火焰南天竹的再生培养方法

摘要

本发明公开了一种火焰南天竹的再生培养方法，包括：以火焰南天竹的叶片为外植体，接种于含有TDZ和2,4‑D的再生培养基上进行再生培养，获得再生不定芽；将所述的再生不定芽置于芽伸长培养基上进行培养，获得无根植株；取所述无根植株的茎段进行生根培养，获得火焰南天竹再生植株。本发明建立了以叶片为外植体的火焰南天竹高效稳定的再生体系，通过改良培养基、培养条件，提高不定芽再生率，促进不定芽新梢生根，为火焰南天竹的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为火焰南天竹基因工程研究和基因转化提供基础。

权利要求

1.一种火焰南天竹的再生培养方法，其特征在于，包括：

(1)以火焰南天竹的叶片为外植体，接种于再生培养基上进行再生培养，获得再生不定芽；

(2)将所述的再生不定芽置于芽伸长培养基上进行培养，获得无根植株；

(3)取所述无根植株的茎段进行生根培养，获得火焰南天竹再生植株；

所述的再生培养基的配方为：改良MS+TDZ 1.5～2.5mg/L+2,4-D 0.2～0.3mg/L+蔗糖

25～35g/L+琼脂5～7g/L；所述的芽伸长培养基的配方为：改良MS+6-BA0.4～0.6mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5～7g/L；所述生根培养的培养基配方为：改良MS+NAA0.4～0.6mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5～7g/L；

所述的改良MS培养基由大量元素、微量元素和有机物质组成，其中，大量元素为：(NH4)

2SO4 580～620mg/L、CO(NH2)2480～520mg/L、KNO3930～970mg/L、CaCl2·2H2O 200～240mg/L、MgSO4·7H2O 175～195mg/L和KH2PO4 75～95mg/L；微量元素为：KI 0.35～0.45mg/L、H3BO3 3～3.2mg/L、MnSO4·4H2O 1.1～1.2mg/L、ZnSO4·7H2O 4.2～4.4mg/L、Na2MoO4·2H2O 

0.12～0.13mg/L、FeSO4·7H2O27.5～28mg/L和Na2-EDTA·2H2O 37～37.5mg/L；有机物质为：肌醇45～55mg/L、烟酸0.4～0.6mg/L、盐酸吡哆醇0.4～0.6mg/L、盐酸硫胺素0.05～

0.15mg/L、泛酸钙0.8～1.2mg/L、维生素C 1.8～2.2mg/L和甘氨酸1.8～2.2mg/L。

2.如权利要求1所述的火焰南天竹的再生培养方法，其特征在于，所述的叶片取自火焰南天竹的无菌组培苗。

3.如权利要求2所述的火焰南天竹的再生培养方法，其特征在于，选取30～35天叶龄的无菌组培苗上嫩绿、平展的叶片，去除叶尖和叶缘，剪成2～4mm2的叶块进行接种。

4.如权利要求1所述的火焰南天竹的再生培养方法，其特征在于，所述的再生培养为暗培养，所述暗培养的时间为12～21天。

说明书

火焰南天竹的再生培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及一种火焰南天竹的再生培养方法。

背景技术

[0002] 火焰南天竹是一种新型的绿化苗木，它冬季叶色娇艳似火深受人民的喜爱。由于火焰南天竹植株矮小，茎节短，节间只有普通南天竹的l/10，枝条细弱，扦插繁殖困难且繁殖速度慢。自从1995年上海植物园作为资源收集引进该品种以来，我国对火焰南天竹的研究才开始，生产上通常采用扦插育苗法，繁殖周期长，繁殖率极低，在生产中不能取得很好的效果。随着近年组织培养技术的不断发展，特别是利用植物组织培养及快速繁殖技术，进行苗木繁殖，更是对常规繁殖技术的一次重大革命，显示了其强大的生命力和广阔的发展前景。采用组织培养快繁技术繁殖既可以得到整齐一致的无性系材料，又能提高繁殖系数，在短期内获得大量苗木，克服常规繁殖的弊端，为火焰南天竹的快速推广和产业化提供保障，具有较为广泛的社会效益、生态效益和经济效益。

[0003] 但是，由于火焰南天竹的节间短、增殖系数低，传统的组织培养技术对于火焰南天竹的培养效果较差。而且，目前随着分子生物学研究的不断深入，越来越多的研究转向与对植物基因的研究，转基因的研究是其中的一个重点和热点问题，转基因的成功与否依赖一个高效、稳定的再生体系。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷而提供一种高效稳定的以叶片为外植体的火焰南天竹的再生培养方法。

[0005] 为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：

[0006] 本发明所述的火焰南天竹的再生培养方法，包括：

[0007] (1)以火焰南天竹的叶片为外植体，接种于含有TDZ和2,4-D的再生培养基上进行再生培养，获得再生不定芽；

[0008] (2)将所述的再生不定芽置于芽伸长培养基上进行培养，获得无根植株；

[0009] (3)取所述无根植株的茎段进行生根培养，获得火焰南天竹再生植株。

[0010] 本发明以叶片作为外植体，在再生培养基中添加TDZ和2,4-D两种植物生长调节剂，可诱导火焰南天竹的叶片产生再生不定芽，再生不定芽经伸长、生根后即可获得火焰南天竹再生植株。

[0011] 优选的，所述的叶片取自火焰南天竹的无菌组培苗。一般选取30～35天叶龄的无菌组培苗上嫩绿、平展的叶片，去除叶尖和叶缘，剪成2～4mm2的叶块进行接种。

[0012] 所述无菌组培苗的获取方法包括：取火焰南天竹的顶芽，消毒后置于分化培养基上进行培养，将分化的植株进行继代培养，获取无菌组培苗。优选的，所述的分化培养基为改良MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8，所述的继代培养的培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。

[0013] 所述的再生培养基的配方可以为：改良MS+TDZ+2,4-D+蔗糖25～35g/L+琼脂5～7g/L。具体的，再生培养基中，蔗糖的浓度可以为30g/L，琼脂的浓度可以为6g/L。

[0014] 再生培养时，使用合适的浓度、比例的TDZ和2,4-D，能够提高不定芽的再生率及每外植体的再生芽数，优选的，所述再生培养基中，TDZ的浓度为1.5～2.5mg/L，2,4-D的浓度为0.2～0.3mg/L。进一步优选的，TDZ的浓度为2.5mg/L，2,4-D的浓度为0.2mg/L；或TDZ的浓度为1.5mg/L，2,4-D的浓度为0.2mg/L。采用前者的植物生长调节剂组合，不定芽再生率可达95.8％，采用后者的植物生长调节剂组合，可以维持较高的不定芽再生率(81.5％)的同时减少玻璃化芽。

[0015] 优选的，所述的再生培养为暗培养，所述暗培养的时间为12～21天。更优选的，所述暗培养的时间为14天。

[0016] 再生不定芽一般长至1cm左右，即可接种到芽伸长培养基上进行培养。

[0017] 优选的，所述的芽伸长培养基含有6-BA0.4～0.6mg/L和NAA0.1～0.2mg/L。进一步优选的，所述的芽伸长培养基含有6-BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L。

[0018] 所述的芽伸长培养基的配方可以为：改良MS+0.4～0.6mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5～7g/L。具体的，芽伸长培养基中，蔗糖的浓度可以为30g/L，琼脂的浓度可以为6g/L。

[0019] 一般，再生不定芽伸长培养成3cm左右的无根植株时，即可取无根植株1～1.5cm的茎段进行生根培养。

[0020] 优选的，所述的生根培养的培养基为添加植物生长调节剂、蔗糖和琼脂的改良MS培养基，所述的改良MS培养基以水为溶剂，由大量元素、微量元素和有机物质组成，其中，[0021] 大量元素包括：(NH4)2SO4580～620mg/L、CO(NH2)480～520mg/L、KNO3930～970mg/L、CaCl2·2H2O200～240mg/L、MgSO4·7H2O175～195mg/L和KH2PO475～95mg/L；

[0022] 微量元素包括：KI0.35～0.45mg/L、H3BO33～3.2mg/L、MnSO4·4H2O1.1～1.2mg/L、ZnSO4·7H2O4.2～4.4mg/L、Na2MoO4·2H2O0.12～0.13mg/L、FeSO4·7H2O27.5～28mg/L和Na2-EDTA·2H2O37～37.5mg/L；

[0023] 有机物质包括：肌醇45～55mg/L、烟酸0.4～0.6mg/L、盐酸吡哆醇0.4～0.6mg/L、盐酸硫胺素0.05～0.15mg/L、泛酸钙0.8～1.2mg/L、维生素C1.8～2.2mg/L和甘氨酸1.8～2.2mg/L。

[0024] 进一步优选的，所述的改良MS的组成为：

[0025] 大量元素：(NH4)2SO4600mg/L、CO(NH2)500mg/L、KNO3950mg/L、CaCl2·2H2O220mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L和KH2PO485mg/L；

[0026] 微量元素：KI0.41mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·4H2O1.15mg/L、ZnSO4·7H2O4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O0.125mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L和Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；

[0027] 有机物质：肌醇50mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、泛酸钙1mg/L、维生素C2mg/L和甘氨酸2.0mg/L。

[0028] 优选的，生根培养基中，所述的植物生长调节剂为NAA，浓度为0.4～0.6mg/L。进一步优选的，生根培养基中，NAA的浓度为0.4mg/L。

[0029] 生根培养基中，蔗糖的浓度为25～35g/L，琼脂的浓度为5～7g/L，进一步，蔗糖的浓度可以为30g/L，琼脂的浓度可以为6g/L。

[0030] 本发明中，再生培养基、芽伸长培养基、分化培养基、继代培养基中涉及的改良MS，均采用上述的改良MS的配方。

[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0032] 本发明建立了以叶片为外植体的火焰南天竹高效稳定的再生体系，通过改良培养基、培养条件，提高不定芽再生率(可达95.8％)，促进不定芽新梢生根，为火焰南天竹的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为火焰南天竹基因工程研究和基因转化提供基础。

附图说明

[0033] 图1为添加TDZ2.5mg/L和2,4-D0.2mg/L的再生培养基中叶片再生情况图；

[0034] 图2为添加TDZ1.5mg/L和2,4-D0.2mg/L的再生培养基中叶片再生情况图；

[0035] 图3为添加TDZ2.5mg/L和2,4-D0.2mg/L的再生培养基中平均每叶块再生芽数图；

[0036] 图4为添加TDZ1.5mg/L和2,4-D0.2mg/L的再生培养基中平均每叶块再生芽数图。

具体实施方式

[0037] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

[0038] 实施例1

[0039] 火焰南天竹的再生培养方法如下:

[0040] 1、无菌组培苗的获得

[0041] 以火焰南天竹生长健壮的枝条上饱满的顶芽为外植体，流水冲洗3小时，升汞杀菌8分钟后用无菌水冲洗6～8次，接取种到分化培养基上，25℃暗培养5天以后25μmol·m-2·s-1光下培养，光周期每天8小时暗培养，16小时光照。外植体接种15天左右芽开始萌发，40天后分化成为2-3厘米高的植株。将分化的小苗接种于继代培养基中，每35天继代一次，获得无菌组培苗。培养基在121℃条件下灭菌20min。继代培养的温度为(25±2)℃，光照强度为
25μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照，8小时暗培养。

[0042] 分化培养基的组成为：改良MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。

[0043] 继代培养基的组成为：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。

[0044] 改良MS以水为溶剂，组成为：

[0045] 大量元素：(NH4)2SO4600mg/L、CO(NH2)500mg/L、KNO3950mg/L、CaCl2·2H2O220mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L和KH2PO485mg/L；

[0046] 微量元素：KI0.41mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·4H2O1.15mg/L、ZnSO4·7H2O4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O0.125mg/L和铁盐：FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；

[0047] 有机物质：肌醇50mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L、泛酸钙(维生素B5)1mg/L、维生素C2mg/L和甘氨酸2.0mg/L。

[0048] 根据火焰南天竹生长特点，我们将组培中常用的MS培养基进行了改良，由于国家对于NH4NO3的购买进行管制，不利于大量的组培生产，我们将MS的NH4NO3用(NH4)2SO4和尿素来替代。将NH4NO3替代后，培养基配方中的 浓度升高，因此将原MS培养基中其他元素含量进行调配；MS微量元素中的CuSO4和CoCl2属于重金属元素，加入后对火焰南天竹的培养不利，因此去掉微量元素中的CuSO4和CoCl2；火焰南天竹在培养中容易褐化，在培养基中加入VB5和VC能够防止褐化，提高茎尖的成活率。改良后的培养基成分不同于传统的培养基，能够增加火焰南天竹茎尖的成活率。

[0049] 6-BA：6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。将6-BA配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

[0050] IBA：IBA是吲哚丁酸，是一种生长素类物质。能够促进植物主根生长，提高发芽率，成活率，能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根。将IBA配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

[0051] 2、火焰南天竹叶片不定芽分化

[0052] 取30～35天叶龄的组培苗上嫩绿、平展的叶片剪去叶尖和叶缘，剪成大小为3mm2均匀的叶块，分别做以下处理：

[0053] (1)将剪好的叶块分别接种于附加不同浓度TDZ、2,4-D的再生培养基上。25℃再生培养35天以后，再生培养为暗培养，观察叶块的生长状态，分析不同的植物生长调节剂，以及植物生长调节剂的浓度比例对火焰南天竹叶片不定芽再生的影响。

[0054] (2)将剪好的叶块分别接种于附加TDZ(2.5mg/L)，2,4-D(0.2mg/L)的再生培养基上。分别进行不暗培养、暗培养7天、暗培养14天和暗培养21天的处理，培养的温度为25℃。分析暗培养的时间长短对火焰南天竹叶片不定芽再生造成的影响。

[0055] (3)将剪好的叶块以近轴面贴近培养基(正放)、远轴面贴近培养基(反放)2种放置方式接种于附加TDZ(2.5mg/L)，2,4-D(0.2mg/L)的再生培养基上进行再生培养，再生培养的温度为25℃，再生培养为暗培养。分析研究不同的叶片放置方式对火焰南天竹不定芽再生的影响。

[0056] 再生培养基的组成为：改良MS+TDZ+2,4-D+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。TDZ和2,4-D的浓度根据上述处理而定。

[0057] 剪好的叶块作为外植体均接种于250mL广口玻璃瓶中，每处理5瓶每个处理重复3次。

[0058] 3、火焰南天竹再生不定芽的新梢伸长

[0059] 再生培养45天以后，火焰南天竹的不定芽(或称为再生不定芽)一般长至1cm左右，将这种不定芽接种到芽伸长培养基中，不定芽进行大约30天的伸长生长，伸长生长的温度为25℃，光照强度为25μmol·m-2·s-1，长成株高约3cm的植株。

[0060] 芽伸长培养基的组成为：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。

[0061] 4、火焰南天竹再生不定芽生根培养

[0062] 再生不定芽经过伸长生长的植株，把新梢剪成1～1.5cm长的茎段接种到生根培养基中进行生根培养，生根培养的温度为25℃，光照强度为25μmol·m-2·s-1。生根培养基的组成为：基本培养基+植物生长调节剂+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8。基本培养基选用MS和改良MS两种，基本培养基中分别添加不同浓度比例的IBA和NAA，每处理5瓶，每瓶5个植株，培养45d后统计再生不定芽生根率。

[0063] 5、评价指标与数据调查

[0064] 调查获得的数据用spss软件进行统计分析，平均值进行Duncan’s测验，得出显著性差异。基本数据按照以下公式计算：

[0065] 不定芽再生率＝(再生不定芽叶块总数/接种叶块总数)×100％

[0066] 平均每外植体再生芽数＝(叶块再生不定芽总数/再生不定芽叶块数[0067] 再生不定芽生根率＝(所有生根的再生不定芽数/所有接种的再生不定芽数)×100％

[0068] 6、结果与分析

[0069] (1)不同的植物生长调节剂以及浓度比例对火焰南天竹不定芽再生的影响[0070] 表1 植物生长调节剂对火焰南天竹叶片不定芽再生的影响

[0071]

[0072] 不同植物生长调节剂种类以及浓度比例对火焰南天竹叶片的不定芽分化有重要影响(表1)。TDZ与2,4-D组合对火焰南天竹不定芽的诱导效果要好，用TDZ2.5mg/L和2,4-D0.2mg/L的组合最适于火焰南天竹叶片不定芽分化，不定芽再生率可达95.8％，平均每叶片再生芽数也较多(图1、图3)，但是实验中发现，这个植物生长调节剂的浓度会造成部分芽玻璃化，玻璃化芽不能够生根，因此不能够用于后续试验。但是当TDZ浓度达到1.5mg/L时与2,4-D0.2mg/L配合使用不定芽再生率可以达到81.5％，而且在这个植物生长调节剂浓度的培养基中玻璃化芽明显减少。因此，在实验过程中，实际可以选择这个植物生长调节剂浓度来做火焰南天竹的再生，虽然不定芽再生率有一定程度的降低，但是，再生芽不发生玻璃化现象，而且平均每叶块再生芽数也能达到4.1个。

[0073] (2)暗培养时间对火焰南天竹不定芽再生的影响

[0074] 暗培养时间的长短对火焰南天竹不定芽的再生有显著影响。不暗培养条件下，不定芽再生率为0，暗培养时间短，不定芽再生率低，暗培养时间过长，不定芽再生率也会降低，最适不定芽再生的暗培养时间为14天，不定芽再生率可达85.2％(表2)。

[0075] 表2 暗培养时间对火焰南天竹叶片不定芽再生的影响

[0076]

[0077] 注：不同字母表示经Duncan’s测验，P＝0.05水平差异显著。

[0078] (3)叶片放置方式对火焰南天竹不定芽再生的影响

[0079] 本实验中，叶块以正放和反放两种不同方式接种，结果表明再生率没有显著差异，由此说明叶片不同的放置方式对火焰南天竹不定芽的再生没有影响(表3)。

[0080] 表3 叶片不同放置方式对火焰南天竹不定芽再生的影响

[0081]

[0082] (4)不同植物生长调节剂对火焰南天竹再生不定芽的离体新梢生根的影响[0083] 表4 不同生长调剂对火焰南天竹再生不定芽的离体新梢生根的影响[0084]

[0085] 离体新梢生根实验表明，植物生长调节剂能明显促进茎段不定根的形成，火焰南天竹在添加NAA0.4mg/L的生根培养基中生根最早，接种后20d基部开始形成不定根。在添加IBA的培养基中根部形成大量愈伤，不易生根，说明NAA比IBA更适合火焰南天竹诱导不定根。基本培养基对生根也有明显的影响，结果表明，改良MS培养基有利于火焰南天竹生根。因此火焰南天竹离体新梢生根的生根培养基中，改良MS较普通MS更加适宜，能够促进生根，从而提高成活率，植物生长调节剂选用NAA效果更好，浓度较佳的为0.4mg/L(表4)。