(3S,6R)-3,6二取代哌嗪-2,5-二酮,其制备及应用

摘要

本发明公开了u‑PA抑制剂(3S，6R)‑3‑(4‑丁氨基)‑6‑(吲哚‑3‑乙基)‑哌嗪‑2，5‑二酮，公开了它的制备方法，公开了它抑制肿瘤细胞侵袭和迁移，进一步公开了它的止血和抗炎等作用。本发明属于生物医药领域。

权利要求

1.一种u-PA抑制剂，(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮，结构式如下：

2.制备权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的方法，该方法由以下步骤构成：(1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-OBzl在无水四氢呋喃中与D-Boc-Lys(Z)缩合为D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl；

(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl脱去Boc生成D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl；

(3)在乙酸乙酯和5％NaHCO3存在下D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl环合生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮；

(4)在Pd/C和H2存在下，在甲醇中(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-

2,5-二酮脱去苄基生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮。

3.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备肿瘤转移和侵润抑制疾病药物中的应用。

4.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备止血剂的应用。

5.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备抗炎剂的应用。

说明书

(3S,6R)-3,6二取代哌嗪-2,5-二酮,其制备及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及了下面结构式所示的小分子u-PA抑制剂，涉及它的制备方法和作为u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移、止血和抗炎方面的应用。本发明属于生物医药领域。

[0002]

背景技术

[0003] 纤溶酶原激活系统由纤溶酶原激活剂(Pas)，纤溶酶原激活抑制剂(PAIs)和细胞外纤溶酶原激活剂受体(PAR)组成。纤溶酶原激活系统涉及细胞迁移，血管生成，伤口愈合，胚胎发育，肿瘤细胞扩散和转移等一系列过程。在哺乳动物体内主要有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)两种纤溶酶原激活剂。

[0004] 尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝氨酸蛋白酶，属双链尿激酶型纤溶酶原活化剂(tcu-PA)，分子量为55000或33000，是外源性纤维溶解系统的激活剂。u-PA可以直接裂解纤溶酶原的精氨酸(560)-缬氨酸(561)肽键，使无活性的单链纤溶酶原转变为有活性的双链纤溶酶。

[0005] 在肿瘤组织中，u-PA激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶直接或间接造成细胞外基质降解，进一步导致肿瘤细胞的浸润，转移和血管生成，促进肿瘤的增殖。在血液循环中，u-PA通过激活纤溶酶原参与调节血管内凝血-纤溶的平衡，对抑制血栓起重要作用。

[0006] 在炎症应答过程中，u-PA通过与炎症细胞表面的u-PAR结合，参与调节炎症细胞对血管和组织的渗透能力，促进炎症细胞向炎症部位迁移，促进炎症反应以及炎症因子的释放，而炎症因子的释放又会诱导u-PA表达上升。

[0007] 由于u-PA的酶活性贯穿在肿瘤-纤溶-炎症复杂的交叉联系中，所以影响u-PA的活性会影响复杂的交叉联系。也就是说，发明优秀活性的u-PA抑制剂对于抑制u-PA在肿瘤-血栓-炎症交叉联系有重要意义。这种意义体现在70％以上癌症病人死于癌转移；有大约10％的癌症晚期病人出现出血症状，例如出现几乎无法预测鼻，咽，肺或胃肠道大出血； 摘除肿瘤手术发生的出血，也恶化病人的预后。针对这种状况，本发明提出了(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮，其制备及治疗作用。

[0008] 此前，发明人曾报道下面结构的二酮哌嗪包括CIPPC是u-PA抑制剂(结构见图1)，有优秀的止血活性。1nmol/kg剂量下，CIPPC能显著降低小鼠鼠尾出血时间[33，34]。不幸的是，在10nmol/kg剂量下CIPPC能促进血栓生成。血栓是肿瘤本人重要的并合症，是造成肿瘤本人死亡的重要因素。CIPPC能促进血栓生成的作用为肿瘤病人带来了新的威胁。对比之下，(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮的意想不到的优势是，除了与CIPPC一样有优秀的止血活性外，还有抑制肿瘤细胞浸润和转移，抑制肿瘤本人并发炎症作用，同时不会引起血栓形成。

发明内容

[0009] 本发明的第一个内容是提供下面结构式的u-PA抑制剂(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮；

[0010]

[0011] 本发明的第二个内容是提供(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮的制备方法，该方法包括下面四个反应步骤：

[0012] (1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-OBzl在无水四氢呋喃中与L-Boc-Lys(Z)缩合为D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl；

[0013] (2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl脱去Boc生成D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl；

[0014] (3)在乙酸乙酯和5％NaHCO3存在下D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl生成(3S，6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮；

[0015] (4)在Pd/C和H2存在下，在甲醇中(3S，6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮反应生成(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮。

[0016] 上面的四个反应步骤可以用图2的合成路线描述。

[0017] 本发明的第三个内容是评价小分子u-PA抑制剂(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮在抑制肿瘤细胞侵袭和转移方面，以及止血和抗炎等方面的作用。

附图说明

[0018] 图1此前发明人报道的u-PA抑制剂二酮哌嗪CIPPC的结构。

[0019] 图2合成(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮的路线1.i)DCC，HOBt，NMM，THF；ii)HCl/EA(4N)；iii)EA，5％NaHCO3(3a)or EA，TEA，80℃(3b，3c)；iv)CH3OH，Pd/C，H2。

[0020] 图3(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮在体外对UK激活纤溶酶原活力的影响。其中1列为单组分的人纤溶酶原(PLG)，2列为UK与PLG的共孵育；3列为100μg(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分；4列为50μg(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，
5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分；5列为10μg(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；6列为500μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；7列为250μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分。

具体实施方式

[0021] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

[0022] 实施例1制备D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(1)

[0023] 将1.9g(5.0mmol)D-Boc-Lys(Z)混悬于20mL无水四氢呋喃，室温搅拌下向溶液中加入0.675g(5.0mmol)HOBt，冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下搅拌30分钟。将1.47g(5.0mmol)L-Trp-OBzl混悬于20mL无水四氢呋喃中，然后逐渐加入NMM，调节pH至8-9，得到反应液II。将反应液II加入反应液I中，先在冰浴下搅拌1h，再在室温搅拌，TLC监测至原料点消失。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去四氢呋喃，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色泡状物，经硅胶柱层析纯化(CH2Cl2∶CH3OH＝100∶1～20∶1)，得到2.863g(87.3％)标题化合物，为无色固 体。ESI-MS(m/e)：657[M+H]+。

[0024] 实施例2制备D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(2)

[0025] 将纯品2.62g(4.0mmol)D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(1)置于100mL茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加30mL4N氯化氢-乙酸乙酯溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应4小时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加乙酸乙酯溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次；加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干产物，重复三次，得2g(90.9％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e)：557[M+H]+。

[0026] 实施例3制备(3R，6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮(3)[0027] 将1.83g(3.29mmol)化合物D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(2)以80mL乙酸乙酯溶解，用三乙胺调pH至9，油浴80℃反应6小时，TLC显示原料点基本消失。后处理：将反应液直接用硅胶拌样，硅胶柱层析纯化(CH2Cl2∶CH3OH＝100∶1-20∶1)，得到1.28g(86.9％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：449[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝10.89(s，1H)，8.03(s，1H)，7.85(s，1H)，7.56(d，J＝9.0Hz，1H)，7.35(m，6H)，7.19(t，J＝6.0Hz，1H)，7.05(m，2H)，
6.95(t，J＝6.0Hz，1H)，4.99(s，2H)，4.07(s，1H)，3.25(dd，J＝3.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，3.09(dd，J＝3.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，2.99(s，1H)，2.91(q，J＝6.0Hz，2H)，1.48(m，2H)，1.24(m，
2H)，1.16(m，2H)。

[0028] 实施例4制备(3R，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮(4)[0029] 将0.12g(0.26mmol)化合物(3R，6S)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮(3)置于50mL反应瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入30mg Pd/C，通入H2，室温搅拌反应48小时，TLC显示原料的基本消失，滤去Pd/C，减压浓缩得63mg(75％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：315[M+H]+.Mp189-190℃.IR(KBr)：3250，2860，2312，1662，
1456，1325，1230，1093，1006，736cm-1. (c＝0.32，CH3OH).1HNMR(300MHz，
DMSO-d6)：δ/ppm＝10.92(s，1H)，8.05(s，1H)，7.88(s，1H)，7.56(d，J＝9.0Hz，1H)，7.31(d，J＝9.0Hz，1H)，7.06(s，1H)，7.04(t，J＝9Hz，1H)，6.94(t，J＝9Hz，1H)，4.07(s，1H)，3.26(dd，J＝3Hz，J＝12Hz，1H)，3.02(dd，J＝6.0Hz，J＝15Hz，1H)，2.84(m，2H)，2.44(m，2H)，
1.19(m，2H)，1.10(m，2H).13C NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝168.60，168.09，136.37，
128.05，125.02，121.31，119.26，118.85，111.62，108.86，55.89，53.59，41.05，31.94，
31.65，29.39，21.16.Elem.Anal：C17H22N4O2.C，64.95；H，7.05；N，17.82。

[0030] 实验例1测定(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对尿激酶(UK)活性的影响

[0031] 1)主要试剂和仪器

[0032] 试剂：SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸(EACA)均为市售试剂；

[0033] 人纤溶酶原(PLG)和尿激酶(UK)购自Sigma公司。

[0034] 仪器：垂直电泳槽Mini-PROREN Tetra System(BIO-RAD)；

[0035] 电泳仪Power Pac(BIO-RAD)；

[0036] 扫描仪Scanmaker8700(MICROTEK)。

[0037] 2)溶液的准备

[0038] PLG溶液的配制：称取PLG5mg，置于15mL离心管中，加入1mL生理盐水溶解即得PLG溶液，浓度为5mg/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

[0039] UK溶液的配制：将整瓶UK(100,000U)以10mL生理盐水溶解，得母液；取0.1mL母液以生理盐水稀释至2.5mL，得UK溶液，浓度为400U/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

[0040] EACA溶液的配制：称取50mg化合物，以1mL生理盐水溶解，即得母液1，浓度为50mg/mL；取0.5mL母液1，以生理盐水稀释至1mL，得溶液2，浓度为25mg/mL；

[0041] (3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮溶液的配制：称取5mg(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮，以1mL生理盐水溶解，浓度为5mg/mL；-20℃保存待用。

[0042] 3)样品的准备

[0043] 取5μL UK(400U/mL)溶液；分装，每管0.1mL，置于0.5mL离心管中，再向其中分别加入10μL生理盐水或(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮溶液，37℃孵育15分钟；再向各离心管中分别加入5μL PLG溶液，37℃孵育15分钟；孵育结束后，再向各离心管中分别加入5μL5×SDS电泳上样缓冲液，混匀后将各离心管于100℃水浴中变性5分钟，快速冰浴冷却后以12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离。

[0044] 4)SDS-PAGE凝胶电泳

[0045] 试剂准备：

[0046] 30％储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g，混匀后加超纯水(up-H2O)，37℃溶解，定容至100mL，棕色瓶存于室温；

[0047] 1.5M Tris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加up-H2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至 100mL：

[0048] 1M Tris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加up-H2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL；

[0049] 12％SDS：电泳级SDS12.0g加up-H2O于68℃助溶，浓盐酸调至pH7.2，定容至100mL；

[0050] 10％过硫酸铵(AP)：100mg AP加up-H2O 1mL；

[0051] 考马斯亮兰染色液：甲醇-水-醋酸＝45mL+45mL+10mL，加入100mg考马斯亮蓝固体，配制成染色液；

[0052] 脱色液：甲醇-水-醋酸＝10mL+90mL+10mL，配制成脱色液。

[0053] 操作步骤：

[0054] 采用垂直式电泳槽装置

[0055] (一)聚丙烯酰胺凝胶的配制

[0056] 1.分离胶(12％)的配制：

[0057] 超纯水4.0mL

[0058] 30％储备胶溶液3.3mL

[0059] 1.5M Tris-HCl2.5mL

[0060] 12％SDS0.1mL

[0061] 10％AP0.1mL

[0062] 取1mL上述混合液，加TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平，凝胶完全聚合需大约60min。

[0063] 2.浓缩胶(4％)的配制：

[0064] 超纯水1.4mL

[0065] 30％储备胶溶液0.33mL

[0066] 1M Tris-HCl0.25mL

[0067] 12％SDS0.02mL

[0068] 10％AP0.02mL

[0069] TEMED2μL

[0070] 将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需大约30min。

[0071] (二)样品处理：将样品加入相应量的5×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min使蛋 白变性，取出，快速降温。

[0072] (三)上样：将处理后的样品加入样品池中，并加入20μL蛋白分子量标准品作对照。

[0073] (四)电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，30min，分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需1.5h)。

[0074] (五)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，于摇床(60RPM)室温10min。

[0075] (六)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，于摇床(60RPM)室温脱色过夜。

[0076] (七)将脱色后的胶用扫描仪扫描，观察结果。

[0077] 5)结果见图3，(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮浓度依赖地抑制UK水解人纤溶酶原的活性。说明它是UK的抑制剂。

[0078] 实验例2测定(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响

[0079] 1)受试样品

[0080] (3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度；

[0081] RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

[0082] 2)细胞株

[0083] HCCLM3(高转移人肝癌细胞)，购自ATCC。

[0084] 3)主要仪器及耗材

[0085] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

[0086] 细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

[0087] 显微镜：Zeiss公司；

[0088] 8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶：Coming Costar公司。

[0089] 4)主要试剂

[0090] DMEM培养基干粉：Gibco公司；

[0091] PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl8.2g、KCl0.2g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.2g，PH值7.4；

[0092] 胎牛血清：Hyclone公司；

[0093] 0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

[0094] 青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

[0095] DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

[0096] Matrigel(基质胶)：BD公司；

[0097] 结晶紫染液：碧云天公司。

[0098] 5)评价方法

[0099] 包被基质胶：将冻存于-20℃冰箱的matrigel 4℃过夜，变成液态；取720 μL无血清DMEM培养基，加入180 μL Matrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100 μL/个；放入37℃、5％CO2培养箱中，孵育5 h；

[0100] 水化基底膜：吸除小室中残留液体，每孔加入50 μL的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育30 min；

[0101] 接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×105个/mL；每孔加入100 μL细胞悬液，同时加入25 μL(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮使终浓度为10 μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600 μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时；

[0102] 结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4％的多聚甲醛固定细胞30 min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色30 min，吸除染色液，用PBS洗3次；

[0103] 计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计均采用t检验和方差分析，细胞数以( 个)表示。

[0104] 6)结果见表1，(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞侵袭。

[0105] 表1.(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对HCCLM3细胞侵a袭能力的影响

[0106]

[0107]

[0108] a)n＝3；b)与生理盐水比P＜0.05.

[0109] 实验例3评价(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响

[0110] 1)受试样品

[0111] 化合物4用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度；

[0112] RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

[0113] 2)细胞株

[0114] HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

[0115] 3)主要仪器及耗材

[0116] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

[0117] 细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

[0118] 显微镜：Zeiss公司；

[0119] 8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶：Coming Costar公司。

[0120] 4)主要试剂

[0121] DMEM培养基干粉：Gibco公司；

[0122] PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl8.2g、KCl0.2g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.2g，PH值7.4；

[0123] 胎牛血清：Hyclone公司；

[0124] 0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

[0125] 青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

[0126] DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

[0127] 结晶紫染液：碧云天公司。

[0128] 5)评价方法

[0129] 接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×106个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮使终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养6小时；

[0130] 结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS洗3次；

[0131] 计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计均采用t检验和方差分析，细胞数以( 个)表示。

[0132] 6)结果见表2，(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞迁移。

[0133] 表2.(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响a

[0134]

[0135] a)n＝3；b)与生理盐水比P＜0.05.

[0136] 实验例4评价(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对ICR小鼠鼠尾出血时间的影响

[0137] 1)实验材料

[0138] 受试化合物：化合物4；

[0139] 阳性对照为6-氨基己酸(EACA)；阴性对照为生理盐水(NS)；

[0140] 实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重18-22g，由北京维通利华实验动物技术有 限公司提供；每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组；

[0141] 溶剂：生理盐水。

[0142] 2)药物配制

[0143] 按量称取化合物4，加入生理盐水至所需浓度即可；6-氨基己酸(EACA)为生理盐水溶液。

[0144] 3)给药剂量及给药方式

[0145] 给药剂量：EACA为1.96mmol/kg；(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮为0.05μmol/kg；按照小鼠体重，每10g给0.1mL药液或者生理盐水；灌胃给药。

[0146] 4)动物模型的建立

[0147] ICR雄性小鼠70只，体重18-22g，随机分为化合物组、EACA组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，将小鼠装入固定装置内，使其尾巴暴露在外，以毫米尺准确测量，在距鼠尾末端3mm处做标记，用利剪在鼠尾末端标记出快速剪断，待血液能够自行溢出时开始计时，每隔30秒，用滤纸轻轻拭去断口处血滴，直至血液自然停止，即滤纸吸时无血为止。

[0148] 5)统计方法

[0149] 本实验数据统计均采用t检验和方差分析，出血时间以 表示。

[0150] 6)结果见表3，在比阳性对照EACA的剂量低3920倍时(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-（吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮仍然有效地缩短小鼠出血时间，说明它可有效地止血。

[0151] 表3.(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对ICR小鼠鼠尾出血时间的影响 a

[0152]

[0153]

[0154] a)n＝10；b)与生理盐水比P＜0.01；c)与生理盐水比P＞0.05.

[0155] 实验例5测定(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-2酮对大鼠颈动脉血栓生成的影响

[0156] 1)实验材料

[0157] 受试化合物：(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮；

[0158] 阳性对照为阿司匹林(Aspirin)；阴性对照为生理盐水(NS)；

[0159] 实验动物：SD雄性大鼠(清洁级)，体重180-220g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；每10只大鼠一组，空白和阳性对照各一组；

[0160] 溶剂：生理盐水。

[0161] 2)药物配制

[0162] 按量称取(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿司匹林为生理盐水溶液。

[0163] 3)给药剂量及给药方式

[0164] 给药剂量：阿司匹林为50μmol/kg；(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮为0.05μmol/kg；按照大鼠体重，每100g给0.3mL药液或者生理盐水；灌胃给药。

[0165] 4)动物模型的建立

[0166] SD雄性大鼠70只，体重180-220g，随机分为化合物组、阿司匹林组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，各组大鼠以10％水合氯醛麻醉，分离出颈总动脉和颈总静脉，以大鼠颈总动脉-静脉插管旁路循环丝线法造成大鼠动脉血栓模型；循环15分钟，取出旁路管中的带栓丝线，拭去表面浮血，称带栓丝线湿重，减去丝线重量后，即得形成血栓的湿重，记录数据。

[0167] 5)统计方法

[0168] 本实验数据统计均采用t检验和方差分析，血栓湿重以 表示。

[0169] 6)结果见表4，在0.05μmol/kg剂量下(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮没有促进小鼠血栓形成作用，即没有血栓形成风险。

[0170] 表4.(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对SD大鼠颈动脉血栓生成量的影响a

[0171]

[0172] a)n＝10；b)与生理盐水比P＞0.05；c)与生理盐水比P＜0.01.

[0173] 实验例6评价(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响

[0174] 1)实验材料

[0175] 受试化合物：(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮；

[0176] 阳性对照为阿司匹林(Aspirin)；阴性对照为生理盐水(NS)；

[0177] 实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重18-22g，由北京维通利华实验物技术有限公司提供。每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组。

[0178] 2)药物配制

[0179] 按量称取(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿司匹林为生理盐水溶液。

[0180] 3)给药剂量及给药方式

[0181] 给药剂量：阿司匹林为1.11mmol/kg；(3S，6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮为0.05μmol/kg；按照小鼠体重，每10g给0.1mL药液或者生理盐水；灌胃给药。

[0182] 4)动物模型的建立

[0183] ICR雄性小鼠70只，体重18-22g，随机分为(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮组、阿司匹林组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，在小鼠左耳朵耳廓内侧均匀涂抹30μL二甲苯，2小时后颈椎脱臼处死小鼠，分别将左、右两耳外耳廓剪下并重合叠放在一起，用直径7mm的打孔器在同一位置打取圆形耳片，称重，记录并计算两耳重量差；鼠耳肿胀度＝左耳片重-右耳片重。

[0184] 5)统计方法

[0185] 本实验数据统计均采用t检验和方差分析，鼠耳肿胀度以 表示。

[0186] 6)结果见表5，在0.05μmol/kg剂量下(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，即有效地抑制炎症。

[0187] 表5.(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对ICR小鼠耳肿胀度的影响a

[0188]

[0189] a)n＝10；b)与生理盐水比P＜0.05；c)与生理盐水比P＜0.01。