一种快速繁殖茅苍术试管苗的方法

摘要

本发明公开一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，它以茅苍术种子作为外植体，用二氧化氯消毒剂消毒后，在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，将诱导出的愈伤组织进一步增殖后，转入愈伤组织分化培养基上培养分化出茅苍术不定芽，再将茅术不定芽进行壮苗生根培养，最后形成茅苍术组培苗。与现有技术相比，本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，运输方便，移栽成活率高等优势。

权利要求

1.一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以茅苍术成熟种子为外植体，先后用去污剂和水清洗10min后，放入75％体积分数的乙醇水溶液中浸泡45～60s，取出后于消毒剂中浸泡15～20min，再用无菌水冲洗3～5次；

(2)将经步骤(1)处理后的茅苍术种子接种于愈伤组织诱导培养基上，经15天暗培养后，正常培养10～15天；正常培养结束后，茅苍术种子萌发并被诱导成直径0.2～0.4cm的茅苍术愈伤组织；

(3)将步骤(2)中得到的茅苍术愈伤组织置于愈伤组织继代增殖培养基中培养20～25天；

(4)将经步骤(3)培养后的茅苍术愈伤组织接种到分化培养基中培养60～70天，培养结束后，茅苍术愈伤组织分化形成完整的不定芽；

(5)将步骤(4)中所得的茅苍术的完整不定芽，转接到壮苗生根培养基中培养50～60d，培养结束后，茅苍术的完整不定芽形成茅苍术小苗；

(6)选取步骤(5)中得到的苗高5～7cm，带有4～5条根的茅苍术小苗移入温室内驯化培养10天，用水清洗去除培养基后，移植于铺有栽培基质的苗床上；

其中，

步骤(2)中，暗培养的条件为25～28℃，正常培养的条件为25～28℃，光照强度为1000～1500勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的愈伤组织诱导培养基的配方为：2,4-二氯苯氧乙酸1～3mg/L+激动素0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 

5.6～5.8；

步骤(3)中，培养条件为25～28℃下，光照强度1000～1500勒克斯，光照时间11～13h/d；其中，所述的愈伤组织继代增殖培养基的配方为：2,4-二氯苯氧乙酸0.5～1.5mg/L+6-苄氨基嘌呤0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+蛋白胨0.5～1g/L+琼脂4.5～6g/L+pH 

5.6～5.8；

步骤(4)中，培养条件为25～28℃下，光照强度1000～1500勒克斯，光照时间11～13h/d；其中，所述的分化培养基的配方为：6-苄氨基嘌呤0.5～1mg/L+萘乙酸0～0.3mg/L+蔗糖

25～30g/L+ER培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；

步骤(5)中，所述的壮苗生根培养基的配方为：萘乙酸0.1～0.3mg/L+香蕉汁60～80g/L+1/2MS+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8。

2.根据权利要求1所述的高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的去污剂为洗衣粉，所述的消毒剂为100ppm二氧化氯消毒剂。

3.根据权利要求1所述的高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的栽培基质由田园土、泥炭土和蛭石按照体积比1：1：0.5的比例混合而成。

说明书

一种快速繁殖茅苍术试管苗的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物的栽培技术领域，具体涉及一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法。

背景技术

[0002] 茅苍术(Rhizoma Areactylodis Lanceae)，也称之为南苍术，为菊科植物，喜凉爽较干燥气候，怕高温高湿，表面灰棕色，有皱纹、横曲纹及须根痕，顶端具茎痛。质坚实，断面黄白色或灰白色，有多数红棕色油室。主要分布于江苏、湖北和河南等省份，江苏茅山地区是茅苍术道地药材的产区。气香特异，味微甘、辛、苦，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒感冒、脾胃不和，泄泻、湿热证、湿痹和日疾、暑温、痢疾、时行外感、黄白带下等症。由于苍术主产区常年不规范采挖，野生资源逐年下降，加上国家加大了野生药材的保护政策，限制采挖、运输，导致苍术的市场资源量逐年减小，同时，苍术的应用却越来越广泛，供应缺口逐年加大，因此人工栽培成了一条扩大供应的重要途径，但在栽培中苍术种子成苗率低，长期无性繁殖导致其药用价值退化，病害加重，产量下降，利用组培方式进行茅苍术种苗繁殖和复壮，有广阔市场前景。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，以解决现有技术存在的成苗率低，长期无性繁殖导致其药用价值退化等问题。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0005] 一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，它包括如下步骤：

[0006] (1)以茅苍术成熟种子为外植体，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗10min，带入接种室，在超净工作台上用75％体积分数的乙醇水溶液浸泡45～60s，再放置于消毒剂中浸泡15～20分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。

[0007] (2)将经步骤(1)处理后的茅苍术种子接种于愈伤组织诱导培养基上，经15天暗培养后，正常培养10～15天；正常培养结束后，茅苍术种子萌发并被诱导成直径0.2～0.4cm的茅苍术愈伤组织；

[0008] (3)将步骤(2)中得到的茅苍术愈伤组织置于愈伤组织继代增殖培养基中培养20～25天；经该阶段培养后，愈伤组织达到0.6～0.8cm，且质地较硬，表面呈现绿色，易于分化；

[0009] (4)将经步骤(3)培养后的茅苍术愈伤组织接种到分化培养基中培养60～70天，培养结束后，茅苍术愈伤组织分化形成完整的不定芽，每个愈伤组织块形成5～8个不定芽，；

[0010] (5)将步骤(4)中所得的茅苍术的完整不定芽，转接到壮苗生根培养基中培养50～60d，培养结束后，茅苍术的完整不定芽形成完整健壮的茅苍术小苗；

[0011] (6)选取步骤(5)中得到的苗高5～7cm，带有4～5条健壮的根的茅苍术小苗移入温室内驯化培养10天，用水清洗去除培养基后，移植于铺有栽培基质的苗床上。

[0012] 步骤(1)中，所述的去污剂为普通洗衣粉，所述的消毒剂为100ppm二氧化氯消毒剂；其中，优选的消毒剂为必洁仕牌二氧化氯消毒剂。

[0013] 步骤(2)中，暗培养的条件为25～28℃，正常培养的条件为25～28℃，光照强度1000～1500勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的愈伤组织诱导培养基的配方为：2,
4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1～3mg/L+激动素(KT)0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；愈伤组织诱导培养基的优选配方为2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.5mg/L+激动素(KT)0.4mg/L+蔗糖30g/L+MS培养基+琼脂6g/L+pH 5.8。

[0014] 步骤(3)中，培养条件为25～28℃下，光照强度度1000～1500勒克斯，光照时间11～13h/d；其中，所述的愈伤组织继代增殖培养基的配方为：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5～1.5mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+蛋白胨0.5～1g/L+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；愈伤组织继代增殖培养基的优选配方为：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L+蔗糖30g/L+MS培养基+蛋白胨0.5g/L+琼脂6g/L+pH 5.8。

[0015] 步骤(4)中，培养条件为25～28℃下，光照强度1000～1500勒克斯，光照时间11～13h/d；其中，所述的分化培养基的配方为：6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5～1mg/L+萘乙酸(NAA)0～0.3mg/L+蔗糖25～30g/L+ER培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；愈伤组织分化培养基的优选配方为：6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.8mg/L+萘乙酸(NAA)0.2mg/L+蔗糖30g/L+ER培养基+琼脂6g/L+pH 5.8。

[0016] 步骤(5)中，所述的壮苗生根培养基的配方为：萘乙酸(NAA)0.1～0.3mg/L+香蕉汁60～80g/L+1/2MS++琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；其中，壮苗生根培养基的优选配方为：萘乙酸(NAA)0.1mg/L+香蕉汁60g/L+1/2MS++琼脂6g/L+pH 5.8。

[0017] 步骤(6)中，所述的栽培基质由田园土、泥炭土和蛭石按照1：1：0.5的比例(体积比)混合而成。

[0018] 有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

[0019] 1、本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，运输方便，移栽成活率高等优势。

[0020] 2、步骤(1)中采用100ppm二氧化氯消毒剂消毒茅苍术种子，与现有消毒方法相比，具有消毒更彻底，消毒后消毒剂残留少，外植体受伤害小，恢复快，长势好。

[0021] 4、步骤(4)所述的分化培养基中，采用ER培养基并配以适当生长素和细胞分裂素，与传统的壮苗培养基相比，该方法能更好更快的促进茅苍术愈伤组织分化，分化率高。

具体实施方式

[0022] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0023] 实施例1：一种高效快速繁殖茅苍术试管苗的方法，该方法包括以下步骤：

[0024] (1)以茅苍术成熟种子为外植体，用去污剂清洗10min，再用流水冲洗10min，带入接种室，在超净工作台上用75％体积分数酒精浸泡55s左右，再放置于100ppm二氧化氯消毒剂(水剂)稀释液中浸泡15～20min；无菌水冲洗3～5次，接种污染率低于20％。

[0025] (2)将步骤(1)得到茅苍术种子，接种于愈伤组织诱导培养基上，前15天给予暗培养，以后光照度为1200勒克斯、光照时间12h/d；25～30d后种子萌并被诱导成直径0.3-0.5cm的愈伤组织，在所述的固体培养基组成为：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.5mg/L+激动素(KT)0.4mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+MS培养基+琼脂6g/L+pH 5.8；

[0026] (3)将步骤(2)得到的茅苍术愈伤组织置于增殖培养基中，在25～28℃、光照度1200勒克斯、光照时间12h/d的条件下培养20～25d，愈伤组织达到0.8～1cm，且质地较硬，表面呈现绿色，易于分化；其中，所述的愈伤组织继代增殖培养基组成为：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L+蛋白胨0.5g/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+MS培养基+琼脂6g/L+pH 5.8；

[0027] (4)将步骤(3)中得到的茅苍术愈伤组织接种到分化培养基中，在25～28℃、光照度1300勒克斯、光照时间12h/d的条件下培养60～70天，茅苍术愈伤组织分化形成完整的不定芽，每个愈伤组织块形成5～8个不定芽，分化率达70％。其中，所述的分化培养基组成为：6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.8mg/L+萘乙酸(NAA)0.2mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+ER培养基+琼脂6g/L+pH 5.8；

[0028] (5)将步骤(4)得到的茅苍术的完整不定芽在超净工作台上单个分开，转接到壮苗生根培养基中进行培养50～60d，不定芽形成完整健壮的小苗，苗高5～7cm，带有4～5条健壮的根，可以用于驯化移栽，其中所述的壮苗生根培养基为萘乙酸(NAA)0.1mg/L+香蕉汁60g/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+1/2MS+琼脂6g/L+pH 5.8；

[0029] (6)春季5-6月，将步骤(4)得到的茅苍术小苗移入温室内驯化培养10d，然后将其从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，移置铺有栽培基质的苗床上，栽培基质为田园土：泥炭土：蛭石＝1：1：0.5(体积比)，移栽成活率90％以上。

[0030] 实施例2：

[0031] 与实施例1基本相同，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中种子愈伤组织诱导，愈伤组织增殖、愈伤组织分化、壮苗生根四个阶段分别以表1所列培养基组合进行筛选，以优选最适培养基组合配方。表1说明如下：

[0032] ①培养基配方优化主要是设计不同的基础培养基、激素浓度等对培养基进行了优化设计,培养环境为温度25℃、光照度1000～1500勒克斯、光照时间12h/d培养室内。②针对生产，不同的培养阶段设计了培养基配方，种子播愈伤组织诱导种阶段主要观察愈伤组织诱导的快慢、质地、颜色(浅绿为佳)等指标判断配方是否合理；愈伤组织增殖阶段主要观察愈伤组织增不停地的快慢、质地、颜色(浅绿为佳)等指标判断配方是否合理；愈伤组织分化阶数段主要观察愈伤组织分化不定芽的能力、不定芽的粗壮度、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏；壮苗生根培养阶段，主要通过观察茅苍术小苗的生长势、生根效率，根的粗壮度、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，并用“★”和“☆”的多少代表配方的好坏，★越多表示越好，☆比★要低一个等次。

[0033] 表1培养基配方筛选

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[0040] 试验表明，种子愈伤组织诱导阶段(步骤2)9种配方组合中，基础培养基和激素组合范围为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1～3mg/L+激动素(KT)0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8；在此范围内，培养20～30d，超过80％种子诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率率高、生长快且整齐性好，是较适宜的配方组合；愈伤组织增殖培养阶段(步骤3)18种配方组合中，基础培养基、激素组合范围为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5～1.5mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+MS培养基+蛋白胨0.5～1g/L+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8，在此范围内，愈伤组织长势良好、生长速度快，培养20～25d，大部分愈伤组织直径达到0.6～0.8cm；愈伤组织分化阶段(步骤4)27种配方组合中，基础培养基、激素组合范围为6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5～1mg/L+萘乙酸(NAA)0～
0.3mg/L+蔗糖25～30g/L+ER培养基+琼脂4.5～6g/L+pH5.6～5.8，在此范围内培养，愈伤组织不定芽分化率高，不定芽粗壮，颜色翠绿，是比较适宜的组合配方。壮苗生根培养阶段(步骤5)，结果表明，萘乙酸(NAA)0.1～0.3mg/L+香蕉汁60～80g/L+1/2MS++琼脂4.5～6g/L+pH5.6～5.8为优选培养基配方组合，培养50～60d后，苗长至高5～7cm，带有4～5条健壮的根，可进行移栽。

[0041] 实施例3：与实施例1基本相同，为了更快获得茅苍术组培苗，可以省略步骤3，即步骤2中培养得到的愈伤组织可以直接通过步骤4分化成苗。

[0042] 实施例4：与实施例1基本相同，为了获得更多茅苍术组培苗，可以多次重复步骤3，即茅苍术愈伤组织可以通过重复步骤3的培养获得到更多愈伤组织，然后再通过步骤4分化成苗，便可以获得更多茅苍术种苗。