一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法及应用

摘要

本发明提供了一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法及应用，所述的冷冻保存液包括牛血清白蛋白、海藻糖，乙二醇、卵磷脂和胎牛血清。同时，本发明还提供了一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法，利用该方法在不使用液氮降温情况下的速率较低降温方式，可最大限度降低冰晶对细胞的损伤，保证复苏后的高存活率和增殖率，使温和的冷冻保存成为可能，为达氏鲟精原细胞移植提供长期稳定的细胞供应。

权利要求

1.一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括：其余为L-15培养液；

所述的冷冻保存液pH为7.5-8.5。

2.根据权利要求1所述的一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液：其余为L-15培养液；

所述的冷冻保存液pH为7.7-8.3。

3.根据权利要求1所述的一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液：其余为L-15培养液；

所述的冷冻保存液pH为7.8-8.2。

4.根据权利要求1所述的一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液：其余为L-15培养液；

所述的冷冻保存液pH为7.8-8.1。

5.根据权利要求1所述的一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液：其余为L-15培养液；

所述的冷冻保存液pH为8.0。

6.达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：

1)清洗干净的精巢组织移到另一培养皿中，将精巢组织剪碎至小块；以消化液：组织块＝4:1(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次；

2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μm滤网过滤；4℃，200g离心5min，冷冻保存液重悬；

3)用冷冻保存液以1×105个/ml稀释细胞；

4)取稀释到标准浓度的细胞悬液5ml放置于冰上平衡20min，分装至冻存管中；

5)程序降温：降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，-80℃平衡30min后放入液氮中，在-196℃中保存；

所述的冷冻保存液为权利要求1所述。

7.权利要求1所述的冷冻保存液在冷冻保存达氏鲟精巢细胞中的应用。

说明书

一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法及

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及达氏鲟的细胞保存技术领域，具体涉及一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法及应用。

背景技术

[0002] 在雄性性腺中，精子起源于精原干细胞(SSCs)，精原干细胞既具有自我复制能力，又具有分化成为成熟精子的能力。哺乳动物的精子发生于生精小管内。在鼠科中，人们已经在功能上证实部分A型精原细胞存在于输精管基底膜，并通过化疗、放疗和移植技术完成了具有干性的评估。在鱼的精巢内，精子发生在精小囊中。生殖细胞存在于支持细胞的胞质延伸形成精小囊内，并且每个精小囊生殖细胞增殖的同时发生分化。这种单个生殖细胞，叫做A型精原细胞，人们推测这些细胞的亚群表现出干细胞效力。2006 年，日本学者Okutsu等建立了虹鳟的精原细胞移植技术。将A型精原细胞的一部分移植到腹膜受体虹鳟胚胎，向受体胚胎生殖腺移动，并在其内增殖，然后产生了大量功能性的精子。这些结果在功能上证实鱼精巢中存在精原干细胞。此外，Okutsu还发现精原细胞合并到雌鱼卵巢中，分化为功能齐全的卵，表明整合的精原细胞具有双性潜能。最后，正常生物个体可以通过来自供体精原细胞形成的配子受精产生。2007年，代理亲鱼技术建立，可将精原细胞异种移植入近缘种。通过这种技术，可将苗种生产昂贵、世代时间长的大型鱼类的精原细胞移植到亲缘关系相近但体型较小，世代时间较短的鱼种中，缩短世代时间。用于移植的精原细胞需要保证稳定供应，并具有一致品质。通常，从活体上获取的组织在维持其技能的状态下储藏是有期限的，为了延长储藏时间，可利用细胞冷冻保存方法。

[0003] 目前尚未见达氏鲟精巢细胞冷冻保存的相关报道。本发明提供的达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及保存方法，在达氏鲟精巢细胞超低温保存过程中，可最大限度降低冰晶对细胞的损伤。保证复苏后的高存活率和增殖率，为今后达氏鲟精原细胞移植提供基础。

发明内容

[0004] 本发明目的是在于提供了一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，配方合理，使用方便，适合对达氏鲟精巢细胞的保存，是达氏鲟精巢细胞超低温保存和进行细胞移植所必须的一种溶液。

[0005] 本发明另一个目的是提供一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法，利用该方法对达氏鲟精巢细胞进行冷冻保存，能够提高精巢细胞存活率，为达氏鲟精原细胞移植提供长期稳定的细胞供应。

[0006] 本发明最后一个目的是提供一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液在达氏鲟精巢细胞冷冻保存中的应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0008] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括：

[0009]

[0010] 其余为L-15培养液；

[0011] 所述的冷冻保存液pH为7.5-8.5。

[0012] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括(较好范围)：

[0013]

[0014] 其余为L-15培养液；

[0015] 所述的冷冻保存液pH为7.7-8.3。

[0016] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括(优选范围)：

[0017]

[0018] 其余为L-15培养液；

[0019] 所述的冷冻保存液pH为7.8-8.2。

[0020] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括(最佳范围)：

[0021]

[0022] 其余为L-15培养液；

[0023] 所述的冷冻保存液pH为7.8-8.1。

[0024] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存液，包括(最佳值)：

[0025]

[0026] 其余为L-15培养液；

[0027] 所述的冷冻保存液pH为8.0。

[0028] 以上保存液的pH通过1M NaHCO3或25mM HEPES调节。

[0029] 一种达氏鲟精巢细胞冻存稀释液的制备方法，其步骤是：

[0030] (1)用移液枪精确量取配置稀释液所需各液体组分的体积：

[0031] 根据公式：量取体积＝配方浓度×稀释液总体积

[0032] 1)量取L-15培养液加入到离心管中，体积约为需要配制稀释液体积的三分之二；

[0033] 2)根据需要配制稀释液体积，量取乙二醇、胎牛血清所需体积加入到L-15培养液中。

[0034] (2)精确称取稀释液所需固体组分的重量，精确度为0.001g：

[0035] 根据公式：量取重量＝配方浓度×稀释液总体积

[0036] 根据需要配制稀释液体积，称取牛血清白蛋白、海藻糖、卵磷脂，溶于稀释液中。

[0037] (3)加L-15培养液定容至所需溶液体积。0.2μm滤膜过滤除菌。现用现配。

[0038] 达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：

[0039] 1)清洗干净的精巢组织移到另一培养皿中，将精巢组织剪碎至小块。称量组织块，以消化液：组织块＝4:1(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min 吹打一次。

[0040] 2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μ m滤网过滤。4℃，200g离心5min。冷冻保存液重悬。

[0041] 3)用冷冻保存液以1×105个/ml稀释细胞。

[0042] 4)取稀释到标准浓度的细胞悬液5ml放置于冰上平衡20min，分装至冻存管中；

[0043] 5)程序降温：降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，-80℃平衡30min后放入液氮中，在-196℃中保存。

[0044] 一种达氏鲟冷冻保存液在冷冻保存达氏鲟精巢细胞中的应用，包括利用本发明的提供的冷冻保存液配方进行达氏鲟的精巢细胞的冷冻保存。

[0045] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0046] 到目前为止，常用的细胞冷冻方法平衡时间短，降温速率较快。由于精巢中精原细胞个体较大，含水量高，降温速率过快会使细胞中的水分形成冰晶刺伤细胞，从而导致细胞死亡。因此这些方法不能保证精原细胞具有高存活率和复苏增殖率，精原细胞的冷冻保存需要更温和的条件。目前常用程序降温仪控制较慢的降温速率，但程序降温仪液氮消耗量大，并且费时。本发明可提供一种不使用液氮降温情况下的速率较低降温方式，使温和的冷冻保存成为可能，并使其复苏后具有较高的存活率和增殖率。

[0047]

具体实施方式

[0048] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特备说明，均来自于商业渠道。

[0049] 实施例1：

[0050] 一种达氏鲟冷冻稀释液，包括：

[0051]

[0052]

[0053] 其余为L-15培养液，保存液pH为8.0。

[0054] 以上保存液的pH通过1M NaHCO3或25mM HEPES调节。

[0055] 所述的达氏鲟冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：

[0056] (1)用移液枪精确量取配置稀释液所需各液体组分的体积：

[0057] 1)量取3ml L-15培养液加入到离心管中。

[0058] 2)量取1ml胎牛血清，500μl乙二醇，加入L-15培养液中。

[0059] (2)精确称取稀释液所需固体组分的重量，精确度为0.1mg：牛血清白蛋白250.0mg，海藻糖94.6mg，卵磷脂400.0mg，溶于稀释液中。

[0060] (3)最后加L-15培养液定容至5ml。0.2μm滤膜过滤除菌。现用现配。

[0061] 实施例2-5：

[0062] 一种达氏鲟冷冻稀释液，包括：

[0063]

[0064] 以上保存液的pH通过1M NaHCO3或25mM HEPES调节。

[0065] 实施例6：

[0066] 一种达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：

[0067] 以下以超低温(-196℃)保存5ml达氏鲟精巢细胞悬液(5×105个达氏鲟精巢细胞)为例，说明达氏鲟精巢细胞冷冻保存方法。本实施例所用的冷冻保存液的配方为实施例1所示。以下操作均在无菌生物安全柜中进行。

[0068] 达氏鲟精巢细胞悬液制备：

[0069] 1)清洗干净的精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎至1mm3小块。以消化液：组织块＝4ml:1g(v/w)的比例添加0.25％胰蛋白酶消化液，20℃培养箱中消化，每30min吹打一次。

[0070] 2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加L-15培养基+20％胎牛血清终止消化，40μ m滤网过滤。4℃，200g离心5min，冷冻保存液重悬。

[0071] 3)细胞计数，并用台盼蓝：细胞悬液＝1:1(v/v)染色，在显微镜下计算活细胞率后，用冷冻保存液以1×105个/ml稀释细胞。

[0072] 4)平衡与分装：取稀释到标准浓度的细胞悬液5ml放置于冰上平衡20min，用移液枪分装至2ml冻存管中，每管200μl，共25管。

[0073] 5)程序降温：降温程序从0℃开始，以-1℃/min速率降至-80℃，-80℃平衡30min后放入液氮中，在-196℃中保存。

[0074] 细胞复苏及活力检测

[0075] (1)准备37℃的水浴锅，从液氮中取出冻存精巢细胞冻存管，将冻存管迅速放入37℃的水浴锅中水浴约35s，不断晃动冻存管使冰晶在短时间内快速融化。

[0076] (2)将恰好解冻的冻存管置于冰上，用台盼蓝：细胞悬液＝1:1(v/v)染色计算活细胞率后，将细胞悬液移入离心管，1000r/min离心，5min，弃上清。

[0077] (3)加5ml L-15+20％胎牛血清重悬，接种至25cm3细胞培养瓶中，大气环境下，25℃培养，观察增殖率。

[0078] 结果证明，复苏后的细胞活率可达冻存前细胞的90.8％，且复苏后培养的细胞在培养第 10天增殖率为68.7％。