一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统

摘要

本发明公开了一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统。它包括核酸提取与扩增模块和毛细管电泳模块，集成在一个微流控系统中以实现核酸分析检测流程的完全自动化。本发明集成化的微流控系统大大减小了配套硬件设备的体积与成本，也使工作人员从繁杂专业的传统工作流程中解放出来。这一集成化系统的使用能够为临床检测、法医检验等许多DNA检测分析的应用领域提供更加便捷、高效、自动、准确、及时的检测结果。

权利要求

1.一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统，其特征在于：它包括核酸提取与扩增模块和毛细管电泳模块；

所述核酸提取与扩增模块包括设于基片上的核酸提取试剂入口、核酸扩增试剂入口、样本入口和PCR腔室；所述核酸提取试剂入口、所述样本入口和所述PCR腔室依次相连通，所述样本入口与所述PCR腔室之间设有流体控制阀Ⅰ，所述PCR腔室的入口端设有滤纸；所述PCR腔室的出口端依次与流体控制阀Ⅱ、连接结构和废液出口相连通；所述核酸扩增试剂入口与所述PCR腔室入口端的流体通道相连通，且所述核酸扩增试剂入口与所述流体通道之间设有流体控制阀Ⅲ；

所述毛细管电泳模块包括设于基片上的毛细管电泳进样管道和毛细管电泳主管道，且所述毛细管电泳进样管道与所述毛细管电泳主管道之间为垂直相交设置；所述毛细管主管道的两端分别设有毛细管电泳阴极槽和毛细管电泳阳极槽；所述毛细管电泳进样管道上设有毛细管电泳废液储存槽；

所述连接结构包括设于组成所述核酸提取与扩增模块的基片上的PCR产物转移腔室和电泳相关试剂储存腔室，所述PCR产物转移腔室与所述电泳相关试剂储存腔室之间通过3个隔膜分隔成独立的腔室，隔膜A设于所述PCR产物转移腔室的上部，隔膜B设于所述PCR产物转移腔室与所述电泳相关试剂储存腔室之间，隔膜C设于所述电泳相关试剂储存腔室的下部；

所述核酸提取与扩增模块设于所述毛细管电泳模块的上部，且所述电泳相关试剂储存腔室设于毛细管电泳的进样储液池的上方，所述毛细管电泳的进样储液池设于所述所述毛细管电泳模块上且与所述毛细管电泳进样管道相连通。

2.根据权利要求1所述的集成化微流控系统，其特征在于：所述隔膜为一层隔膜或多层隔膜。

3.根据权利要求1或2所述的集成化微流控系统，其特征在于：所述核酸提取与扩增模块由两片基片热压键合得到；

所述毛细管电泳模块由两片基片热压键合得到。

4.根据权利要求3所述的集成化微流控系统，其特征在于：所述核酸提取与扩增模块与所述毛细管电泳模块之间设有弹性中间层。

5.根据权利要求4所述的集成化微流控系统，其特征在于：所述核酸提取与扩增模块由聚甲基丙烯酸甲酯制成；

所述毛细管电泳模块由玻璃制成；

所述弹性中间层由PDMS制成。

6.根据权利要求5所述的集成化微流控系统，其特征在于：所述集成化微流控系统包括

1～8个所述核酸提取与扩增模块；

所述毛细管电泳模块包括1～8个所述毛细管电泳主管道；

每个所述核酸提取与扩增模块上的所述连接结构与1条所述毛细管电泳主管道相连通。

说明书

一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统，属于生物检测分析技术领域。

背景技术

[0002] 基于微流控技术的全集成式核酸分析检测系统是针对现有的核酸毛细管电泳检测技术在自动化、低成本以及便携性等劣势上提出的升级方案。核酸检测在许多生化分析领域如临床医学、法医鉴定、遗传检验等都有着十分重大的作用。在临床医学上，基因检测用于各种疾病的检测与诊断，典型的如各种恶性肿瘤、各种先天性遗传疾病；在法医分析领域，基因检测是用于个体识别的金标准之一；在遗传分析领域，基因检测可以用来进行亲子鉴定、遗传图谱分析等。

[0003] 现在各个领域中所使用的基因检测手段仍旧是传统的方法，即首先是手工提取样本中的核酸，这一步一般是购买商业化的核酸提取试剂盒，再按照产品说明书进行操作，在试管内进行一系列复杂的生化反应来完成的；接下来的扩增流程以常用的聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)扩增为例，扩增需要手工加入PCR反应混合液之后再通过商用的PCR仪来进行；最后的检测步骤则需要借助体积庞大的毛细管电泳仪以得到检测结果。因此，如果能有一个系统，能够将以上这几个步骤整合起来将所有的操作均交由机器自动化地完成，不仅可以大大减少人工操作，规避误操作风险，而且可以大大提高基因检测的分析速度和检测通量。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统，本发明能够将传统核酸检测的三个步骤—核酸提取、核酸扩增和毛细管电泳—集成在一起并全自动地完成这些步骤，对于用户来说，本发明只要求使用者输入待测样本(血样、尿样、痰样，法医鉴定时可能是其他更复杂的样本)即可得到基因分析结果。

[0005] 本发明所提供的用于核酸分析检测的集成化微流控系统，包括核酸提取与扩增模块和毛细管电泳模块；

[0006] 所述核酸提取与扩增模块包括设于基片上的核酸提取试剂入口、核酸扩增试剂入口、样本入口和PCR腔室；所述核酸提取试剂入口、所述样本入口和所述PCR腔室依次相连通，所述样本入口与所述PCR腔室之间设有流体控制阀Ⅰ，所述PCR腔室的入口端设有滤纸；所述PCR腔室的出口端依次与流体控制阀Ⅱ、连接结构和废液出口相连通；所述核酸扩增试剂入口与所述PCR腔室入口端的流体通道相连通，且所述核酸扩增试剂入口与所述流体通道之间设有流体控制阀Ⅲ；

[0007] 所述毛细管电泳模块包括设于基片上的毛细管电泳进样管道和毛细管电泳主管道，且所述毛细管电泳进样管道与所述毛细管电泳主管道之间为垂直相交设置；所述毛细管主管道的两端分别设有毛细管电泳阴极槽和毛细管电泳阳极槽；所述毛细管电泳进样管道上设有毛细管电泳废液储存槽；

[0008] 所述连接结构包括设于组成所述核酸提取与扩增模块的基片上的PCR产物转移腔室和电泳相关试剂储存腔室，所述PCR产物转移腔室与所述电泳相关试剂储存腔室之间通过3个隔膜分隔成独立的腔室，隔膜A设于所述PCR产物转移腔室的上部，隔膜B设于所述PCR产物转移腔室与所述电泳相关试剂储存腔室之间，隔膜C设于所述电泳相关试剂储存腔室的下部；

[0009] 所述核酸提取与扩增模块设于所述毛细管电泳模块的上部，且所述电泳相关试剂储存腔室设于毛细管电泳的进样储液池的上方，所述毛细管电泳的进样储液池设于所述毛细管电泳模块上且与所述毛细管电泳进样管道相连通。

[0010] 上述的集成化微流控系统中，所述隔膜可为一层隔膜或多层隔膜。

[0011] 上述的集成化微流控系统中，所述核酸提取与扩增模块可由两片所述基片热压键合得到；

[0012] 所述毛细管电泳模块可由两片基片热压键合得到。

[0013] 上述的集成化微流控系统中，所述核酸提取与扩增模块与所述毛细管电泳模块之间设有弹性中间层。

[0014] 上述的集成化微流控系统中，所述核酸提取与扩增模块具体由聚甲基丙烯酸甲酯制成；

[0015] 所述毛细管电泳模块具体由玻璃制成；

[0016] 所述弹性中间层具体由PDMS制成。

[0017] 上述的集成化微流控系统中，所述集成化微流控系统包括1～8个所述核酸提取与扩增模块，如2个对称设置的核酸提取与扩增模块；

[0018] 所述毛细管电泳模块1～8条所述毛细管电泳主管道，如2条对称设置的毛细管电泳主管道；

[0019] 每个所述核酸提取与扩增模块上的所述连接结构与1条所述毛细管电泳主管道相连通。

[0020] 本发明提供的用于核酸分析检测的集成化微流控系统，可以使传统的多个配套设备(PCR仪、毛细管电泳仪等)整合成一个设备，大大减小了设备的体积和维护成本，使基因检测更加高效、即时、便捷、准确。

附图说明

[0021] 图1为本发明用于核酸分析检测的集成化微流控系统的整体俯视图。

[0022] 图2为图1中装置的核酸提取与扩增模块组装轴测图。

[0023] 图3为图1中装置的核酸毛细管电泳模块组装轴测图。

[0024] 图4为图1中装置两个模块的组装轴测图。

[0025] 图5为本发明中提取扩增模块与毛细管电泳模块的连接结构示意图。

[0026] 图6为图5中的连接结构处于工作状态时的结构示意图。

[0027] 图7为本发明的整体操作流程图。

[0028] 图中的标注如下：

[0029] I：核酸提取与扩增模块；II：毛细管电泳模块；III：弹性中间层；I-U：核酸提取与扩增模块的上盖板；I-D：核酸提取与扩增模块的下底板；II-U：毛细管电泳模块的上盖板；II-D：毛细管电泳模块的下底板；

[0030] 1、核酸提取相关试剂流入口；2、核酸扩增相关试剂流入口；3、样本加入口；4、核酸扩增相关试剂流体控制阀；5、核酸提取相关试剂流体控制阀；6、滤纸；7、PCR腔室；8、PCR产物转移控制阀；9、连接结构；10、废液出口；11、阴极槽；12、毛细管电泳废液储液槽；13、阳极槽；14、毛细管电泳主管道；15、毛细管电泳进样管道；16、加样口密封膜。9-A：隔膜A；9-B：隔膜B；9-C：隔膜C；9-1：PCR产物转移腔室；9-2：电泳相关试剂储存腔室；9-II：毛细管电泳的进样储液池；9-III：联通孔。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

[0032] 本实施例采用滤纸对DNA的吸附与缠绕作用来提取样本中的DNA，相对应的提取相关试剂有氢氧化钠(NaOH)溶液、稀盐酸溶液(HCl)以及超纯水。该实施例采用PCR扩增的方式来扩增目标DNA片段，所使用的扩增相关试剂为预混好的PCR反应液。该实施例采用比较通用的十字交叉管道来进行毛细管电泳，以司法鉴定上常用的短串联重复序列分析(Short Tandem Repeat，STR)作为检测目标，所使用的电泳相关试剂为甲酰胺与商用STR标尺按一定比例的混合溶液。下面详细说明本发明的结构。

[0033] 图1为本发明的一种可行的实施方案。该装置整体分为两个模块：核酸提取与扩增模块I和毛细管电泳模块II。图4为两个模块的组装方式：核酸提取与扩增模块I置于毛细管电泳模块II的上方，两个模块之间嵌入一层弹性中间层III。弹性中间层III的使用取决于两个模块的材料：如果两个模块都是刚性材料的(如玻璃)，弹性中间层III可以填充材料接触面上的微观间隙使两个模块充分接触并对连接处起到很好的密封作用；如果有一模块已经使用弹性材料制作(如聚二甲基硅氧烷PDMS)，则可以不使用弹性中间层III。在本实施例中，核酸提取与扩增模块I的材料为PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯，有机玻璃)塑料，毛细管电泳模块II的材料为玻璃，弹性中间层III的材料为PDMS。

[0034] 图2为核酸提取与扩增模块I的组装结构，由两片PMMA塑料I-U与I-D通过热压键和而成。在两片PMMA中嵌有三片弹性膜(PDMS)形成流体控制阀4、5和8，阀的结构对整个微流控系统进行操作与控制。本发明中阀式结构可以采用传统的气动阀也可以采用机械顶针阀甚或是其他阀式结构，现在普遍常用的阀式结构均包含有弹性膜，因此在设计时必须予以考虑。本实施例采用的阀式结构为机械顶针阀，其中机械顶针由配套外部设备进行操作与控制，可以实现阀的封闭与打开功能。核酸提取与扩增模块的上盖板I-U与核酸提取与扩增模块的下底板I-D两个PMMA组装结构中部还镶嵌有一块滤纸6。滤纸6的作用是使用其对DNA的缠绕作用来将样本中的DNA截流在滤纸6上，而其他大颗粒杂质(如细胞碎屑、各种蛋白等)则会穿过滤纸6的纤维间隙而被冲走。滤纸6位于PCR腔室7的入口侧，其本身也属于PCR腔室7的一部分。配套硬件的加热部件位于PCR腔室7的正上方。当样本中的DNA缠绕在滤纸6上后，由核酸扩增相关试剂流入口2流入的PCR扩增试剂会充满PCR腔室7，同时将滤纸6完全浸润。在PCR过程中，滤纸6上的模板DNA会与PCR腔室7中的反应液进行反应完成DNA的扩增过程。PCR反应结束后，PCR腔室7中的PCR反应产物被抽吸至上下模块的连接结构9处。

[0035] 连接模块9此时的结构如图5所示。其被三个隔膜A9-A、隔膜B9-B和隔膜C9-C分为上下两个完全隔离的PCR产物转移腔室9-1与电泳相关试剂储存腔室9-2。其中电泳相关试剂储存腔室9-2中预存有电泳相关的试剂，在这里是用于保持DNA变性的甲酰胺与用于标识DNA长度的商业化标尺的混合溶液。PCR产物会被移至PCR产物转移腔室9-1中，由于隔膜B9-B的作用，其与电泳试剂是完全隔离的。在隔膜C9-C的下方即为弹性中间层III上的联通孔9-III。联通孔9-III与毛细管电泳模块II上的进样储液池9-II是无缝连接的，可以视为一个整体。电泳管道(包括毛细管电泳主管道14和毛细管电泳进样管道15)中灌有电泳的筛分介质(这里使用线性聚丙烯酰胺LPA)，筛分介质会充满毛细管电泳的储液池9-II与联通孔
9-III。但是由于隔膜C9-C的作用，LPA与电泳试剂也是完全分隔的。当PCR产物充满连接结构9中的PCR产物转移腔室9-1时，位于配套硬件上的进样电极IV将会运作，向下运动，将隔膜A9-A、隔膜B9-B、隔膜C9-C全部戳破，此时连接结构9的状态如图6所示。将隔膜A9-A、隔膜B9-B、隔膜C9-C戳破后，PCR产物转移腔室9-1、电泳相关试剂储存腔室9-2、联通孔9-III以及进样储液池9-II就完全连接在一起了。这样一来，PCR产物与电泳相关试剂就能够充分地混合在一起并且往下随着进样电极IV接触到筛分介质LPA。这时候，只要在进样电极IV上加上电压，就可以进入电泳分离检测的流程。

[0036] 图3为毛细管电泳模块的组装轴测图，这一模块由玻璃进行制作，所采用的是DNA芯片毛细管电泳比较普遍的十字交叉管道。在毛细管电泳模块的上盖板II-U上刻蚀出电泳管道(毛细管电泳主管道14和毛细管电泳进样管道15)并雕刻出毛细管电泳的储液池9-II、废液储液池12、阴极槽11和阳极槽13，之后用另一个玻璃作为毛细管电泳模块的下底板II-D，两片玻璃以加热键和的方式结合到一起。当这一装置被固定到其配套硬件上后，废液储液池12、阴极槽11和阳极槽13中的电泳电极会插入对应的储液池内并保持固定。但是毛细管电泳的进样储液池9-II的电极IV只有到PCR产物被移至连接结构9处时才会运作，戳破隔膜A9-A、隔膜B9-B、隔膜C9-C并插入毛细管电泳的储液池9-II内。

[0037] 图7为本发明装置的整体操作流程图。首先将整个装置组装好，即将核酸提取与扩增模块I、毛细管电泳模块II以及弹性中间层III按照图3所示叠放好。之后将叠放好的装置安装到相对应的配套硬件设备中，硬件设备应该能够将核酸提取与扩增模块I和毛细管电泳模块II牢牢压紧。这样整个装置便组装完成。然后我们进入到图7所示的操作流程。将采集到的样本加入到样本加入口3中，并用加样口密封膜16将加样口彻底密封。这两个步骤是整个DNA检测过程中仅有的人工操作步骤，剩下的工作将统统交给配套的硬件设备进行。

[0038] 按照图7所示，首先硬件设备会打开流体控制阀4与8，关闭流体控制阀5。预存在硬件设备上的细胞裂解液(这里是氢氧化钠NaOH)会从核酸提取相关试剂流入口1被抽吸至样本加入口3，使样本中的细胞充分裂解。之后，从核酸提取相关试剂流入口1会通入稀盐酸溶液中和细胞裂解液并将DNA溶液抽吸至PCR腔室7，在抽吸过程中，滤纸6的缠绕作用将模板DNA牢牢捕获在其纤维间隙中。接着，核酸提取相关试剂流入口1会通入超纯水对残留的杂质(如细胞碎片、各种蛋白等)进行清洗，废液从废液出口10流出。超纯水清洗过后，DNA的提取流程结束，流体控制阀4关闭，流体控制阀5和8打开，PCR反应液由核酸扩增相关试剂流入口2被抽吸至PCR腔室7，之后将流体控制阀4、5和8同时关闭，使PCR腔室7完全封闭。此时，温度循环开始运作进行PCR反应。待反应结束后，将PCR产物抽吸至连接结构9。此时，DNA扩增流程结束。待PCR产物充满连接结构上腔室9-1后，电泳进样电极IV运作，戳破隔膜A9-A、隔膜B9-B和隔膜C9-C，使PCR产物与电泳试剂充分混合。同时，毛细管电泳模块II上的其他电极也同时上电，按照经典的芯片毛细管电泳流程对PCR产物进行分离和检测。检测和电压控制均由配套硬件完成，检测完成后直接输出结果，完成自动化检测流程。

[0039] 按照这一流程，DNA检测的过程将变得十分高效、自动和便捷。