超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用转让专利
申请号 : CN201510872228.4
文献号 : CN105296488B
文献日 : 2018-05-01
发明人 : 杨剑 , 曾春雨 , 周林 , 李晓龙
申请人 : 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
摘要 :
本发明公开了一种超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用，所述siRNA分子序列为5’‑ccuguauucuuagaccaaadtdt‑3’。本发明采用超声微泡技术携带siRNA至肾脏特异性破裂，有效抑制肾脏GRK4表达，增加尿钠和尿量排泄，实现靶向预防和治疗高血压的目的。
权利要求 :
1.通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于：所述siRNA分子序列为5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’、5’-ggcugucugauauaugaaadtdt-3’或5’-ggagagagcuccugaaguudtdt-3’；序列中，a、u、c、g为核糖核酸，dt为脱氧核糖核酸。
2.根据权利要求1所述通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于：所述siRNA分子序列为5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’。
3.根据权利要求1所述通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA靶向干扰G蛋白偶联受体激酶4。
4.根据权利要求1所述通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述超声微泡为脂类微泡。
5.根据权利要求1所述通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述超声微泡为脂膜微泡“脂氟显”，核心气体为全氟丙烷，微泡平均粒径 2μm，微泡浓度为4×109 9×109/ml。
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6.根据权利要求5所述通过超声微泡携带的siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述超声微泡先吸附一层多聚赖氨酸，再吸附siRNA。
7.通过超声微泡携带的siRNA分子在制备调节尿钠和/或尿量排泄的药物中的应用，其特征在于：所述siRNA分子序列为5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’、 5’-ggcugucugauauaugaaadtdt-3’或5’-ggagagagcuccugaaguudtdt-3’； 序列中，a、u、c、g为核糖核酸，dt为脱氧核糖核酸。
说明书 :
超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压
水平中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用。
背景技术
[0002] 高血压及其并发症正成为影响人民健康的主要原因。肾脏是负责尿钠排泄的重要器官，在高血压研究中得到普遍重视。在血压调控的众多因素中，G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled receptor kinases 4，GRK4)近年来尤其引人关注。首先，GRK4定位于染色体的4pl6.3，这一区域被认为与人类原发性高血压的发病具有密切关系；而GRK4已知的多个SNPs位点也与高血压的发病具有直接关联。其次，不同于GRK家族其他成员，如GRK2、GRK3、GRK5和GRK6的广泛组织表达，GRK4的组织表达具有特异性，前期研究发现GRK4特异性的在肾脏、睾丸、子宫肌层和血管等有限组织中表达。更为重要的是，GRK4可通过磷酸化相应G蛋白偶联受体，改变相应受体的功能，比如：增加引起水钠潴留的血管紧张素II受体I(AT1R)增加，并引起这些受体的磷酸化水平改变，进而使受体介导的肾脏排钠利尿受损/水钠潴留效应增强，从而引起血压升高。GRK4活性增高是众多受体功能异常的原因，因此，GRK4已经成为高血压治疗关注的新靶点。如何有效抑制GRK4的活性及效应已成为高血压研究与治疗领域的新的热点。
[0003] 随着人类基因组学和分子生物学的发展，与治疗相关的基因、受体、配体等被大量发现，基因治疗高血压正逐渐成为目前国内外研究的热点。如何将目的基因安全、有效、靶向性地导入体内特定器官、组织，并在靶细胞内稳定表达是目前亟待解决的主要难题之一。目前基因转染方法可分为三类：(1)生物法：主要指病毒载体介导的基因转染；(2)化学法：
包括磷酸盐沉淀、脂质体包埋等；(3)物理法：包括电穿孔、裸露DNA直接注射等。其中，病毒载体具有较高基因转染效率，但存在免疫原性及与宿主细胞整合的潜在危险，其安全性及免疫原性所致的不良后果令人担忧。脂质体包埋等方法具有低毒、低免疫原反应等优点，但有基因转染效率低、基因不能长期稳定表达等不足。电穿孔等物理方法对组织损伤大，且安全参数难以确定。相比较而言，超声介导微泡破裂技术既安全又高效，应用前景令人期待。
具体地，超声介导微泡破裂(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术是将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，引起微血管损伤，使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”，使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，使微泡或释放的基因能够进入血管壁及组织间隙，进而发挥靶向治疗作用。研究表明，联合使用超声照射和微泡可明显提高基因的转染率。超声微泡技术具有3个特点：(1)安全性：超声造影剂是一种高浓度微泡的混悬液，对人体无毒副作用；(2)靶向传输：采用治疗性超声或诊断性超声进行照射，使微泡崩塌破裂后，靶向释放出所携带的基因；(3)促渗透作用：微泡破裂会产生空化效应，导致膜通透性一过性升高，产生的微射流等可促进药物或基因运输。正是上述突出优点，使得超声微泡技术显得格外引人关注。
包括磷酸盐沉淀、脂质体包埋等；(3)物理法：包括电穿孔、裸露DNA直接注射等。其中，病毒载体具有较高基因转染效率，但存在免疫原性及与宿主细胞整合的潜在危险，其安全性及免疫原性所致的不良后果令人担忧。脂质体包埋等方法具有低毒、低免疫原反应等优点，但有基因转染效率低、基因不能长期稳定表达等不足。电穿孔等物理方法对组织损伤大，且安全参数难以确定。相比较而言，超声介导微泡破裂技术既安全又高效，应用前景令人期待。
具体地，超声介导微泡破裂(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术是将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，引起微血管损伤，使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”，使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，使微泡或释放的基因能够进入血管壁及组织间隙，进而发挥靶向治疗作用。研究表明，联合使用超声照射和微泡可明显提高基因的转染率。超声微泡技术具有3个特点：(1)安全性：超声造影剂是一种高浓度微泡的混悬液，对人体无毒副作用；(2)靶向传输：采用治疗性超声或诊断性超声进行照射，使微泡崩塌破裂后，靶向释放出所携带的基因；(3)促渗透作用：微泡破裂会产生空化效应，导致膜通透性一过性升高，产生的微射流等可促进药物或基因运输。正是上述突出优点，使得超声微泡技术显得格外引人关注。
[0004] 在超声微泡技术中，微泡是超声靶向造影剂的主要成分，包括外壳和内充气体。新型微泡内充气体以六氟化硫、氟碳、氮等高分子惰性气体为主；包裹微气泡的外壳主要有脂类、白蛋白类、多聚体类及表面活性剂类，可增加微泡稳定性，延长在血液循环系统中的停留时间。近年来，在心血管疾病、糖尿病肾病或肾肿瘤中均有关于超声微泡介导的靶向治疗，但是在肾脏尿钠代谢以及高血压研究领域中，超声微泡技术介导的基因治疗的应用尚未见报道。
[0005] RNA干扰(RNA interfering，RNAi)可以高效的抑制特定基因，因其毒性较低，在基因治疗研究中具有重要地位，技术也日趋成熟。siRNA(small interfering RNA，siRNA)是RNAi作用的中心环节和效应分子。siRNA的作用是以同源互补序列的mRNA为靶目标，促使mRNA降解，可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱导基因沉默效应。依照此原理，针对目标基因的信使RNA，设计并合成特异性siRNA，可以封闭特定基因的表达。与其他基因一样，siRNA要成功运输，需经历3个阶段：细胞外运输、细胞摄取和细胞内运输。到目前为止，在肾脏中尚未见利用siRNA技术针对GRK4进行干扰，进而改变肾脏尿钠排泄水平的报道。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用，通过siRNA干扰有效抑制肾脏GRK4的表达，进而改变肾脏尿钠排泄水平，降低血压。
[0007] 本发明采取以下技术方案：
[0008] 1、一种siRNA分子，序列为5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’、5’-ggcugucugauauaugaaadtdt-3’或5’-ggagagagcuccugaaguudtdt-3’。
[0009] 优选的，序列为5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’。
[0010] 需要说明的是，序列中，a、u、c、g为核糖核酸，t为脱氧核糖核酸，d即表示所述核酸为脱氧核糖核酸。
[0011] 2、上述siRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用。
[0012] 优选的，所述siRNA靶向干扰G蛋白偶联受体激酶4。
[0013] 优选的，siRNA通过超声微泡携带。
[0014] 优选的，所述超声微泡为脂类微泡。
[0015] 优选的，所述超声微泡为脂膜微泡“脂氟显”，核心气体为全氟丙烷，微泡平均粒径2μm，微泡浓度为4×109～9×109/ml。
[0016] 优选的，所述超声微泡先吸附一层多聚赖氨酸，再吸附siRNA。
[0017] 3、siRNA分子在制备调节尿钠和/或尿量排泄的药物中的应用。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明采用超声微泡技术携带siRNA至肾脏特异性破裂，有效抑制肾脏GRK4表达，增加尿钠和尿量排泄，实现靶向预防和治疗高血压的目的。相对于蛋白等其它材料来说，脂类微泡不会因高热而变性，回声性更强且易制备，其分子层的可变性有利于特异性配体的偶联。超声微泡造影剂是一种良好的基因载体，与病毒载体相比容量更大，可以携带寡反义核苷酸、DNA片段、甚至整个染色体，因此，在微泡上连接特异性靶向配体或抗体构建超声靶向微泡，使微泡和靶器官之间结合更紧密，能更进一步提高基因转染率，同时可减少对正常细胞、组织或血管的损害，并且在体内循环中更为稳定。
[0019] siRNA技术能够克服反义寡核苷酸技术稳定性较差、转移系统对反义核酸的吸收率较低、易引起毒性的缺陷，可以特异性剔除或降低特定基因的表达，具有高特异性(siRNA具有严格的序列特异性，其识别可精确到一个核苷酸)、高效性(只需少量siRNA就可使作用的编码基因产物显著下降)、高细胞穿透性(siRNA抑制基因表达的效应可以跨越细胞界限在不同的细胞间进行传递)等特点，已成为靶向基因治疗的有力工具。
附图说明
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0021] 图1荧光酶标仪验证微泡包裹siRNA，横坐标的“+”代表加入了微泡，“-”代表没有加入微泡；纵坐标表示悬浮于液面的微泡的荧光值占总液体荧光值的比重。
[0022] 图2 3对不同的siRNA对自发性高血压大鼠肾脏近曲小管细胞中GRK4的mRNA表达的干扰结果比较，1、2、3分别代表1-3号引物，效果最好的是1号引物。
[0023] 图3超声微泡介导GRK4siRNA(3号引物)干预自发性高血压大鼠后，其肾脏GRK4表达结果。
[0024] 图4超声微泡介导siRNA干预自发性高血压大鼠肾脏GRK4表达后，24小时尿量随时间的变化结果。
[0025] 图5超声微泡介导siRNA干预自发性高血压大鼠肾脏GRK4表达后，尿钠排泄率随时间的变化结果。
[0026] 图6超声微泡介导siRNA干预自发性高血压大鼠肾脏GRK4表达后，平均动脉压随时间的变化结果。
具体实施方式
[0027] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0028] 实施例1.
[0029] 实验采用脂膜微泡“脂氟显”(脂膜微泡“脂氟显”在ZL02133720.9专利中有详细介绍)，其核心气体为全氟丙烷，用于实质脏器显影时微泡平均粒径2μm，其中98％小于8μm，微泡浓度约为4×109～9×109/ml，采用更快的速度机械震荡后，微泡粒径可显著减小。
[0030] 设计3对siRNA引物，其序列分别如下：
[0031] 1号引物：5’-ccuguauucuuagaccaaadtdt-3’，SEQ ID NO.1；
[0032] 2号引物：5’-ggcugucugauauaugaaadtdt-3’，SEQ ID NO.2；
[0033] 3号引物：5’-ggagagagcuccugaaguudtdt-3’，SEQ ID NO.3。
[0034] 将上述3对引物分别用上述超声微泡进行包裹，包裹步骤如下：
[0035] 由于siRNA带负电荷，脂质超声微泡造影剂的表面电位也为负，两种带负电荷的物质在没有正电荷的帮助下，很难结合到一起。多聚赖氨酸为阳离子聚合物，为了提高脂质超声微泡造影剂载基因的能力，将siRNA和多聚赖氨酸分层吸附在脂质超声微泡造影剂上，制成载siRNA和多聚赖氨酸的聚合物。实验步骤如下：取脂质微泡，PBS缓冲液漂洗3次，加入过量多聚赖氨酸，室温下轻摇混匀孵育30min，再以PBS缓冲液漂洗掉多余的多聚赖氨酸，然后在多聚赖氨酸化的微泡中加入5μg/kg siRNA(50μM)荧光标记的siRNA，轻摇混匀孵育30min，低速离心5min，上层乳液即为载基因的siRNA-微泡复合体，下层为游离的siRNA，用荧光酶标仪检测各自溶液中RNA的含量(见附图1)。由附图1可知，脂质微泡已成功包裹siRNA。
[0036] 分别将3对siRNA引物加入自发性高血压大鼠(SHR)的肾脏近曲小管细胞中混合培养，2天后，通过荧光定量PCR检测GRK4表达情况，其具体步骤为：1)提取干扰GRK4表达后的细胞RNA；2)逆转录RNA：逆转录的反应条件为：37℃，15分钟，循环3次；85℃，5秒；4℃，15分钟，反应完成后放于-20℃保存；3)荧光定量PCR：设计GRK4及GAPDH的引物，序列如下：
[0037] GRK4上游引物：5’-tgtcctgatcctgaggc-3’，(SEQ ID NO.4)；
[0038] GRK4下游引物：5’-acacaccctgtcgcaaat-3’，(SEQ ID NO.5)；
[0039] GAPDH上游引物：5’-gacatgccgcctggagaaac-3’，(SEQ ID NO.6)；
[0040] GAPDH下游引物：5’-agcccaggatgccctttagt-3’，(SEQ ID NO.7)；
[0041] 荧光定量PCR反应条件：95℃(3分钟)；95℃(10秒)+55℃(30秒)，共39个循环；65℃到95℃共5秒。反应结束后，读取数据并作数据分析，结果见图2。由图2可知，利用设计的siRNA能够特异性在自发性高血压大鼠的肾脏近曲小管细胞中针对GRK4发挥特异性干扰作用，有效降低自发性高血压大鼠肾脏近曲小管细胞的GRK4的mRNA表达水平，其中1号引物效果最佳。
[0042] 进一步，在SHR大鼠中通过超声微泡介导GRK4siRNA干预GRK4表达。将微泡包裹的1号siRNA引物通过静脉注入自发性高血压大鼠后，利用超声照射(机械指数0.9，频率7.0MHz，照射时间5min，深度3cm)，在肾脏特异性地破裂微泡，使血管内的微泡破裂并释放siRNA，并使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放siRNA大量进入肾脏细胞，使微泡或释放的siRNA能够进入血管壁及组织间隙，从而发挥靶向作用。称取干扰GRK4表达后的肾脏组织1mg，然后提取肾脏总RNA，通过荧光定量PCR检测GRK4表达情况，实验步骤同上。反应结束后，读取数据并作数据分析，结果见图3，结果发现该引物同样可以有效降低自发性高血压大鼠肾脏的GRK4表达。
[0043] 实施例2.
[0044] 将12只SHR大鼠随机分为微泡组和“微泡+GRK4siRNA(1号引物)”组，将上述载有GRK4siRNA的微泡经大鼠尾静脉注入大鼠体内，注入微泡时启动超声，超声条件同实施例1，且每隔三天超声干预一次，持续6次，时间为20天。超声介导微泡破裂技术作用的SHR大鼠中，其肾脏尿钠排泄水平发生了明显的改变。首先，随着作用时间的延长，其24小时尿量与对照组相比，发生了明显增加(见附图4)；其次，尿钠排泄率(经电解质分析仪测定的尿钠浓度乘以24小时尿量)也随着作用时间的不断延长而明显增加(见附图5)。
[0045] 实施例3.
[0046] 将12只SHR大鼠随机分为微泡组和“微泡+GRK4siRNA(1号引物)”组，将上述载有GRK4siRNA的微泡经大鼠尾静脉注入大鼠体内，注入微泡时启动超声，超声条件同实施例1，且每隔三天超声干预一次，持续6次，时间为20天。在利用超声介导微泡破裂技术作用的SHR大鼠中，其平均动脉压相对于对照组明显降低(见附图6)。
[0047] 以上实验表明，本发明采用超声微泡技术携带siRNA至肾脏特异性破裂，能够有效抑制肾脏GRK4表达，增加尿钠和尿量排泄，实现靶向预防和治疗高血压的目的。
[0048] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。