一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：a、改造并获得载体T202 b、改造并扩增乳铁蛋白基因；c、构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202‑Blf；d、用重组质粒T202‑Blf转化农杆菌EHA105细胞；e、筛选阳性农杆菌EHA105菌株，并进行酶切鉴定；f、转化青蒿，获得阳性含乳铁蛋白的青蒿转化植株；g、实时定量PCR(qRT‑PCR)鉴定乳铁蛋白的表达量。本发明采用的青蒿表达系统具有以下优点：根据青蒿的密码子偏好性，对乳铁蛋白基因的核苷酸序列进行了优化，保证了高效和稳定的mRNA转录、快速和准确的翻译以及较高的外源蛋白质积累；植物表达乳铁蛋白成本低、安全、经济效益好；表达的蛋白产品可直接用于添加，无须纯化。

权利要求

1.一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)构建青蒿细胞中表达改造后的乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf；重组质粒T202-Blf的序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)用重组质粒T202-Blf转化青蒿；

(4)筛选阳性转基因青蒿植株，获得生产乳铁蛋白的青蒿植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述改造载体T202的过程如下：(a)以pCambia1300为模板，用如下引物对TDNA的pRB序列进行PCR扩增：引物pRB-F1:5’-GAATTCACTGGGAATTCCCTGGCGTTA-3’；

引物pRB-R1:5’-GGTACCCAGCCTGTCGGGTACCTTAGGA-3’；

(b)将PCR扩增得到的pRB序列测序鉴定；将正确的pRB序列连接到pCambia1301上，得到载体pC13001T，载体pC13001T序列如SEQ ID NO.3所示；

(c)用KpnI和SmaI酶切Actin启动子，同时用KpnI和PmacI酶切载体pC13001T，将酶切的载体pC13001T与酶切的Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf的过程如下：(a)合成改造后的乳铁蛋白基因序列，并将其保存于PMD19Simple质粒中，改造后的乳铁蛋白基因序列如SEQ ID NO.4所示；

(b)用如下引物对保存于PMD19Simple质粒中的改造后的乳铁蛋白基因进行扩增：引物Blf F1：5’CTGCAGTGGCATCTCTCAGCACATATG 3’；

引物Blf R1：5’TCTAGACTTGTCGTCGTCTTAGTAACA C3’；

(c)将PCR扩增得到的改造后的乳铁蛋白基因测序鉴定；将正确的改造后的乳铁蛋白基因与T-载体连接，得到载体Blf-T，载体Blf-T序列如SEQ ID NO.5所示；

(d)用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和载体Blf-T，将酶切的改造后的载体T202和酶切的载体Blf-T连接，构建成重组质粒T202-Blf。

说明书

一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法。

背景技术

[0002] 畜牧业的健康有序发展，不仅关乎人民的食品安全，还对经济有着巨大的影响。而动物疫病的发生，严重影响了畜牧的健康和产量，给广大养殖户带来巨大的经济损失。目前，养殖户主要通过在饲料中添加抗生素来达到防治疫病的目的。但是，大量使用抗生素，会严重破坏动物消化系统的微生态平衡，而且会产生耐药性。抗生素在动物体内会有不同程度的残留，进而影响食用者的身体健康。因此，人们开始呼吁全面禁止在动物饲料中添加抗生素。

[0003] 抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是动物先天性免疫的重要组成部分，对细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物，支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞(如肿瘤细胞)和艾滋病病毒都具有杀伤作用。而且抗菌肽分子通过破坏病原微生物的细胞膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致其死亡，因此病原微生物很难对其产生耐药性。抗菌肽具有无免疫原性，具有高效、安全、无残留等优点，能调节免疫作用，不干扰肠道有益菌等特性，是一种最具开发前景的抗生素替代品。

[0004] 乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)由1939年Sorensen等人在分离乳清蛋白时发现，并且于1960年由Groves于从牛乳中分离得到。牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin，简写为Lfcin B)是牛乳铁蛋白(bLF)N-端(17～41)的25个氨基酸残基，分子量约为3.1kd，是bLF的抗菌活性中心，对bLF抗菌活性起重要作用(Kanget al,1996)，其抑菌效果是bLF的400倍，且在维持胃肠道正常菌群中发挥重要作用。Lfcin B具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性、调节免疫、广谱抗菌、不干扰肠道有益菌等特性。Lfcin B具有良好的抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不影响双歧杆菌等有益细菌，同时还能刺激细胞的生长。因此，在农业、畜牧、医疗等领域有广阔的应用前景。

[0005] 本公司之前发明了一种用酵母生产乳铁蛋白的方法，改造后的乳铁蛋白抑菌效果更好；且酵母生长速率快，产量高，无需采用甲醇诱导，易于高密度培养；表达的蛋白产品易于分离纯化；具有多种翻译后修饰特性，如多肽折叠、糖基化、甲基化、乙酰化等；遗传背景清楚，易于对表达载体进行操作。但是在将其推广至大规模工业化生产过程时，存在产量不够稳定，容易被杂菌污染等问题，且相对于植物的种植，该种方法的成本和技术要求仍然偏高。

[0006] 而青蒿(Artemisia carvifolia)为一年生草本，气香特异，味微苦，有清凉感，能够起到良好的保健作用。花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干后，可直接用作饲料添加。青蒿作为生产乳铁蛋白的植物，还具有粗生易管，生长期短，投资少，收益快等优点。

发明内容

[0007] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用青蒿生产乳铁蛋白的方法。

[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

[0009] 所述用青蒿生产乳铁蛋白的方法包括如下步骤：

[0010] (1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示，全长12259bp；

[0011] (2)构建青蒿细胞中表达改造后的乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf；重组质粒T202-Blf的序列如SEQ ID NO.2所示；

[0012] (3)用重组质粒T202-Blf转化青蒿；

[0013] (4)筛选阳性转基因青蒿植株，获得生产乳铁蛋白的青蒿植株。

[0014] 优选地，步骤(1)所述改造载体T202的过程如下：

[0015] (a)以pCambia1300为模板，用如下引物对TDNA的pRB序列进行PCR扩增(产物长度为441bp)，pRB序列如SEQ ID NO.6所示：

[0016] 引物pRB-F1:5’-GAATTCACTGGGAATTCCCTGGCGTTA-3’(SEQ ID NO.7)；EcoRI[0017] 引物pRB-R1:5’-GGTACCCAGCCTGTCGGGTACCTTAGGA-3’(SEQ ID NO.8)；KpnI[0018] (b)将PCR扩增得到的pRB序列测序鉴定；将正确的pRB序列连接到pCambia1301上，得到载体pC13001T，载体pC13001T序列如SEQ ID NO.3所示；

[0019] (c)用KpnI和SmaI酶切Actin启动子，同时用KpnI和PmacI酶切载体pC13001T，将酶切的载体pC13001T与酶切的Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。

[0020] 优选地，步骤(2)所述构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf的过程如下：

[0021] (a)合成改造后的乳铁蛋白基因序列，并将其保存于PMD19Simple质粒中，改造后的乳铁蛋白基因序列如SEQ ID NO.4所示；

[0022] (b)用如下引物对保存于PMD19Simple质粒中的改造后的乳铁蛋白基因进行扩增：

[0023] 引物Blf F1：5’-CTGCAGTGGCATCTCTCAGCACATATG-3’(SEQ ID NO.9)；Pst I[0024] 引物Blf R1：5’-TCTAGACTTGTCGTCGTCTTAGTAACAC-3’(SEQ ID NO.10)；Xbal I[0025] (c)将PCR扩增得到的改造后的乳铁蛋白基因测序鉴定；将正确的改造后的乳铁蛋白基因与T-载体连接，得到载体Blf-T，载体Blf-T序列如SEQ ID NO.5所示；

[0026] (d)用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和载体Blf-T，将酶切的改造后的载体T202和酶切的载体Blf-T连接，构建成重组质粒T202-Blf。

[0027] 下面对本发明作进一步说明：

[0028] 步骤(1)所述改造载体T202的过程中，PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-59℃30s-72℃70s，30个循环，72℃7min；经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用；将得到的pRB片段与T-载体连接，得到pRB-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Hind III和Xbal I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；将克隆到的pRB序列连接到pCambia1301上，酶切位点为(EcoRI-KpnI,GAATTC---GGTACC)，新载体命名:pC13001T。用KpnI和SmaI酶切Actin启动子(事先由本课题组成员克隆连接入pMD18T Vector，并测序显示正确)，同时用KpnI和PmacI酶切pC13001T，与Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。选择EcoRI单酶切，应出现810bp的条带。

[0029] 步骤(2)中改造乳铁蛋白基因序列的过程如下：

[0030] (a)利用SeqnConverter软件分析青蒿基因组蛋白编码序列。

[0031] 从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中筛选蛋白表达量较高、基因功能注释明确的基因，运用软件SeqnConverter(http://www.cibj.com/seqnconverter.zip)分析筛选出的101条完整的蛋白编码序列，计算青蒿同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)：某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率之比。如果某一密码子的同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage)RSCU＝1，表明该密码子的使用没有偏好性；如果RSCU＞l，表明该密码子的使用偏爱性相对较高。

[0032] (b)乳铁蛋白基因密码子优化

[0033] 在保持乳铁蛋白蛋白氨基酸序列不变的前提下，把其中RSCU值小于0.5的密码子替换成青蒿偏爱的密码子，即在同义密码子组中RSCU值最大的密码子；RSCU值在0.5～1.0之间的密码子只是部分替换成青蒿偏爱的密码子；而RSCU值在1以上的密码子不作改变。同义密码子替换过程中，降低密码子ACC、AGC、GCC及CCC所占的比例，以减少可能发生甲基化的位点。

[0034] (c)Poly(A)加尾识别位点分析

[0035] 青蒿偏爱密码子优化后的乳铁蛋白基因序列可能含有Poly(A)加尾识别序列。采用同义密码子替换法消除Poly(A)加尾识别序列(AATAAA，ATTAAA，AACCAA和AATTAA)，以保证乳铁蛋白基因转录的完整性。

[0036] (d)内含子切割识别序列分析

[0037] 上述优化后的乳铁蛋白基因序列可能存在内含子剪切信号序列。用SoftBerry在线服务器(http:/linux1.softberry.com/berry.phtml)预测出潜在的内含子切割识别序列，再以同义密码子替换法消除内含子切割识别序列，以保证乳铁蛋白基因转录的完整性。

[0038] 对改造后的乳铁蛋白基因进行扩增时，PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-56℃30s-72℃20s，30个循环，72℃7min；经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用；将得到的乳铁蛋白基因与T-载体连接，得到Blf-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Pst I和Xbal I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定。

[0039] 步骤(2)中的步骤(d)的具体过程为：用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和Blf-T载体，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，回收乳铁蛋白基因片段和载体T202片段；T4连接酶，16℃连接2h得到重组质粒T202-Blf，转化大肠杆菌DH5α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定。将检测正确的质粒，转化入农杆菌中，-70℃保存备用。

[0040] 步骤(3)是用农杆菌介导的转化法侵染青蒿并得到转基因青蒿苗；筛选阳性植株，并进行PCR鉴定，所述筛选阳性菌株的方法是利用实时定量RT-PCR扩增检测其表达量。野生的青蒿里面没有乳铁蛋白，所以只要转基因青蒿里面有乳铁蛋白，就是阳性。PCR鉴定阳性率、RT-PCR鉴定乳铁蛋白的表达量，均为常规方法。

[0041] 重组质粒T202-Blf转化青蒿的具体过程如下：

[0042] 1)提前三天农杆菌准备：LB板(LB固体培养基灭菌后冷却至60℃，加Kan100mg/L+CHL34mg/L+Rif100mg/L，倒平板；

[0043] 2)菌液的涂布；

[0044] 3)28℃倒置培养2-3天；

[0045] 4)NBM固体培养基，加好As后倒平板，备用。NBM液体培养基。滤纸，三角瓶，水，提前灭菌；

[0046] 5)培养好的LB平板菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，目测浓度，调OD600＝0.5；

[0047] 6)农杆菌介导转化：将青蒿苗剪成1cm见方大小的片状，转移到农杆菌EHA105菌液中浸泡30min，摇床震荡。用灭菌滤纸吸干水分，稍稍吹干。将青蒿转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)其上放一张灭菌滤纸，25～26℃下暗培养3天；

[0048] 7)筛选培养：3天后，将青蒿转入灭过菌的三角瓶中，用菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧变青霉素的灭菌水浸泡30min，摇床震荡。用灭菌滤纸吸干水分。转移到筛选培养基(MS+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素+50mg/L潮霉素)，25～26℃下暗培养，20天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中；

[0049] 8)分化培养：结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤整体转移到分化培养基中，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；

[0050] 转基因青蒿的阳性率的鉴定

[0051] 1)CTAB法提取青蒿基因组DNA

[0052] 取青蒿台北309叶片约0.1g，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速置于事先装有800μL CTAB缓冲液的1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，置于65℃水浴30min，期间每5min轻轻震荡几次。加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)轻轻摇匀，4℃，12000g离心10min。吸取上清到新的1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，摇晃均匀后，室温放置10min。4℃，12000g，离心10min。去上清液，加入1mL的75％乙醇洗涤，沉淀片刻后，4℃，12000g离心5min。倒去液体，将离心管倒置，室温静置15～30min，使DNA干燥。加入40μL含RNase的TE使DNA完全溶解，置于37℃中温育30min消化RNA。用0.8％琼脂糖经行电泳实验，检测DNA的质量及浓度后，置于4℃中备用，或置于-20℃长期冻存。

[0053] 2)转基因青蒿T0代植株的PCR鉴定

[0054] 通过农杆菌介导法转化愈伤组织获得转基因青蒿株系后，利用PCR扩增技术鉴定所得株系是否为阳性转基因植株。采用CTAB法分别提取各青蒿株系叶片的DNA作为模板，通过潮霉素特异性扩增引物进行PCR扩增。序列如下：

[0055] 引物Hyg F1：5’-CGACAGCGTCTCCGACCTGA-3’(SEQ ID NO.11)

[0056] 引物Hyg R1：5’–CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3’(SEQ ID NO.12)；

[0057] 反应体系如下：

[0058]

[0059] 热循环设置为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸30s，35cycles；72℃延伸35min。同时设置阴性无模板对照、阴性野生型对照和阳性质粒对照。

[0060] 乳铁蛋白的表达量鉴定

[0061] 1)植物总RNA提取

[0062] 植物组织材料取材后，剪碎，迅速置于液氮中研磨成干粉状，取约100mg的粉末状材料，装入事先盛有1.0mL TRIzol提取液(Invitrogen)的1.5mL离心管中，盖紧管盖，摇动，使样品与TRIzol提取液充分混合。以低温记号笔编号后，置于-70℃超低温冰箱中冻存备用。

[0063] 将-70℃超低温冰箱中冻存备用的样品取出后，冰浴5min，使样品的核蛋白完全裂解，按照200μl氯仿/mlTRIzol加入适量氯仿，用力震荡15s(注：此处禁用涡旋振荡仪，以免将基因组DNA震断)后室温放置15min，再4℃，12000g离心15min；小心吸取出上层水相，转入另一干净的离心管中；按照0.5ml异丙醇/mlTRIzol加入事先预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20℃沉淀10min；4℃，12000g离心10min；弃上清，此时RNA已沉于管底。在离心管中加入1mL事先预冷的75％乙醇，上下颠倒离心管，悬浮沉淀洗涤；4℃，8000g离心5min；弃上清，室温或真空干燥5-10min后(注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解)。加入50μl RNase-free的水，充分溶解，55-60℃处理5-10min。所提RNA经DNA酶(Fermentas)后，测OD值定量RNA的浓度，用作荧光定量PCR的模板和合成cDNA的第一链。

[0064] DNase消化的反应体系是：

[0065]

[0066] 2)cDNA第一链合成

[0067] 在无菌0.2ml的离心管中配置下列引物/模板RNA混合液，70℃温育10min后，迅速置于冰上2～5min，快速离心数秒，使引物/模板RNA的变性溶液集于管底。

[0068] cDNA第一链合成的反应体系是：

[0069]

[0070] 在上述离心管中配置下列反转录反应液后，42℃温育1h；随后再在70℃温育15min，置于冰上冷却，得到cDNA用于之后的PCR扩增。

[0071]

[0072] 3)实时定量PCR(qRT-PCR)分析

[0073] qRT-PCR使用SYBR Green RT-PCR One Step Kit(QIAGEN公司)，仪器选用ABI Prism 7900HT荧光定量PCR仪，每个样品重复3次。

[0074] PCR反应体系是：

[0075]

[0076] 热循环设置为：48℃ 30min，1cycle；95℃ 10min，1cycle；95℃ 15s，58℃ 40s，72℃ 20s，40cycles。按相对定量法计算，目的基因相对表达量Rel.Exp＝2－ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(CalibratorΔCt)-(未知样品ΔCt)，未知样品ΔCt＝(内参基因Ct).(目的基因Ct)，CalibratorΔCt＝(参比样内参基因Ct).(参比样目的基因Ct)。内参基因为TFC1和UBC6。

[0077] 引物序列如下：

[0078] 引物TFC1F1：5’-CATAACTGAAGAGCCAGACGAC-3’(SEQ ID NO.13)；

[0079] 引物TFC1R1：5’-CAGAATTAGCATCCACAACGAC-3’(SEQ ID NO.14)；

[0080] 引物UBC6F1：5’–GCGGGGATGGAGCATTGGTTCTTT-3’(SEQ ID NO.15)；

[0081] 引物UBC6R1：5’–GACTGAACGGACAAGAGGCATTG-3’(SEQ ID NO.16)。

[0082] 本发明先改造载体T202；合成并扩增乳铁蛋白基因；利用该基因和本公司改造的载体T202构建能够在青蒿中表达该乳铁蛋白基因的重组质粒；然后用重组质粒转化青蒿；筛选阳性转基因青蒿苗，最后获得乳铁蛋白青蒿。

[0083] 本发明克服了用酵母生产乳铁蛋白技术要求高、成本高、表达量不稳定等缺点；根据青蒿的密码子偏好性，对乳铁蛋白基因的核苷酸序列进行了优化，保证了高效和稳定的mRNA转录、快速和准确的翻译以及较高的外源蛋白质积累；且得到的生产乳铁蛋白的转基因青蒿苗，表达量高，生长速率快；表达的蛋白产品无须分离纯化，可直接添加；具有多种翻译后修饰特性，如多肽折叠、糖基化、甲基化、乙酰化等；青蒿属于植物类，安全无伤害，可直接用于饲料添加。

附图说明

[0084] 图1为pRB的PCR扩增产物电泳图；

[0085] 图2为pRB连T载体后的质粒DNA酶切鉴定电泳图；

[0086] 图3为在pCambia1301中插入连接克隆得到的pRB序列后的酶切鉴定电泳图；

[0087] 图4为构建好的T202酶切鉴定电泳图；

[0088] 图5为乳铁蛋白基因的PCR扩增产物电泳图；

[0089] 图6为乳铁蛋白连T载体后的质粒DNA酶切鉴定电泳图；

[0090] 图7为载体T202-Blf转化大肠杆菌DH5α后，提取质粒的酶切鉴定电泳图；

[0091] 图8为将T202-Blf转入农杆菌EHA105后，将提取的质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α后的酶切鉴定电泳图；

[0092] 图9为青蒿无菌苗的准备；

[0093] 图10为抗菌肽青蒿的分化；

[0094] 图11为抗性转基因青蒿苗；

[0095] 图12为PCR筛选阳性转基因青蒿苗；

[0096] 图13为实时荧光定量RT-PCR检测Blf的表达。

[0097] 在图1中，泳道M为1kb plus marker(10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，泳道3为pRB的PCR扩增产物。

[0098] 在图2中，泳道M为1kb plus marker(10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，泳道1为pRB-T载体的酶切产物。

[0099] 在图3中，泳道M为1kb plus marker(10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，泳道3为pCambia1301中插入连接克隆得到的pRB序列后的酶切产物。

[0100] 在图4中，泳道M为1kb plus marker(10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，泳道2为构建好的T202酶切鉴定。

[0101] 在图5中，泳道M为D2000marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道2、3为乳铁蛋白基因的PCR产物。

[0102] 在图6中，泳道M为D2000marker，泳道7-10为Blf-T载体的酶切产物。

[0103] 在图7中，泳道M为D2000marker，泳道7、8为载体T202-Blf转化大肠杆菌DH5α后，提取质粒的的酶切产物。

[0104] 在图8中，泳道M为D2000marker，泳道6、7为将T202-Blf转入农杆菌EHA105后，将提取的质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α后的酶切产物。

[0105] 在图9中，为准备的青蒿无菌苗。

[0106] 在图10中，为抗菌肽青蒿的分化。

[0107] 在图11中，为转基因青蒿苗。

[0108] 在图12中，泳道M为DL2000DNA marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为无模板对照，泳道2为野生型对照，泳道9、10、11、13、16、18为转基因植株PCR筛选阳性转基因青蒿苗；

[0109] 在图13中，为实时荧光定量RT-PCR检测Blf的表达。

[0110] 具体实施方式实施例中所用到的序列均为上文提到的序列

[0111] 本发明的用青蒿生产乳铁蛋白的方法，其包括以下步骤：

[0112] a、改造载体T202；

[0113] b、构建青蒿细胞中表达乳铁蛋白基因的重组质粒T202-Blf；

[0114] c、用重组质粒T202-Blf转化青蒿；

[0115] d、筛选阳性转基因青蒿苗，并进行实时RT-PCR鉴定。

[0116] 具体操作过程为：

[0117] 1、改造载体T202

[0118] 克隆pRB片段：

[0119] 以以pCambia1300为模板，设计合成引物扩增pRB(图1)。PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-59℃30s-72℃70s，30个循环，72℃7min。经2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用。将得到的pRB片段与T-载体(购于宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Hind III和Xbal I双酶切筛选阳性菌株(图2)。送阳性菌液送公司测序分析验证pRB序列的正确性。

[0120] 将克隆到的pRB序列连接到pCambia1301上，酶切位点为(EcoRI-KpnI,GAATTC---GGTACC)，新载体命名:pC13001T(图3)。用KpnI和SmaI酶切Actin启动子(事先由本课题组成员克隆连接入pMD18T Vector，并测序显示正确)，同时用KpnI和PmacI酶切pC13001T，与Actin启动子进行连接，构建成T202。选择EcoRI单酶切，应出现810bp的条带(图4)。

[0121] 合成和克隆乳铁蛋白基因：

[0122] 根据NCBI GenBank中乳铁蛋白成熟肽的基因序列，人工合成改造后的乳铁蛋白基因(以下简称“乳铁蛋白基因”)并将其保存于PMD19Simple质粒。再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物Blf F1和Blf F2(表1)，以PMD19Simple质粒中为模板通过PCR技术克隆扩增乳铁蛋白(Lfcin B)基因片段。PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s-56℃ 30s-72℃ 20s，30个循环，72℃ 7min。经2％琼脂糖凝胶电泳后，结果如图5所示，在图6中，泳道M为D2000marker，泳道2-3为乳铁蛋白基因的PCR产物。

[0123] 回收纯化目的片段，保存于-20℃备用。将得到的乳铁蛋白基因与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃下，用Pst I和Xba I双酶切筛选阳性菌株(图6)，送阳性菌液送公司测序分析验证乳铁蛋白基因序列的正确性。

[0124] 测序结果表明：Lfcin B基因的序列如序列4中第1-105位核苷酸所示，将连入Lfcin B基因序列的T载体记作Blf-T载体。

[0125] 表1 所用引物序列

[0126]

[0127] 2、构建表达载体—重组质粒T202-Blf

[0128] 用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和载体Blf-T，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，回收乳铁蛋白基因片段和T202载体片段。T4连接酶，16℃连接2h得到重组质粒T202-Blf，转化大肠杆菌DH5α菌株。转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定(图7)。

[0129] 将鉴定后的重组质粒T202-Blf转入农杆菌EHA105后，将提取的质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α后的酶切鉴定(图8)。

[0130] 3、重组质粒T202-Blf转化青蒿

[0131] 1)提前三天农杆菌准备：LB板(LB固体培养基灭菌后冷却至60℃，加Kan100mg/L+CHL34mg/L+Rif100mg/L，倒平板；

[0132] 2)菌液的涂布；

[0133] 3)28℃倒置培养2-3天；

[0134] 4)NBM固体培养基，加好As后倒平板，备用。NBM液体培养基。滤纸，三角瓶，水，提前灭菌；

[0135] 5)培养好的LB平板菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，目测浓度，调OD600＝0.5；

[0136] 6)农杆菌介导转化：将实现准本好的青蒿无菌苗(图9)剪成1cm见方大小的片状，转移到菌液中浸泡30min，摇床震荡。用灭菌滤纸吸干水分，稍稍吹干。将青蒿转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)

[0137] 其上放一张灭菌滤纸，25～26℃下暗培养3天；

[0138] 7)筛选培养：3天后，将青蒿转入灭过菌的三角瓶中，用菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧变青霉素的灭菌水浸泡30min，摇床震荡。用灭菌滤纸吸干水分。转移到筛选培养基(MS+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素+50mg/L潮霉素)，25～26℃下暗培养，20天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中；

[0139] 8)分化培养：结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤整体转移到分化培养基中(图10)，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基，至分化出健壮的转基因青蒿苗(图11)；

[0140] 9)用PCR检测所得抗性青蒿植株的阳性率后(图12)，利用实时RT-PCR检测青蒿内抗菌肽乳铁蛋白的表达量(图13)，结果显示，在野生型青蒿中，没有乳铁蛋白，而阳性转基因青蒿中，L1-L5中均有乳铁蛋白表达，且以L1中的表达量为1，L3和L5的相对表达量较高，分别为2.46和2.87，L2和L4的相对表达量最高，分别为5.97和4.39，我们将选用L2和L4的无性繁殖(组培苗)，作为下一步生产所用种苗。