一种对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针及其制法和用途

摘要

一种大分子光学探针，它有如下的结构式：其中，聚乙二醇部分的聚合度n可在12—455之间调控。上述大分子光学探针对酸化和乏氧具有连续响应的特征，且发射波长位于红光到近红外光波段，易溶于水，生物相容性好，可以应用于活体光学成像，实现肿瘤微环境信号的有效放大，从而达到高信噪比的肿瘤检测。本发明公开了其制法。

权利要求

1.一种大分子光学探针，其特征是它有如下的结构式：

所述的大分子光学探针，其结构中聚乙二醇部分的聚合度n在12—455之间。

2.一种制备权利要求1所述大分子光学探针的方法，其特征是它包括如下步骤：

步骤1.将苯并[b]噻吩-2-硼酸、6-氯吡啶甲醛、四(三苯基膦)钯、四氢呋喃以及碳酸钠水溶液加入到反应容器中，苯并[b]噻吩-2-硼酸、6-氯吡啶甲醛和四(三苯基膦)钯的摩尔比为1.2:1:0.03，所述的碳酸钠溶液的浓度为2mol/L，四氢呋喃和碳酸钠水溶液的体积比为3:1，混合物在氩气保护下回流过夜，反应后冷却到室温，将反应混合物倒入到水中，使用二氯甲烷萃取，二氯甲烷相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩，产物使用柱层析方法提纯，得到6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛；

步骤2.将步骤1所得到的6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛、双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]、三氟甲基磺酸银以及二乙二醇二甲醚置于反应容器中，6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛、双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]和三氟甲基磺酸银的摩尔比为5:1:2，混合物在氩气保护下，加热到150℃搅拌反应24小时，反应后，将反应混合物冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，并溶于二氯甲烷，将不溶物过滤除去，所得二氯甲烷溶液减压浓缩后，使用柱层析分离提纯，得到带有醛基的铱配合物；

步骤3.将聚乙二醇单甲酯以及三乙胺溶于二氯甲烷中，并冷却到0℃，缓慢加入对甲苯磺酰氯，聚乙二醇单甲酯和对甲苯磺酰氯摩尔比为1:5，反应混合物在0℃下搅拌2小时，接着在室温下反应2天，随后减压蒸发除去溶剂，将残留物溶于三氯甲烷，并使用饱和碳酸钠水溶液洗涤，然后将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤，在乙醚中沉淀，沉淀在真空环境下干燥，得到对甲苯磺酸端基的聚乙二醇；

步骤4.将步骤3得到的对甲苯磺酸端基的聚乙二醇、对氨基苯甲酸和碳酸钾加入到二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌反应24小时，对甲苯磺酸端基的聚乙二醇、对氨基苯甲酸和碳酸钾的摩尔比为1:5:5，反应结束后，将反应液冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，溶解于三氯甲烷，使用饱和碳酸钠水溶液洗涤，之后，将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩后，在乙醚中沉降，真空干燥，得到苯胺端基的聚乙二醇；

步骤5.将步骤4所得到的苯胺端基的聚乙二醇和步骤2得到的带有醛基的铱配合物溶于甲醇中，苯胺端基的聚乙二醇和带有醛基的铱配合物摩尔比为1:2，再加入三乙胺，将混合物加热回流过夜，反应后，减压蒸发除去溶剂和三乙胺，随后，将混合物溶解于中性水中，经醋酸纤维素滤膜过滤，除去不溶的固体小颗粒，将所得水溶液冻干，得到所述的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针：

3.权利要求1所述的大分子光学探针在制备生物体内的肿瘤成像剂中的应用。

说明书

一种对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针及其制法和

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及用于生物光学成像的大分子探针，具体涉及一种能够对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针及其制法和用途。

背景技术

[0002] 癌症诊断的关键技术之一是放大肿瘤微环境信号，而肿瘤微环境信号的放大策略通常基于某些肿瘤标志性的特征，例如酸化，乏氧和过表达的肿瘤标志物等。然而，这些标志性的特征在肿瘤和体内正常组织中的差异往往并不大。例如，实体肿瘤的细胞外pH值大约为6.5-6.9，而正常组织细胞外的pH值大约为7.4，两者的差异十分有限。乏氧的肿瘤组织中的氧分压约为0-3％O2，而生理条件下正常供氧环境下的氧分压约为>5％O2，两者差异也有限。另外，许多肿瘤标志物在高表达的肿瘤亚型和低表达的亚型中的差异往往也并不大。这些肿瘤标志性特征在肿瘤和正常组织间的差异可使用刺激响应的探针来进行放大，从而达到可以检测的程度。但正如上面所述，由于这些肿瘤标志性特征在肿瘤和正常组织间的原始差异很小，且探针的响应灵敏度有限，使用这类刺激响应的探针来进行肿瘤微环境的一步放大的方法在肿瘤检测中往往得到的信噪比很低。

发明内容

[0003] 为了解决上述难题，我们提出一种两级放大的概念和方法来提高肿瘤微环境信号的方法。即，探针在肿瘤微环境的第一次刺激下，先转换成另外一种形态，称之为报告分子；之后，报告分子的信号在一个新的通道中，再对肿瘤微环境的第二次刺激进行响应，从而实现肿瘤微环境信号的两步放大。为了实现这一设想，我们首先挑选了肿瘤特异性的细胞代谢作为探针设计的响应对象。与正常组织相比，肿瘤具有反常加速的代谢速度，并导致了酸化和乏氧的肿瘤微环境。这一标志性特征具有很好广泛性，几乎存在于所有类型的肿瘤中。
然后，针对这一响应对象，我们设计出了一种对其具有两级响应的探针。所设计的探针化学结构上由磷光发射的铱配合物和生物相容性的聚乙二醇组成，两个组分之间通过一种酸敏感的亚胺键连接。在中性pH值条件下，该探针分子结构保持稳定。在酸性pH值条件下，探针化学结构中的亚胺键断裂，导致探针分子铱配合物与聚乙二醇部分分离，该化学结构的变化同时会导致探针分子发射波长的变化。其后，断裂分离出来的铱配合物部分的长寿命磷光发射继续表现出乏氧敏感的性质，其发射强度会随着乏氧程度的提高而增强。基于这一原理，所设计的大分子光学探针可以对肿瘤代谢所导致的酸化和乏氧表现出连续响应的特征，从而可以有效地实现肿瘤微环境信号的两步放大。

[0004] 本发明的目的在于提供一种对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针及其制备方法和用途。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种大分子光学探针，它有如下的结构式：

[0007]

[0008] 上述大分子光学探针，其结构中聚乙二醇部分的聚合度n可在12—455之间调控。

[0009] 一种制备上述大分子光学探针的方法，它包括如下步骤：

[0010] 步骤1.将苯并[b]噻吩-2-硼酸、6-氯吡啶甲醛、四(三苯基膦)钯、四氢呋喃以及碳酸钠水溶液加入到反应容器中，苯并[b]噻吩-2-硼酸、6-氯吡啶甲醛和四(三苯基膦)钯的摩尔比为1.2:1:0.03，所述的碳酸钠溶液的浓度为2mol/L，四氢呋喃和碳酸钠水溶液的体积比为3:1，混合物在氩气保护下回流过夜，反应后冷却到室温，将反应混合物倒入到水中，使用二氯甲烷萃取，二氯甲烷相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩，产物使用柱层析方法提纯，得到6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛；

[0011] 步骤2.将步骤1所得到的6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛、双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]、三氟甲基磺酸银以及二乙二醇二甲醚置于反应容器中，6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛、双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]和三氟甲基磺酸银的摩尔比为5:1:2，混合物在氩气保护下，加热到150℃搅拌反应24小时，反应后，将反应混合物冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，并溶于二氯甲烷，将不溶物过滤除去，所得二氯甲烷溶液减压浓缩后，使用柱层析分离提纯，得到带有醛基的铱配合物；

[0012] 步骤3.将聚乙二醇单甲酯以及三乙胺溶于二氯甲烷中，并冷却到0℃，缓慢加入对甲苯磺酰氯，聚乙二醇单甲酯和对甲苯磺酰氯摩尔比为1:5，反应混合物在0℃下搅拌2小时，接着在室温下反应2天，随后减压蒸发除去溶剂，将残留物溶于三氯甲烷，并使用饱和碳酸钠水溶液洗涤，然后将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤，在乙醚中沉淀，沉淀在真空环境下干燥，得到对甲苯磺酸端基的聚乙二醇；

[0013] 步骤4.将步骤3得到的对甲苯磺酸端基的聚乙二醇、对氨基苯甲酸和碳酸钾加入到二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌反应24小时，对甲苯磺酸端基的聚乙二醇、对氨基苯甲酸和碳酸钾的摩尔比为1:5:5，反应结束后，将反应液冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，溶解于三氯甲烷，使用饱和碳酸钠水溶液洗涤，之后，将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩后，在乙醚中沉降，真空干燥，得到苯胺端基的聚乙二醇，其结构为：

[0014]

[0015] 步骤5.将步骤4所得到的苯胺端基的聚乙二醇和步骤2得到的带有醛基的铱配合物溶于甲醇中，苯胺端基的聚乙二醇和带有醛基的铱配合物摩尔比为1:2，再加入三乙胺，将混合物加热回流过夜，反应后，减压蒸发除去溶剂和三乙胺，随后，将混合物溶解于中性水中，经醋酸纤维素滤膜过滤，除去不溶的固体小颗粒，将所得水溶液冻干，得到所述的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针

[0016]

[0017] 上述的大分子光学探针，在制备生物体内的肿瘤成像剂中的应用。

[0018] 本发明制备的大分子光学探针，对酸化和乏氧具有连续响应的特征，且发射波长位于红光到近红外光波段，易溶于水，生物相容性好，可以应用于活体的光学成像，实现肿瘤微环境信号的有效放大，从而达到高信噪比的肿瘤检测。

附图说明

[0019] 图1为本发明制备的大分子光学探针(数均分子量6000)对酸化响应的磷光发射光谱测试结果。

[0020] 图2为本发明制备的大分子光学探针(数均分子量6000)对乏氧响应的磷光发射光谱测试结果。

[0021] 图3为本发明制备的大分子光学探针(数均分子量6000)在荷瘤小鼠中的光学成像结果。

具体实施方式

[0022] 下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但是这些实例并不限制本发明的保护范围。

[0023] 实施例1

[0024] 苯胺端基的聚乙二醇的制备，包括以下步骤：

[0025] (1)对甲苯磺酸端基的聚乙二醇的制备

[0026] 将聚乙二醇单甲酯(0.4mmol，数均分子量500-20000)以及三乙胺(0.4mL)溶于二氯甲烷(20mL)中，并冷却到0℃，缓慢加入对甲苯磺酰氯(0.38g,2mmol)，反应混合物在0℃下搅拌2小时，接着在室温下反应2天，反应后，减压蒸发除去溶剂，将残留物溶于三氯甲烷(20mL)并使用饱和碳酸钠水溶液洗，每次10mL洗3次，然后将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤，在乙醚中沉淀，沉淀在真空环境下干燥，得到产物为一种白色粉末，收率为80％。

[0027] 对产物结构表征如下，1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.77(d,J＝8.4Hz,2H),7.47(d,J＝8.4Hz,2H),4.11(m,2H),3.49(s,PEG),3.22(s,3H),2.41(s,3H)。据此推断产物确实为对甲苯磺酸端基的聚乙二醇，其结构如下所示：

[0028]

[0029] (2)苯胺端基的聚乙二醇的制备

[0030] 将步骤(1)所合成的对甲苯磺酸端基的聚乙二醇(0.4mmol，数均分子量500-20000)、对氨基苯甲酸(0.27g,2mmol)和碳酸钾(0.27g,2mmol)加入到二甲基甲酰胺(15mL)中，在50℃下搅拌反应24小时，反应结束后，将反应液冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，溶解于三氯甲烷(20mL)，使用饱和碳酸钠水溶液洗，每次10mL洗3次，之后，将三氯甲烷相使用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩后，在乙醚中沉降，真空干燥，得到一种白色粉末，收率70％。

[0031] 对产物结构表征如下，1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.54(d,J＝8.7Hz,2H),5.97(s,2H),4.25(t,J＝4.6Hz,2H),3.49(s,PEG),3.22(s,3H)。据此推断产物确实为苯胺端基的聚乙二醇，其结构如下所示：

[0032]

[0033] 上述反应的反应式如下：

[0034]

[0035] 实施例2

[0036] 带有醛基的铱配合物的制备，包括以下步骤：

[0037] (1)6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛的制备

[0038] 将苯并[b]噻吩-2-硼酸(1.28g,7.2mmol)、6-氯吡啶甲醛(0.85g,6mmol)、四(三苯基膦)钯(0.21g,0.18mmol)、四氢呋喃(30mL)、以及2M碳酸钠水溶液(10mL)加入到反应容器中，在氩气保护下回流过夜，反应后冷却到室温，将反应混合物倒入到水中(300mL)，使用二氯甲烷萃取，每次50mL萃取3次，二氯甲烷相使用饱和食盐水洗，每次50mL洗3次，无水硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩，粗产物使用柱层析方法提纯，展开剂为二氯甲烷/石油醚(梯度比例1:1到1:0)，得到黄色粉末1.22g,收率85％。

[0039] 产物的基本结构表征如下，1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.11(s,1H),δ9.06(dd,J＝2.1,0.8Hz,1H),δ8.22(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),δ8.00(s,1H),δ7.95(d,J＝8.4Hz,1H),δ
7.91-7.89(m,1H),δ7.87-7.85(m,1H),δ7.43-7.38(m,2H)。ESI-MS(m/z):[M]+C14H9NOS理论值240，测得值240。据此推断产物确实为6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛，其结构如下所示：

[0040]

[0041] (2)双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]的制备

[0042] 取三水合三氯化铱(390mg,1.1mmol)、2-苯基吡啶(320μL,2.2mmol)溶于2-乙氧基乙醇(30mL)和水(10mL)的混合溶剂中，将混合物加热回流过夜，反应后，冷却到室温，过滤收集沉淀物，依次使用水和甲醇洗，再在真空下干燥，得到黄色粉末560mg，收率95％。

[0043] 产物的结构表征如下，1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.24(d,J＝5.6Hz,4H),7.87(d,J＝8.0Hz,4H),7.73(t,J＝7.8,4H),7.48(d,J＝7.6,4H),6.78-6.72(m,8H),6.56(t,J＝7.6,4H),5.93(d,J＝7.8,4H)。据此推断产物确实为双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱]，其结构如下所示：

[0044]

[0045] (3)带有醛基的铱配合物的制备

[0046] 取步骤(1)所制备的6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶甲醛(360mg,1.5mmol)、步骤(2)所制备的双-[二(2-苯基吡啶)合二氯化铱](320mg,0.3mmol)、三氟甲基磺酸银(155mg,0.6mmol)以及二乙二醇二甲醚(15mL)置于反应容器中，在氩气保护下，加热到150℃搅拌反应24小时，反应后，将反应混合物冷却到室温，在乙醚中沉降，过滤收集沉淀物，并溶于二氯甲烷，将不溶物过滤除去，所得二氯甲烷溶液减压浓缩后，使用柱层析分离提纯产物，展开剂为二氯甲烷/石油醚(1:2)，得到深红色粉末48mg，收率11％。

[0047] 产物结构表征如下，1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.61(s,1H),7.94-7.89(m,2H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.76-7.66(m,5H),7.61(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝5.9Hz,1H),7.46+(d,J＝5.5Hz,1H),7.16(t,J＝7.1Hz,1H),7.01-6.68(m,10H)。ESI-MS(m/z):[M+Na]IrC36H24ON3S计算值762，测量值762。据此推断产物确实为带有醛基的铱配合物，其结构如下所示：

[0048]

[0049] 上述反应的反应式如下：

[0050]

[0051] 实施例3

[0052] 对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针的制备

[0053] 取实施例1所制得的苯胺端基的聚乙二醇(0.02mmol，数均分子量500-20000)以及实施例2所制得的带有醛基的铱配合物(30mg,0.04mmol)溶于甲醇中(10mL)，再加入三乙胺(20μL)，将混合物加热回流过夜，反应后，减压蒸发除去溶剂和三乙胺，随后，将混合物溶解于中性水中，经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，除去不溶的固体小颗粒，将所得水溶液冻干，得到产物为一种橘黄色粉末，收率65％。

[0054] 产物的结构表征如下，1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.96(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.3Hz,1H),7.87-7.82(m,3H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),7.66-7.49(m,9H),7.11(m,1H),6.97-6.74(m,11H),6.64(d,J＝8.6Hz,1H),4.41(t,J＝4.8Hz,2H),3.64(s,PEG),3.38(s,3H)。据此推断产物确实为所设计的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针，其结构如下：

[0055]

[0056] 上述反应的反应式如下：

[0057]

[0058] 实施例4

[0059] 实施例3制得的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针(数均分子量6000)对酸化响应的磷光发射光谱测试结果如图1所示。在pH值7.4条件下，该大分子光学探针的发射峰位于610nm。在氧分压不变的情况下(0％O2)，随着溶液pH值降低，位于610nm处发射峰强度逐渐降低，而位于705nm处的发射峰强度逐渐升高。其他分子量的探针分子也表现出类似的响应特征。磷光发射光谱测试结果表明该大分子光学探针对酸化有着显著的响应特征，可以通过探针发射波长的红移来反应环境中的酸化情况。

[0060] 实施例5

[0061] 实施例3制得的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针(数均分子量6000)对乏氧响应的磷光发射光谱测试结果如图2所示。在pH值恒定的情况下(pH 5.5)，随着溶液中氧分压的降低，由酸化诱导产生的705nm发射峰强度逐渐增强。其他分子量的探针分子也表现出类似的响应特征。这一磷光发射光谱测试结果表明该大分子光学探针在对酸化进行响应后，还能继续对乏氧进行响应。通过对酸化和乏氧的连续响应，可以有效地对既酸化又乏氧的肿瘤微环境信号进行放大。

[0062] 实施例6

[0063] 实施例3制得的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针(数均分子量6000)在荷瘤小鼠中的活体成像结果如图3所示。小鼠肿瘤模型采用皮下注射的方式接种于ICR小鼠(左侧腋下注射鼠源肝癌细胞H22，每只106个H22细胞)，种植后一周，选择肿瘤体积100mm3左右的小鼠。将大分子光学探针溶于PBS(0.01M)配成5mg/mL溶液，尾静脉注射0.2mL入小鼠体内，通过近红外活体成像系统对荷瘤小鼠进行成像。结果表明，探针注射后1小时到96小时，肿瘤部位检测到的探针光学信号要远远强于背景信号。其他分子量的探针分子也表现出类似的成像效果。活体成像测试结果表明实施例3制得的对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针可以有效地放大肿瘤微环境的信号，实现高信噪比的肿瘤检测。