正常范围是40-220mmol/天。假定每天1升的平均尿液输出，可制备一个示例性组的多分析物使得钠将代表40和200mmol的试验，任选地具有中间水平(例如，120mmol)。对于成人，血清肌酸酐的正常范围是53-113微摩尔。可制备一个示例性组的多分析物对照，使得肌酸酐将代表53和113微摩尔的试验，任选地具有中间水平。在一些实施方式中，多级对照包含代表覆盖所包含的分析物的正常范
围的2或3个水平的容器，例如，代表低浓度的所包含分析物范围的低水平多分析物对照，和代表高浓度的所包含分析物范围的高水平多分析物对照。在一些实施方式中，制备多级对
照以包含正常和异常水平的所包含分析物。例如，高于正常尿液皮质醇可指示库欣综合征
(Cushing’s Syndrome)；24小时尿液样品的正常皮质醇水平通常<50微克/天。可制备这种情况中的多级对照以代表，例如，20微克、50微克、100微克和200微克。本领域计数人员可使用本领域可得的信息确定给定分析物的正常或异常水平，例如，来自NIH的MedlinePlus、
FDA或梅约临床网页(Mayo Clinic website)。

[0041] F.实施例

[0042] 1.实施例1：冻干分析物球的制备

[0043] 为了制备冻干不稳定分析物的组合物，各自含有精密和准确的量的浓缩液体(25-250μL)的小直径珠(3-9mm)分散并冻干成球，该浓缩液体含有一种或多种不稳定分析物。为了辅助制备一致、稳定和持久的球，在球的配制中使用赋形剂。由明尼苏达州霍普金斯
(Hopkins,MN)的BioLyph有限责任公司商业化并大规模生产球。

[0044] 含有去离子水中8390mg/dL或8665mg/dL的肌酸酐的两种溶液用于制备具有不同浓度的两种不同肌酸酐珠(低和高)。这些溶液与添加剂合并，然后分散并冻干以产生珠。用于生产肌酸酐球的溶液中的肌酸酐浓度明显高于所需的肌酸酐对照水平，这样是考虑由于
向重建对照流体中加入球造成的稀释因素。

[0045] 表1和图1显示了肌酸酐珠的特征和珠与珠的差异。

[0046] 表1：肌酸酐珠特性

[0047]

[0048] 2.实施例2：含稳定分析物的质量对照的制备

[0049] 尿液化学对照的配制从对正常人尿液基础的加工开始。进行酶热处理以降解内源性不稳定肌酸酐。尿液在25℃下与100U/dL肌酸酐酶和50U/dL肌酸酶孵育1小时。下一步是7天，41℃孵育。处理后，经加工的尿液经透析以去除降解酶。最后，用等体积的去离子水稀释收集的尿液，之后测试肌酸酐背景浓度。

[0050] 表2：加工前后尿液基础中的内源性肌酸酐浓度

[0051]  肌酸酐浓度
未加工的尿液 45.03mg/dL
肌酸酐降解的尿液 12.55mg/dL

[0052] 在初始处理之后，稳定的分析物和其它基质组分添加至所需的浓度。所得的对照将具有除肌酸酐以外的常规尿液化学对照中的分析物，其肌酸酐可通过冻干珠在使用时加
入。尿液化学对照可包含以下的任意一种或多种：淀粉酶、钙、氯化物、皮质醇、葡萄糖、hCG、酶、微白蛋白、磷、钾、蛋白质、钠、尿素、尿素氮和尿酸。

[0053] 3.实施例3：使用时制备质量对照

[0054] 通过在含有稳定分析物的合适体积的质量对照中再水化合适数量的分析物珠(各自具有限定和测试的浓度)来制备质量对照以实现对照各水平的所需浓度。制备具有不同
分析物浓度的多级对照以实现低于、接近或超过试验的临床决定点的分析物浓度。然后测
定分析物浓度以确保组合物的多级和临床实用性。所得的组合物然后加盖并在2-8℃下储
存。

[0055] 在该实施例中，配制三级多分析物尿液化学对照。如下实现三级肌酸酐的效用：5mL的1级对照中加入1种低水平肌酸酐珠来实现，5mL的2级对照中加入1种高肌酸酐珠来实
现，和5mL的3级对照中加入各水平肌酸酐珠各1种(总共2种珠)。

[0056] 表3显示了通过在含有稳定分析物的液体尿液化学组合物中重建冻干的肌酸酐分析物在使用时制备的三级多分析物尿液化学对照中分析物的恢复数据。

[0057] 表3：尿液化学对照中分析物的浓度

[0058]分析物 单位 1级 2级 3级
淀粉酶 U/L 80 211 289
钙 mg/dL 7.9 11.6 20.8
氯化物 mmol/L 86 209 255
葡萄糖 mg/dL 32 336 393
hCG 定性 - + +
镁 mg/dL 4.6 11.2 20.5
微白蛋白 mg/L 34 127 184
磷 mg/dL 26.7 49.3 76.7
蛋白质 mg/dL 25 72 121
钠 mmol/L 83.8 178.0 216.7
尿素氮 mg/dL 474.1 745.9 844.5
尿酸 mg/dL 17.0 22.0 27.0
肌酸酐 mg/dL 106.01 198.39 290.16

[0059] 通过使用加速稳定性模型以预测保存期来评估分析物的稳定性。含有稳定分析物的液体尿液化学对照的瓶和肌酸酐珠的瓶在升高的温度(35、40和45℃)下储存预定的时间
段以观察比推荐的储存温度(2-8℃)更快的分析物分解/降解。然后在多个孵育时间的终点
测试样品的分析物浓度。结果显示，分析物将在2-8℃下储存时稳定持续至少4年。表4显示了研究的前18个月的肌酸酐实时稳定性数据。斜体显示了统计学上显著的结果。

[0060] 表4：2-8℃下肌酸酐的实时稳定性

[0061]

[0062]

[0063] 还通过模拟实际实验室使用条件来评价对照的开瓶稳定性。这通过以下步骤进行：2-8℃下储存通过加入肌酸酐珠制备的对照瓶并且每个工作日将它们从冰箱中拿出持
续36天，使瓶平衡至室温15分钟，打开瓶并使其内容物暴露于实验室环境中，并合上瓶并使其回到2-8℃的推荐储存温度下。在该开瓶稳定性研究期间测试瓶样品的分析物浓度。该研究的结果表明，当如上所述制备并在2-8℃下储存时来自表3的所有定量分析物将稳定至少
36天。

[0064] 应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求书的范
围内。本说明书中引用的所有专利、专利申请、网络资源和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料以及任何现有技术之
间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义
与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。