一种分隔固定多种酶的方法

摘要

一种分隔固定多种酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先将酶A原位包埋固定在聚合物基材表面的三维网络之中；之后在可见光的照射下，固定有酶A的三维网络层表面的光感应休眠种重新产生表面自由基，引发混合有酶B的单体溶液进行二次活性接枝交联聚合，将酶B原位包埋固定在第一层表面的三维网络之中，形成第二层交联网络；重复上述步骤，可将不同的酶分别包埋在更多的网络层之中。固定化过程中可以保存大部分酶的活性。将不同的酶分开固定在不同的网络层之中，既可以避免相互干扰抑制，又可以共同完成一个复杂的化学反应。聚合物基材可以提高复合膜的机械强度，增强了酶膜的稳定性，更有利于酶膜的回收再利用。

权利要求

1.一种分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的一侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/cm2-9mW/cm2，引入表面可见光休眠基；

(2)将含有游离酶A的单体可聚合溶液涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚合物膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-

180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，对酶A进行网布固定；

(3)将含有游离酶B的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶A的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，在酶A网布层上对酶B进行网布固定；

步骤(1)中所述异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液浓度为0.5-4M；

步骤(2)和(3)中所述的单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺；

步骤(2)和(3)中所述单体可聚合溶液组成如下：酶质量百分含量为0.01％-20％，可聚合单体的质量百分含量为20％-60％，余量为水或pH范围为4-9的缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所使用的聚合物膜为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。

3.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述的透光片为石英片或带有可透光图案化的掩膜。

4.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述的可见光灯为氙灯或LED灯。

5.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于还包括以下步骤：将含有游离酶C的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶B的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强

0.3mW/cm2-3mW/cm2在酶B网布层上对酶C进行网布固定。

6.根据权利要求5中所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于还包括以下步骤：在包埋有酶C的网布层之上进一步分层固定不同种类酶。

7.一种分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的两侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/cm2-9mW/cm2，膜正反面皆引入表面可见光休眠基；之后将含有游离酶A的单体可聚合溶液涂覆在聚合物膜的一侧，将含有游离酶B的单体可聚合溶液涂覆在膜的另一侧，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，对酶A酶B进行分隔固定；

所述异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液浓度为0.5-4M；

所述的单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺；

所述单体可聚合溶液组成如下：酶质量百分含量为0.01％-20％，可聚合单体的质量百分含量为20％-60％，余量为水或pH范围为4-9的缓冲溶液。

说明书

一种分隔固定多种酶的方法

技术领域

[0001] 本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及活性接枝交联聚合在聚合物基材表面分隔固定多种酶的方法。

背景技术

[0002] 生物酶作为一种温和高效的催化剂在实验室研究以及工业化应用中都有着极其光明的前景。相比于化学反应而言，酶促反应的条件更加温和，操作更加简单，区域选择性更高，反应中副产物更少，而且很多化学方法难以合成的反应都可以通过一种或多种酶来完成。但是酶本身成本很高，游离酶稳定性较差，这成为阻碍其普及的瓶颈。为了进一步拓宽酶的应用范围，将生物酶固定化在基材上，具有以下优点：其一，固定化的基材由于和底物是分开的，因此可以避免酶对反应底物的混合污染；其二，由于酶本身价格昂贵，固定化酶可以实现对酶的回收利用，从而大大降低了反应的成本；其三，将酶固定化在基材表面可以增加酶的结构稳定性，使酶在实验室和工业化研究中更不易失活。

[0003] 在形形色色的酶固定化载体选择上，以聚合物凝胶为载体的酶固定技术成为近年来的热点。但是，聚合物凝胶普遍存在机械强度较低的缺点，在实际应用中很容易被破坏而丧失其功能。除此之外，凝胶对外界环境比较敏感，在溶剂中易发生溶胀从而导致酶的泄露。为解决这些问题，使用可见光可控活性接枝的方法，在聚合物基材表面接枝一层致密而均匀的网布层，网布层相比于凝胶来说，溶胀性小，网络致密而均匀，包埋的酶不易发生泄漏。除此之外，由于聚合物基材与聚合物网布相似的柔韧度和卓越的机械强度，将网布接枝在聚合物基材上，制备具有支撑基质的聚合物网布/基材复合膜成为一种新型的制备高性能固定化酶的方法。

[0004] 近年来，使用多种酶同时催化一个复杂体系的多种化学反应，或由一个起始物的多级转化反应是生物催化研究的热点方向之一，这就涉及到多酶的固定化技术。但目前专利和文献报道的大多是混合包埋法(这些酶之间不存在物理或化学负效应)：比如牛军峰等(CN 102716684 A)将用于污水处理的多酶体系混合包埋在聚乳酸/嵌段共聚物凝胶之中，再将凝胶进行电纺丝制得纤维膜，使用此固定化酶膜催化多种污水中的含氨氮有机物，效率较高而且性能较好。吴敏等(CN 101914520 A)构建了纳米凝胶-多酶组装体系，对甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶进行了固定，该方法成本低、反应简单，为多种酶提供了固定场所，是一种有效的纳米凝胶固定化酶催化合成的新方法。Zhao等(Green Chemistry,2014,16,2558)将葡糖氧化酶和葡糖淀粉酶混合固定在石墨烯氧化物上，利用该多酶共固定化的生物催化剂一步催化淀粉转变为葡萄糖酸的反应，两种酶的活性均保持在较高水平。

[0005] 然而对很多复杂反应体系，当这些酶之间因存在物理或化学作用而互相影响生物活性时，需要分隔固定技术。如蛋白酶，当其与其他酶共同作用时，往往会分解其他酶(本质上是蛋白质)从而导致反应不能如期进行。但是，将相互抑制的多种酶分开固定在同一个基材上的报道则比较少见。

[0006] 为解决将不同种酶特别是相互抑制的酶分开固定在同一基材上的问题，有必要设计出一种简单、条件温和的方法制备聚合物网布/基材复合膜，以实现在同一聚合物基材上对多种游离酶的分隔有效固定化。

发明内容

[0007] 为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种利用活性接枝聚合的特点在聚合物基材表面接枝多层网布层用以分别固定多种游离酶的方法。该方法操作简单，条件温和，能够在制备网布/基材复合膜的同时实现对多种游离酶的分隔包埋。并且以多种酶为模型来证明分隔固定的有效性。

[0008] 该方法首先在紫外光照射下通过脱氢-偶联反应将光引发剂异丙基硫杂蒽酮(ITX)种植在聚合物基材表面形成ITX半频哪醇自由基(ITXSP)休眠种。接枝有休眠种的聚合物表面在可见光的照射下，休眠种发生断裂形成表面自由基和ITXSP，在加入可交联单体时，表面自由基可以引发表面接枝交联聚合，而ITXSP可以对聚合过程进行调控，从而形成致密而均匀的聚合物网布，接枝完毕后，ITXSP以休眠种的形式重新分布于网布表面上。

[0009] 为了进一步解决酶分隔固定在同一基材上的问题，在进行可见光可控活性接枝聚合时，将酶A一同混入可交联单体溶液之中，伴随着接枝交联聚合的进行，酶A被原位包埋在新形成的致密而均匀的聚合物网络之中完成固定化。由于网布表面的休眠种可以在可见光照下再次断裂形成自由基再引发活性接枝交联聚合，当再次加入混有酶B的可交联单体溶液时，在包埋酶A的网布层之上，酶B被原位包埋在新形成的聚合物网络之中完成固定化。以此类推，一层包埋酶的网布之上接枝另一层包埋另一种酶的网布，形成一种层层结构，从而形成“酶大厦”。反应流程示意图如图1所示：

[0010] 为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:

[0011] 一种分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

[0012] (1)将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的一侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/cm2-9mW/cm2，引入表面可见光休眠基。

[0013] (2)将含有游离酶A的单体可聚合溶液涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚合物膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯)下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，对酶A进行网布固定。

[0014] (3)将含有游离酶B的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶A的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，在酶A网布层上对酶B进行网布固定。

[0015] 进一步，步骤(1)中所述异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液浓度为0.5-4M。

[0016] 进一步，步骤(1)中所使用的聚合物膜为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。

[0017] 进一步，步骤(2)和(3)中所述的单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。

[0018] 进一步，步骤(2)和(3)中所述的透光片为石英片或带有可透光图案化的掩膜。

[0019] 进一步，步骤(2)和(3)中所述的可见光灯为氙灯或LED灯。

[0020] 进一步，步骤(2)和(3)中所述单体可聚合溶液组成如下：酶质量百分含量为0.01％-20％，可聚合单体的质量百分含量为20％-60％，余量为水或pH范围为4-9的缓冲溶液。

[0021] 另一种技术方案为：

[0022] 将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的两侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/cm2-9mW/cm2，膜正反面皆引入表面可见光休眠基；之后将酶A的可聚合溶液涂覆在聚合物膜的一侧，将酶B的可聚合溶液涂覆在膜的另一侧，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，对酶A酶B进行分隔固定。

[0023] 当然也可以进一步在两侧分别固定2种以上的不同的酶。

[0024] 进一步，还包括以下步骤：

[0025] 将含有游离酶C的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶B的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强0.3mW/cm2-3mW/cm2在酶B网布层上对酶C进行网布固定。或者更进一步，在包埋有酶C的网布层之上进一步分层固定不同种类酶。

[0026] 本发明的优点在于:

[0027] (1)酶的固定化在室温及可见光下进行，反应条件温和，有利于保持酶的活性。

[0028] (2)网布/基材复合膜提高了酶自身结构和聚合物网布结构的稳定性，实现了酶的简单回收再利用。

[0029] (3)活性接枝可以在一层包埋酶的网布层之上再次接枝一层新的包埋另一种酶的网布层，使多种酶分开固定在不同的网布层之中，这些不同种类的酶既可以共同催化同一个复杂的化学反应，又可以相互隔离避免相互抑制。

附图说明

[0030] 图1“. 酶大厦”的构建。(a)ITX通过脱氢-偶联反应种植在聚合物基材表面.(b)通过多次可见光引发可控活性接枝交联聚合原位包埋不同的酶于不同的网布层之中。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。

[0032] 实施例1:

[0033] 将40μL，3mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm2低密度聚乙烯膜的一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(波2
长254nm，9mW/cm)下在室温下照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对低密度聚乙烯膜抽提24小时，室温下晾干。

[0034] 将一定量的胰蛋白酶溶解于0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成11.5mg/mL的胰蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取60μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的低密度聚乙烯膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片带有图案化透光区域的掩膜之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶。

[0035] 将一定量的谷氨酰胺转移酶溶解于0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成3.5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液，将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取60μL涂敷在接枝有包埋有胰蛋白酶网布层的低密度聚乙烯膜上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片掩膜之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的谷氨酰胺转移酶。

[0036] 以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物对胰蛋白酶酶活进行测试，取面积为3×3cm2的双酶包埋膜置于10mL酶活测定底物溶液中(100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，1mM BAEE，10mM CaCl2)，于35℃下震荡反应4分钟，每0.5分钟使用紫外可见分光光度计测量溶液在253nm下的吸光度，胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。经此种方法测定，双酶包埋膜中胰蛋白酶的酶活为7051Units/mg。

[0037] 以Nα-CBZ-Gln-Gly为底物对谷氨酰胺转移酶酶活进行测试，取面积为3×3cm2的双酶包埋膜置于6mL酶活测定底物溶液中(100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝6.0)，30mM Nα-CBZ-Gln-Gly，10mM谷胱甘肽，5mM CaCl2)，于35℃下震荡反应5分钟，反应结束后立即加入3mL终止试剂(3mol/L的HCl，TCA质量分数为1.2％的水溶液，FeCl3质量分数为5％的水溶液按1：1：1(v/v)混合)，使用紫外可见分光光度计测量溶液在525nm下的吸光度，1个单位谷氨酰胺转移酶酶活定义为：在上述条件下每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量。经此种方法测定，双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1228Units/mg。

[0038] 将测完酶活的双酶包埋膜取出后使用大量0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液冲洗后进行下一批次的酶活测试实验以检测双酶包埋膜的操作稳定性。经测定，双酶包埋膜在使用4个批次以后，两种酶的酶活力都没有发生明显的下降。

[0039] 对比实施例1：

[0040] 首先将11.5mg/mL的胰蛋白酶溶液与3.5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液混合均匀后，再将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合，取60μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的低密度聚乙烯膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。

[0041] 酶活测定方法同实施例1。经测定，混合包埋的酶膜中胰蛋白酶的酶活为5986Units/mg，谷氨酰胺转移酶的酶活为244Units/mg。造成酶活降低的原因在于：胰蛋白酶是一种可以将蛋白质和多肽进行水解的酶，由于大多数酶本身是由蛋白质组成，将蛋白酶与其他酶进行混合时会造成其他酶的分解而导致失活。谷氨酰胺转移酶就是一种由蛋白质组成的酶，它的作用是将多肽链上赖氨酸的氨基与谷氨酰胺的氨基相互交联，如若将谷氨酰胺转移酶与胰蛋白酶混合使用，在胰蛋白酶分解谷氨酰胺转移酶的同时，谷氨酰胺转移酶也会使胰蛋白酶发生交联而影响胰蛋白酶的活性。

[0042] 实施例2:

[0043] 将600μL，5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm2聚丙烯无纺布的一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为5mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对无纺布抽提24小时，室温下晾干。

[0044] 将一定量的木瓜蛋白酶溶解于0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取800μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的无纺布一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mW/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶。

[0045] 将一定量的脂肪酶溶解于0.5M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成8.5mg/mL的脂肪酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取800μL涂敷在包埋有木瓜蛋白酶网布层的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mW/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的脂肪酶。

[0046] 将一定量的β-葡萄糖苷酶溶解于0.5M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成5.5mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取800μL涂敷在包埋有脂肪酶网布层的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mW/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的β-葡萄糖苷酶。

[0047] 以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物对木瓜蛋白酶酶活进行测试，取面积为3×3cm2的三酶包埋膜置于10mL酶活测定底物溶液中(100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，1mM BAEE，10mM CaCl2)，于35℃下震荡反应4分钟，每0.5分钟使用紫外可见分光光度计测量溶液在253nm下的吸光度，木瓜蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。经此种方法测定，三酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为2045Units/mg。与单独包埋相比，酶活保持率在89％以上。

[0048] 脂肪酶活力单位定义：以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)为底物，在37℃下，每分钟释放出1μmoL对硝基苯酚所需酶的量定义为一个脂肪酶活力单位(U)。p-NPP在波长405nm下的紫外吸收远远弱于对硝基苯酚。在脂肪酶的催化下，随着酯键的水解，对硝基苯酚逐渐增多，反应体系的紫外吸收随之相应增加。对三酶包埋膜中固定化脂肪酶的活性进行测量。结果发现，固定化酶的酶活为0.94U。与单独包埋相比，酶活保持率在85％以上。

[0049] 以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)为底物对β-葡萄糖苷酶酶活进行测试，取面积为2×2cm2的酶膜置于5mL酶活测定底物溶液中(50mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.8)，4mM p-NPG)，于40℃下震荡反应30分钟，反应结束后立即加入终止试剂(10mL 1M Na2CO3)，使用紫外可见分光光度计测量溶液在405nm下的吸光度，1个单位β-葡萄糖苷酶酶活定义为：在上述条件下每分钟催化形成1μmol对硝基苯酚的酶量。经此种方法测定，酶膜的酶活为4.8U/mg。与单独包埋相比，酶活保持率在90％以上。

[0050] 实施例3：

[0051] 将300μL，2mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm2的棉布上，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为1mW/cm2)下在室温下照射10分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对棉布抽提24小时，室温下晾干。

[0052] 将一定量的葡萄糖氧化酶溶解于0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，将此溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照2:1(v/v)进行混合后，取500μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的棉布一侧，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为2mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将棉布浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对棉布进行冲洗以去除未固定的葡萄糖氧化酶。

[0053] 将一定量的辣根过氧化物酶溶解于0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成12.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，将此溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照2:1(v/v)进行混合后，取500μL涂敷在包埋有葡萄糖氧化酶的网布层的棉布上，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为2mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将棉布浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对棉布进行冲洗以去除未固定的辣根过氧化物酶。

[0054] 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢能使靛蓝胭脂红发生褪色反应，使用紫外可见分光光度计测量溶液在615nm下的吸光度，据此测定出产生的过氧化氢的量，进而计算出葡萄糖氧化酶活力。葡萄糖氧化酶活力定义为：37℃条件下，1min内催化葡萄糖反应产生1μg过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶量为1U。经此种方法测定，双酶包埋膜中葡萄糖氧化酶的酶活为945U/mg。与单独包埋相比，酶活保持率在92％以上。

[0055] 使用连苯三酚测定辣根过氧化物酶酶活，以过氧化氢为底物，在辣根过氧化酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚，使用紫外可见分光光度计测量溶液在430nm下的吸光度，据此测定出产生的红棓酚的量。辣根过氧化物酶酶活力定义为：在标准测定条件下，每分钟使△A430nm增加0.001的酶量为一个酶活单位。经此种方法测定，双酶包埋膜中葡萄糖氧化酶的酶活为330U/mg。与单独包埋相比，酶活保持率在90％以上。

[0056] 实施例4:

[0057] 将1mL，2mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm2聚乙烯无纺布的一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为7mW/cm2)下在室温下照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对无纺布抽提48小时，室温下晾干。

[0058] 将一定量的木瓜蛋白酶溶解于0.2M的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液中，震荡溶解，形成15mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照1:2(v/v)进行混合后，取1mL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的无纺布一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为0.9mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.2M的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶。

[0059] 将一定量的脂肪酶溶解于0.2M的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液中，震荡溶解，形成15mg/mL的脂肪酶溶液，将一定量的β-葡萄糖苷酶溶解于0.2M的Tris-HCl(pH＝6.0)缓冲液中，震荡溶解，形成15mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶液，将两种酶溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照
1:1:1(v/v)混合后，取1mL涂敷在包埋有木瓜蛋白酶网布层的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.3mW/cm2)下照射120分钟。可见光辐照完毕后，将固定有三种酶的无纺布浸泡在0.2M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的酶。

[0060] 酶活测定方法同实施例2。经测定，三酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为2007Units/mg，脂肪酶的酶活为0.94U，β-葡萄糖苷酶的酶活为3.5U/mg。

[0061] 实施例5:

[0062] 将1.5mL，3mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm2棉布的一侧，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为4mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对棉布抽提48小时，室温下晾干。

[0063] 将一定量的胰蛋白酶溶解于0.4M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的胰蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取1.5mL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的棉布一侧，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.3mW/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将棉布浸泡在0.4M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对棉布进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶。

[0064] 将一定量的葡萄糖氧化酶溶解于0.4M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，将一定量的辣根过氧化物酶溶解于0.4M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，将两种酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照2:2:3(v/v)混合后，取1mL涂敷在包埋有胰蛋白酶网布层的棉布上，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为2.5mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将固定有三种酶的棉布浸泡在0.4M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡48小时，之后用大量缓冲液对棉布进行冲洗以去除未固定的酶。

[0065] 胰蛋白酶酶活测定方法同实施例1，葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的酶活测定方法同实施例3。经测定，三酶包埋膜中胰蛋白酶的酶活为6824Units/mg，葡萄糖氧化酶的酶活为947Units/mg，辣根过氧化物酶的酶活为483Units/mg。

[0066] 实施例6：

[0067] 将200μL，4mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm2双向拉伸聚丙烯膜的两侧，然后将涂覆有溶液的双向拉伸聚丙烯膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为4mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对双向拉伸聚丙烯膜抽提48小时，室温下晾干。

[0068] 首先将11.5mg/mL的胰蛋白酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取60μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的双向拉伸聚丙烯膜一侧，将3.5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取60μL涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，2
3mW/cm)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。

[0069] 酶活测定方法同实施例1。经测定，双酶包埋膜中胰蛋白酶的酶活为8461Units/mg，双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1326Units/mg。

[0070] 实施例7：

[0071] 将300μL，0.6mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×3cm2聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜的两侧，然后将涂覆有溶液的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜抽提48小时，室温下晾干。

[0072] 首先将12mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取90μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜的一侧，将5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照75:45(v/v)进行混合后，取90μL涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片带有图案化透光区域的掩膜之间，随后将此2
体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm)下照射50分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。

[0073] 酶活测定方法同实施例1。经测定，双酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为1835Units/mg，双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1474Units/mg。

[0074] 实施例8：

[0075] 将500μL，0.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在2×3cm2聚对聚乳酸膜的两侧，然后将涂覆有溶液的聚乳酸膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚乳酸膜抽提48小时，室温下晾干。

[0076] 首先将10mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取100μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚乳酸膜一侧，将10mg/mL的脂肪酶溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1(v/v)进行混合后，取100μL涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的聚乳酸膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mW/cm2)下照射100分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液中浸泡48小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶和脂肪酶。

[0077] 酶活测定方法同实施例2。经测定，双酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为2258Units/mg，双酶包埋膜中脂肪酶的酶活为1.36U。

[0078] 实施例9：

[0079] 将1mL，2.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm2尼龙布的两侧，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2
2mW/cm)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对尼龙布抽提48小时，室温下晾干。

[0080] 首先将20mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照1:2(v/v)进行混合后，取800μL涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的尼龙布一侧，将15mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照1:2(v/v)进行混合后，取800μL涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为1.5mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.3M的Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液中浸泡72小时，之后用大量缓冲液对固定有酶的尼龙布进行冲洗以去除未固定的两种酶。

[0081] 酶活测定方法同实施例3。经测定，双酶包埋膜中葡萄糖氧化酶的酶活为1135Units/mg，双酶包埋膜中辣根过氧化物酶的酶活为521Units/mg。