表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达方法

摘要

本发明公开了一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达方法，该重组质粒通过将人乳头瘤病毒16亚型L1基因和SUMO标签基因插入表达质粒中构建而成。本发明对HPV16 L1基因进行优化，使其更适合在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白，同时，本发明首次应用Sumo标签表达系统在大肠杆菌中融合表达，更进一步增加了目的蛋白的可溶性，使表达的目的蛋白具有更高活性。本发明的方法显著提高了目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到70μg/ml，这一数值明显高于本发明目的蛋白在其他原核表达系统中的产量，从而满足工业化生产的要求。

权利要求

1.表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒，其特征在于，将人乳头瘤病毒

16亚型L1基因和Sumo-tag标签基因插入表达载体中构建而成；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中Sumo-tag标签基因3’末端与人乳头瘤病毒16亚型L1基因5’末端连接。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述Sumo-tag标签基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒16亚型L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种如权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将Sumo标签基因上游5’端引入限制性内切酶NcoI酶切位点和6*His-tag基因，在下游3’端引入限制性内切酶BsaI酶切位点，得到Sumo-tag标签基因；

（2）将Sumo-tag标签基因和pET-28a质粒分别用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒Ⅰ；重组质粒Ⅰ转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布在Kana+/LB固体培养基中培养，挑取单克隆接种于Kana+/LB液体培养基中培养，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，命名为重组质粒pET28-Sumo；

（3）设计合成人乳头瘤病毒16亚型L1基因，装入pUC57质粒中，根据基因序列设计合成正向引物H-F、反向引物H-R，进行PCR扩增，PCR扩增产物用限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化，备用；

（4）重组质粒pET28-Sumo用限制性内切核酸酶BsaI和Xho I双酶切消化，备用；

（5）将步骤（3）和（4）的双酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒Ⅱ；重组质粒Ⅱ转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布在Kana+/LB固体培养基中培养，挑取单克隆接种于Kana+/LB液体培养基中培养，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，即为表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒；

所述正向引物H-F、反向引物H-R为：

H-F：5’-TTGGTCTCTAGGTATGTCTCTGTGGCTGCCG-3’；

H-R：5’-AATCTCGAGTTACAGTTTACGTTTTTTACG-3’。

6.一种包含权利要求1所述的重组质粒的重组工程菌，其特征在于，所述重组质粒的宿主为大肠杆菌BL21（DE3）。

7.一种如权利要求6所述的重组工程菌诱导表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：+

（1）将重组工程菌接种于Kana/LB液体培养基中培养至OD450值为0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.3mM，然后于20℃诱导表达10h；

（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，清洗菌体，加入破菌缓冲液高压破碎，离心，收集上清液，纯化即得。

说明书

表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒、构建方法、重组工程菌及其表达方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。1977年Laverty(Laverty,C.R.,Russell,P.et al.1977)在电镜中观察到宫颈癌组织中存在HPV颗粒，1981年，Zur Hausen(H zur Hausen.et al.1981)提出HPV可能与宫颈癌发病有关的假设。此后，这一观点被越来越多的实验所证实。宫颈癌发病与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有直接关系，采用灵敏的检测方法，可以从几乎100％的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。

[0003] 根据核酸序列同源性，目前发现的HPV约有200多种基因型，其中与人类生殖道感染有关的有40多种，依致病性不同，可分为高危型和低危型两类，HPV感染者发展为子宫颈癌的几率约0.2％。其中宫颈癌患者中，约50～60％是由HPV-16感染引起(Walboomers J.M.et al.,1999)，在世界范围内，HPV-16是与宫颈癌联系最紧密的基因型，并随地域变化很小(Doorbar,J.,2005)。另外HPV18、33、45、52和58与宫颈癌的发生高度相关。全球每年有约50万妇女患宫颈癌(Koutsky L.A.et al.,1988)，其中约27万因宫颈癌死亡(80％以上在发展中国家)，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌。

[0004] 因此，开发一种价格适宜、保护性良好的宫颈癌疫苗，特别是针对HPV-16的疫苗，对于降低妇女宫颈癌发病和死亡率意义重大。

[0005] HPV基因组长约8kb，分子量约为5×106道尔顿，直径为50～60nm，正二十面体结构。核心为单拷贝的基因组DNA，病毒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。其中，L1蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，为主要衣壳蛋白，是高度保守的糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依据，同时体外表达的HPV L1蛋白可自组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)(Kirnbauer,R.et al.,1992)。L2蛋白为次要衣壳蛋白是高度可变核蛋白，反映HPV抗原的多态性(Wang,J.W.,Roden,R.B.,2013)。而且在病毒壳粒中大多数L2蛋白在L1蛋白内部，因此，在开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白L1开发具有更好的针对性。

[0006] 根据现有研究结果，L1基因是一个好的免疫预防靶。在细菌中表达的L1蛋白或使用疫苗载体的L1蛋白用于免疫，可保护动物不受病毒感染。在酵母细胞及杆状病毒表达系统中表达HPV L1基因组装成病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。再者，VLP在形态学上与HPV毒粒完全相同，但不含有潜在的病毒致癌基因，因此能诱导抗体应答而无感染或致癌危险性，在一定程度上，能够替代天然病毒，经免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体，有效保护机体免受同型病毒的感染或再感染，因此VLP是HPV疫苗试验中最好的免疫原候选者之一。

[0007] 最早关于HPV衣壳蛋白装配成VLP的研究是20世纪90年代用痘苗病毒表达系统表达的HPV16 L1和L2蛋白(Zhou J.et al.,1991)。Rose等用杆状病毒表达系统成功表达了HPV L1蛋白并自组装成VLP(Rose R.C.et al.,1993)，专利WO9420137(Rose R.C.et al.)公开了杆状病毒表达系统制备L1蛋白及VLP。Hofmann在酿酒酵母中表达了HPV6a L1以及L1+L2蛋白，并观察到了自组装成的VLP(Hofmann K.J.et al.,1995)，专利WO9531532(Hofmann K.J.et al.)公开了由酵母表达系统制备重组VLP(L1，L1+L2)的方法。专利US5888516(Kathrin U.Jansen,et al.)也在酿酒酵母中表达了HPV 16 L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP。

[0008] 目前，有多家国外公司的HPV疫苗进入临床实验阶段，其中包括DNA疫苗以及治疗性宫颈癌疫苗。其中由葛兰素史克(Glaxo Smith Kline,GSK)公司开发的有HPV16、18病毒衣壳蛋白L1在昆虫细胞中自行组装成的二价VLPs疫苗(商品名 疫苗)及默克(Merck)公司开发的是HPV6、11、16、18病毒衣壳蛋白L1在酵母菌中组装而成的四价VLPs疫苗(商品名 疫苗)均已在国外上市。2014年12月10日，FDA官网宣布：Merck公司研发的 9(9价重组HPV疫苗)获批。

[0009] 但是目前尚无利用Sumo标签大肠杆菌系统中用于促进HPV 16 L1表达及用于制备宫颈癌疫苗的报道。

发明内容

[0010] 本发明所要解决的技术问题是提供一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒、构建方法、重组工程菌及其表达方法，以提高HPV 16 L1蛋白的可溶性、活性及表达量。

[0011] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒，将人乳头瘤病毒16亚型L1基因和Sumo-tag标签基因插入表达载体中构建而成。

[0012] 所述重组质粒中Sumo-tag标签基因3’末端与人乳头瘤病毒16亚型L1基因5’末端连接。

[0013] 所述重组质粒包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

[0014] 所述Sumo-tag标签基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0015] 所述人乳头瘤病毒16亚型L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0016] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

[0017] (1)将Sumo标签基因上游5’端引入限制性内切酶Nco I酶切位点和6*His-tag基因，在下游3’端引入限制性内切酶Bsa I酶切位点，得到Sumo-tag标签基因；

[0018] (2)将Sumo-tag标签基因和pET-28a质粒分别用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切，二者的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒Ⅰ；重组质粒Ⅰ转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布在Kana+/LB固体培养基中培养，挑取单克隆接种于Kana+/LB液体培养基中培养，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，命名为重组质粒pET28-Sumo；

[0019] (3)设计合成人乳头瘤病毒16亚型L1基因，装入pUC57质粒中，根据基因序列设计合成正向引物H-F、反向引物H-R，进行PCR扩增，PCR扩增产物用限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化，备用；

[0020] (4)重组质粒pET28-Sumo用限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化，备用；

[0021] (5)将步骤(3)和(4)的双酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒Ⅱ；重组质粒Ⅱ转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布在Kana+/LB固体培养基中培养，挑取单克隆+接种于Kana /LB液体培养基中培养，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，即为表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒。

[0022] 所述正向引物H-F、反向引物H-R为：

[0023] H-F：5’-TTGGTCTCTAGGTATGTCTCTGTGGCTGCCG-3’；

[0024] H-R：5’-AATCTCGAGTTACAGTTTACGTTTTTTACG-3’。

[0025] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种包含表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒的重组工程菌，所述重组质粒的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

[0026] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种所述重组工程菌诱导表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的方法，包括以下步骤：

[0027] (1)将重组工程菌接种于Kana+/LB液体培养基中培养至OD450值为0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.3mM，然后于20℃诱导表达10h；

[0028] (2)诱导表达结束后，离心收集菌体，清洗菌体，加入破菌缓冲液高压破碎，离心，收集上清液，纯化即得。

[0029] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种诱导表达的可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白在制备HPV疫苗方面的应用。

[0030] 本发明有益效果

[0031] (1)本发明对HPV16 L1基因进行优化，使其更适合在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白，同时，本发明首次应用Sumo标签表达系统在大肠杆菌中融合表达HPV16 L1，Sumo标签具有分子伴侣功能，能促进目的蛋白的正确折叠等特点，同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性，经实验验证HPV16 L1基因仅以His标签融合形式在pET28a载体中几乎无目的蛋白表达，而本发明中与Sumo标签融合表达时，目的蛋白的可溶性有明显增加，如图3所示，可溶性目的蛋白含量约占到总蛋白含量的50％，经血凝实验证实其血凝价明显提高，说明表达的可溶性目的蛋白具有更高活性。

[0032] (2)本发明的方法显著提高了目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到70μg/ml，这一数值明显高于本发明目的蛋白在其他原核表达系统中的产量，从而满足工业化生产的要求。

[0033] (3)本发明在保证表达产物天然活性的前提下，经过发酵纯化，得到自组装成稳定的病毒样颗粒(VLP)的HPV16 L1蛋白。实验表明，纯化的VLP能使小鼠产生较高滴度的抗体，并通过血凝抑制试验(HI)和假病毒中和实验证明其具备中和活性。以上实验结果说明，通过大肠杆菌病毒样颗粒技术平台制备的HPV16L1 VLP能用于生产预防宫颈癌的疫苗。

[0034] (4)本发明提供了一种原核表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的方法，该方法将HPV16 L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、活性高的重组表达蛋白。该方法同样适用于HPV 18、33、45、52、58等其他常见高危亚型。

附图说明

[0035] 以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0036] 图1为重组质粒pSUMO-HPV16L1的构建示意图；

[0037] 图2为重组质粒Ⅱ菌液PCR鉴定图；其中，

[0038] M为DL2000分子量标记；1-5为重组质粒Ⅱ；

[0039] 图3为HPV16 L1的大肠杆菌表达菌株诱导表达SDS-PAGE及Western-Blot鉴定图；图中，a为SDS-PAGE鉴定图，b为Western-Blot鉴定图；其中，

[0040] M为标准蛋白Marker；1为pSUMO-HPV16L1诱导表达超声上清；2为pSUMO-HPV16L1诱导表达超声沉淀；

[0041] 图4为HPV16 L1用Sumo蛋白酶酶切纯化后的Western-Blot鉴定图；其中，[0042] M为标准蛋白Marker；1-2为酶切纯化后的HPV16 L1蛋白；

[0043] 图5为HPV16 L1 VLP的动态光散射(DLS)检测图；

[0044] 图6为HPV16 L1 VLP的投射电镜(TEM)检测图；

[0045] 图7为ELISA法血清抗体效价测定图；其中，NC为对照样；

[0046] 图8为血凝抑制试验测定中和抗体效价；其中，NC为对照样。

具体实施方式

[0047] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0048] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

[0049] 本发明的实施例中DNA延伸和PCR扩增，均采用购自TaKaLa公司的高保真热启动HS(Premix)酶。限制性内切酶BsaI、Xho I购自NEB(New England Biolabs,
Inc.)。

[0050] 本发明的实施例中，使用的pET-28a质粒购自Novagen(Merck,Germany)；使用的抗HPV16 L1的鼠单抗购自Abcam(England)，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自Abbkine(USA)。

[0051] 本发明的实施例中，纯化步骤中使用的破菌缓冲液配方为：50mM MOPS(3-吗啉丙磺酸)，pH7.0、0.5M NaCl，质量分数0.05％Tween-80；清洗缓冲液：50mM MOPS，pH7.0、0.5 M NaCl。

[0052] 本发明所用试剂为本领域的常规试剂，培养基的配制方法如下：

[0053] 1、LB液体培养基：

[0054] Tryptone(胰蛋白胨)        1.0g

[0055] Yeast Extract(酵母浸出物) 0.5g

[0056] NaCl                      0.8g

[0057] 按以上配方分别称量后，先加入纯水约50mL，搅拌使其充分溶解，然后用5mol/L NaOH调pH值至7.0，随后加入去离子水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存。

[0058] 2、Kana+/LB固体培养基：

[0059] 按照1中的方法配制100mL LB液体培养基，然后加入1.2g琼脂粉(Agar powder)，121℃高压蒸汽灭菌15min。待培养基冷却至50～60℃时，加入Kanamycin贮存液，至终浓度为50μg/mL，充分混匀，避免产生气泡，铺制平板，30～35mL/90mm培养皿。

[0060] 3、Kana+/LB液体培养基：

[0061] 按照1中的方法配制100mL LB液体培养基，待培养基冷却至50～60℃时，加入Kanamycin贮存液，至终浓度为50μg/mL，充分混匀，避免产生气泡。

[0062] 4、10％FBS的DMEM

[0063] 将胎牛血清(FBS)和DMEM培养基按照体积比1:9混合而成。

[0064] 实施例1带SUMO标签的重组表达质粒的构建

[0065] 本发明带SUMO标签的重组表达质粒是在pET28a骨架基础上改建而来，具体步骤如下：

[0066] 首先，将SUMO的基因上游5’端引入限制性内切酶Nco I酶切位点和6*His-tag基因，在下游3’端引入限制性内切酶Bsa I酶切位点，利用Sumo蛋白酶酶切位点的特殊性质(切割位点为Gly Gly，其编码基因GGAGGT)，结合Bsa I酶切位点的特异性，可以实现重组表达蛋白的N端无残留切割。

[0067] Bsa I酶切位点为：

[0068] Sumo-tag标签基因的序列如下：

[0069] CCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGTTCCCTGCAGGACTCTGAAGTTAACCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTTAAGCCAGAAGTTAAGCCGGAGACTCACATCAACCTGAAGGTGTCCGATGGTTCTTCTGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCGTTCGCTAAACGTCAGGGTAAGGAAATGGACTCCCTGCGTTTCCTGTACGACGGTATTCGTATTCAAGCTGATCAGGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGTTGAGACCACTAGGGATCC(SEQ ID NO.1)

[0070] 随后，将合成的Sumo-tag标签基因用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切消化基因片段，同时pET-28a质粒也用Nco I和BamH I双酶切消化，酶切体系如下：

[0071]

[0072] 总反应体系为60μl，具体反应条件：37℃反应3h。

[0073] 将酶切消化后的基因片段和相应质粒(pET-28a)的酶切产物经回收后用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒Ⅰ，连接体系如下：

[0074]

[0075] 总反应体系为20μl，具体反应条件：16℃连接过夜。

[0076] 重组质粒Ⅰ分别转化大肠杆菌感受态细胞JM109，具体步骤如下：

[0077] a)取一只100μL感受态细胞JM109置于冰浴中。

[0078] b)向感受态细胞中加入10μL重组质粒Ⅰ轻轻混匀，冰浴中静置30min。

[0079] c)将离心管置于42℃水浴，热激60s，迅速移至冰水混合物中，静置3-5min。

[0080] d)向上述离心管中加入900μL LB液体培养基，37℃，220r/min振荡培养50min。

[0081] e)将上述离心管4000r/min离心4min，弃去部分培养基，留100μL左右重悬菌体。

[0082] f)将上述100μL已转化的感受态细胞加到Kana+/LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒涂布均匀。

[0083] g)倒置平板于恒温培养箱中，37℃恒温过夜培养。

[0084] 第二天待单克隆长起时，挑取单菌落接种于Kana+/LB液体培养基中培养，37℃，220r/min振荡培养5h，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落。

[0085] PCR鉴定用引物序列分别为：

[0086] 上游引物S-F：5’-CCATGGGTCATCACCATCAT-3’(SEQ ID NO.2)

[0087] 下游引物S-R：5’-ACCTCCAATCTGTTCGCGGT-3’(SEQ ID NO.3)

[0088] 具体PCR鉴定反应体系如下：

[0089]

[0090] PCR反应条件：95℃预变性8min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s；共30个循环；72℃延伸10min。

[0091] 对鉴定为阳性菌落的，按照TAXYGEN AxyPrep Plasmid Miniprep Kit说明书提取阳性菌落质粒，进行测序，经测序含有正确的Sumo-tag基因的，命名为重组质粒pET28-Sumo。

[0092] 实施例2 HPV16 L1基因的克隆

[0093] 1、HPV16 L1基因序列的设计合成

[0094] 本发明的HPV16 L1基因序列是经过大肠杆菌偏爱密码子优化的DNA序列，即通过密码子最优化和对最优密码子频率进行一定修正获得的DNA序列，具体如下：

[0095] 首先，对天然的HPV 16L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出一个全新的HPV16 L1 DNA序列，同时，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，需要对最优的密码子频率进行一定的修正，最终获得一个全新的HPV16 L1 DNA序列，如下：

[0096] ATGTCTCTGTGGCTGCCTTCTGAGGCCACTGTCTACCTGCCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACCGATGAATATGTTGCACGCACCAACATCTATTATCATGCAGGTACCTCCCGTCTGCTGGCAGTTGGTCATCCGTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAACAACAAAATCCTGGTTCCTAAAGTATCTGGTCTGCAATACCGTGTATTTCGTATCCATCTGCCTGACCCCAACAAGTTCGGTTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCAGATACCCAACGTCTGGTGTGGGCCTGCGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCACTGGGCGTTGGCATAAGCGGCCATCCTCTGCTGAACAAACTGGATGACACCGAAAACGCTTCTGCTTATGCAGCAAACGCAGGTGTGGATAACCGTGAATGTATCTCTATGGATTACAAACAAACCCAACTGTGTCTGATTGGTTGCAAACCACCTATCGGTGAACACTGGGGCAAAGGCTCCCCATGTACCAACGTTGCAGTAAACCCAGGTGATTGTCCACCACTGGAGCTGATCAACACCGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACCCTGCAGGCTAACAAATCTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACCTCTATTTGCAAATATCCAGATTATATTAAAATGGTGTCTGAACCATATGGCGACAGCCTGTTTTTTTATCTGCGTCGTGAACAAATGTTTGTTCGTCATCTGTTTAACCGTGCTGGTGCTGTTGGTGAAAACGTACCAGACGATCTGTACATTAAAGGCTCTGGTTCTACTGCAAACCTGGCCTCTTCTAACTATTTTCCTACCCCTTCTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATCTTCAACAAACCTTATTGGCTGCAACGTGCACAGGGCCACAACAACGGCATTTGTTGGGGCAATCAACTGTTCGTGACTGTTGTTGATACTACCCGCTCTACCAACATGTCTCTGTGTGCTGCCATCTCTACTTCTGAAACTACCTATAAAAACACTAACTTTAAGGAGTACCTGCGTCATGGTGAGGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATCACCCTGACTGCAGACGTTATGACCTACATCCATTCTATGAACTCCACTATTCTGGAGGACTGGAACTTTGGTCTGCAACCTCCGCCAGGTGGCACCCTGGAAGATACTTATCGTTTTGTAACCTCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACCCCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCGCTGAAAAAATACACTTTTTGGGAAGTAAACCTGAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTGGATCAGTTTCCTCTGGGTCGCAAATTTCTGCTGCAAGCAGGTCTGAAGGCCAAACCAAAATTTACCCTGGGTAAACGTAAAGCTACCCCGACCACCTCTTCTACCTCTACCACTGCTAAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAA(SEQ ID NO.4)

[0097] 经优化获得的HPV16 L1 DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成后的基因直接装入pUC57质粒中，命名为重组质粒pUC-16L1。

[0098] 2、HPV16 L1基因的PCR扩增

[0099] 2.1、引物序列的设计和合成

[0100] 根据HPV16 L1基因序列设计合成正向引物H-F、反向引物H-R，进行PCR扩增。

[0101] 上游引物H-F：5’-TTGGTCTCTAGGTATGTCTCTGTGGCTGCCT-3’(Bsa I)(SEQ ID NO.5)[0102] 下游引物H-R：5’-AATCTCGAGTTACAGCTTACGTTTTTTGCG-3’(Xho I)(SEQ ID NO.6)[0103] 其中，正向引物包括一个Bsa I限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的Xho I限制性内切酶位点，所述酶切位点见引物序列中的下划线所示。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0104] 2.2、PCR扩增

[0105] PCR反应体系为：

[0106]

[0107] PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s；共30个循环；72℃延伸10min。

[0108] 将PCR扩增产物用质量分数1％琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示PCR扩增产物大小约为1518bp，与预期相符，证明获得了全长密码子优化的HPV16 L1基因。

[0109] 实施例3表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒的构建

[0110] 将重组质粒pET28-Sumo和PCR扩增产物(HPV16 L1基因)分别进行限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化，具体反应条件如下：

[0111] 酶切消化体系为：

[0112] 总体系为50μL，反应条件为37℃，4h。

[0113] 随后分别回收重组质粒pET28-Sumo和HPV16 L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒Ⅱ，连接体系如下：

[0114]

[0115] 总反应体系为20μl，具体反应条件：16℃连接过夜。

[0116] 重组质粒Ⅱ分别转化大肠杆菌感受态细胞JM109，具体步骤如下：

[0117] h)取一只100μL感受态细胞JM109置于冰浴中。

[0118] i)向感受态细胞中加入10μL重组质粒Ⅱ连接产物轻轻混匀，冰浴中静置30min。

[0119] j)将离心管置于42℃水浴，热激60s，迅速移至冰水混合物中，静置3-5min。

[0120] k)向上述离心管中加入900μL LB液体培养基，37℃，220r/min振荡培养50min。

[0121] l)将上述离心管4000r/min离心4min，弃去部分培养基，留100μL左右重悬菌体。

[0122] m)将上述100μL已转化的感受态细胞加到Kana+/LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒涂布均匀。

[0123] n)倒置平板于恒温培养箱中，37℃恒温过夜培养。

[0124] 第二天待单克隆长起时，挑取单菌落至2mL Kana+/LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养5h，进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系为：

[0125]

[0126] PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s；共30个循环；72℃延伸10min。

[0127] PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性菌落(见图2)，提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的(如下所示)，命名为重组质粒pSUMO-HPV16L1，即为表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒。

[0128] CCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGTTCCCTGCAGGACTCTGAAGTTAACCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTTAAGCCAGAAGTTAAGCCGGAGACTCACATCAACCTGAAGGTGTCCGATGGTTCTTCTGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCGTTCGCTAAACGTCAGGGTAAGGAAATGGACTCCCTGCGTTTCCTGTACGACGGTATTCGTATTCAAGCTGATCAGGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGTTGAGACCACTAGGGATCCATGTCTCTGTGGCTGCCTTCTGAGGCCACTGTCTACCTGCCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACCGATGAATATGTTGCACGCACCAACATCTATTATCATGCAGGTACCTCCCGTCTGCTGGCAGTTGGTCATCCGTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAACAACAAAATCCTGGTTCCTAAAGTATCTGGTCTGCAATACCGTGTATTTCGTATCCATCTGCCTGACCCCAACAAGTTCGGTTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCAGATACCCAACGTCTGGTGTGGGCCTGCGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCACTGGGCGTTGGCATAAGCGGCCATCCTCTGCTGAACAAACTGGATGACACCGAAAACGCTTCTGCTTATGCAGCAAACGCAGGTGTGGATAACCGTGAATGTATCTCTATGGATTACAAACAAACCCAACTGTGTCTGATTGGTTGCAAACCACCTATCGGTGAACACTGGGGCAAAGGCTCCCCATGTACCAACGTTGCAGTAAACCCAGGTGATTGTCCACCACTGGAGCTGATCAACACCGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTTACTACCCTGCAGGCTAACAAATCTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACCTCTATTTGCAAATATCCAGATTATATTAAAATGGTGTCTGAACCATATGGCGACAGCCTGTTTTTTTATCTGCGTCGTGAACAAATGTTTGTTCGTCATCTGTTTAACCGTGCTGGTGCTGTTGGTGAAAACGTACCAGACGATCTGTACATTAAAGGCTCTGGTTCTACTGCAAACCTGGCCTCTTCTAACTATTTTCCTACCCCTTCTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATCTTCAACAAACCTTATTGGCTGCAACGTGCACAGGGCCACAACAACGGCATTTGTTGGGGCAATCAACTGTTCGTGACTGTTGTTGATACTACCCGCTCTACCAACATGTCTCTGTGTGCTGCCATCTCTACTTCTGAAACTACCTATAAAAACACTAACTTTAAGGAGTACCTGCGTCATGGTGAGGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATCACCCTGACTGCAGACGTTATGACCTACATCCATTCTATGAACTCCACTATTCTGGAGGACTGGAACTTTGGTCTGCAACCTCCGCCAGGTGGCACCCTGGAAGATACTTATCGTTTTGTAACCTCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACCCCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCGCTGAAAAAATACACTTTTTGGGAAGTAAACCTGAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTGGATCAGTTTCCTCTGGGTCGCAAATTTCTGCTGCAAGCAGGTCTGAAGGCCAAACCAAAATTTACCCTGGGTAAACGTAAAGCTACCCCGACCACCTCTTCTACCTCTACCACTGCTAAACGCAAAAAACGTAAGCTGTAA(SEQ ID NO.7)

[0129] 实施例4表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组工程菌的构建

[0130] 将重组质粒pSUMO-HPV16L1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体步骤如下：

[0131] a)取一只100μL感受态细胞BL21(DE3)置于冰浴中。

[0132] b)向感受态细胞中加入1μL重组质粒pSUMO-HPV16L1轻轻混匀，冰浴中静置30min。

[0133] c)将离心管置于42℃水浴，热激50s，迅速移至冰水混合物中，静置3-5min。

[0134] d)向上述离心管中加入900μL LB液体培养基，37℃，220r/min振荡培养50min。

[0135] e)将上述离心管4000r/min离心4min，弃去部分培养基，留100μL左右重悬菌体。

[0136] f)将上述100μL已转化的感受态细胞加到Kana+/LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒涂布均匀。

[0137] g)倒置平板于恒温培养箱中，37℃恒温过夜培养。

[0138] 第二天待单克隆长起时，挑取单菌落至2mL Kana+/LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养5h，进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系为：

[0139]

[0140] PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s；共30个循环；72℃延伸10min。

[0141] PCR扩增片段大小约1518bp，与预期结果相符合，随机选择1株阳性菌落提取重组质粒pSUMO-HPV16L1送样测序，测序结果正确的菌株即为HPV16 L1的大肠杆菌表达菌株。

[0142] 实施例5可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的诱导表达

[0143] 1、HPV16 L1的大肠杆菌表达菌株的表达和鉴定

[0144] 将HPV16 L1的大肠杆菌表达菌株接种于Kana+/LB液体培养基中培养至OD450值约为0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.3mM，然后于20℃诱导表达10h；诱导表达结束后，离心收集菌体，经PBS重悬后超声破碎，分别取超声破碎上清和沉淀用SDS-PAGE及West-Blotting鉴定，结果如图3所示，从图中可以看出，该表达菌株中HPV 16L1重组蛋白表达量高，且目的蛋白以可溶性表达为主。

[0145] 2、HPV16 L1重组蛋白的纯化

[0146] 将剩余的菌体沉淀与清洗缓冲液按照重量比1:5的比例混合，摇匀，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀和破菌缓冲液按照重量比1:10的比例混合，摇匀，高压破碎，将高压破碎的破菌液12000r/min、4℃离心30min，收集上清液。

[0147] 将上清液通过强阳离子交换柱POROS 50 HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初纯，洗脱方式为：100％缓冲液A(0.5M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，0.05％Tween-80)至100％的缓冲液B(2M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，0.05％Tween-80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测。

[0148] 将含有HPV16 L1蛋白的洗脱组分合并后，使用CHT(BIO-RAD Type II)层析柱精纯，上样体积为柱体积的3％，洗脱方式为：缓冲液C(50mM PB缓冲液，0.6mM NaCl，pH7.5，0.05％Tween-80)洗脱。取20μL上样于质量分数12％SDS-PAGE胶，电泳后进行考马斯亮兰染色和蛋白质印迹(具体方法参考《分子克隆指南》)，得到纯化的目的蛋白样品。

[0149] 将获得的目的蛋白用Sumo蛋白酶酶切后获得纯化的HPV16 L1蛋白，结果如图4所示，图4结果显示，酶切后获得的HPV16 L1蛋白分子量大小在56kDa处，与预期结果相符合，证明成功获得自组装成病毒样颗粒(VLP)的HPV16 L1蛋白。

[0150] 3、HPV16 L1重组蛋白的表达含量测定

[0151] 采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的目的蛋白的浓度。

[0152] 以纯化的HPV16 L1蛋白的自组装VLP做标准蛋白浓度曲线，以诱导前菌体做阴性对照，采用ELISA夹心法检测HPV16 L1基因在大肠杆菌中的发酵表达量，具体步骤如下：

[0153] 用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如：2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，作为标准浓度，通过ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应OD450检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如50，100，200，400倍。测出的OD450值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为μg/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。由于破菌液是由菌体湿重∶破菌缓冲液＝1:10配制的，所以发酵菌体的目的蛋白表达量(单位为μg/g菌体)为10×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌体/L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为μg/L发酵液)，VLP发酵表达结果见表1。

[0154] 发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)＝稀释倍数×标准目的蛋白浓度(μg/mL)×OD450(发酵破菌液上清)/OD450(标准目的蛋白浓度)；

[0155] 发酵目的蛋白表达量浓度(μg/L发酵液)＝10×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)×发酵液菌体密度(g菌体/L发酵液)。

[0156] 表1 VLP发酵表达结果

[0157]

[0158] 由表1的结果可见，本发明的HPV16 L1蛋白基因的优化序列，不仅能够在大肠杆菌中表达HPV16 L1蛋白，而且表达量较高，能够满足工业化生产的要求。

[0159] 4、动态光散射(DLS)检测

[0160] 将纯化获得的HPV16 L1 VLP通过动态光散射DLS技术检测，结果如图5所示，DLS结果显示，本发明获得的VLP纯度高，结构均一性较好。

[0161] 5、投射电镜(TEM)观察

[0162] 将纯化获得的HPV16 L1 VLP，经质量分数2％磷钨酸负染，透射电镜观察VLP形态，直径约55-60nm，大小均匀，呈现为空心形态，结果如图6所示。

[0163] 实施例6 HPV16 L1病毒样颗粒(VLP)免疫原性鉴定

[0164] 1、动物免疫

[0165] 参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将纯化获得的HPV16 L1 VLP，制成具有免疫原性的HPV 16 L1疫苗。

[0166] 选取6-8周Balb/c雌性小鼠12只，随机分成3组：采用腹部注射，第1组实验组小鼠4只，注射量为40μg VLP/只；第2组实验组小鼠4只，注射量为60μg VLP/只，对照组4只，每只注射等体积PBS液体，免疫共计3次，分别于第0、14、28天皮下注射免疫末次免疫后的14天，收集HPV 16 L1 VLP抗血清，分装后-80℃保存。

[0167] 2、血清抗体效价测定(ELISA法)

[0168] 用包被液稀释纯化的HPV16 L1 VLP至1μg/mL，向酶标板每个孔中各加50μl，4℃过夜。移去包被液，用PBST洗涤3次。用300μl封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2h。每孔加入用稀释缓冲液(PBST)以1:400稀释的被检血清(HPV 16 L1 VLP抗血清)各50μl，于37℃保温1小时后移去血清液，用PBST洗涤3次。然后向每孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各50μl，37℃保温0.5h后移去，用PBST洗涤液洗涤6次；然后向凹孔中加入50μl DAB显色液，室温避光作用20min后加50μl 2M H2SO4终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值。结果如图7所示。

[0169] 3、血凝(Hemagglutination,HA)与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition assays，HI)检测血清中和抗体效价

[0170] 3.1、红细胞制备方法

[0171] 用灭菌注射器吸取1ml新鲜小鼠血于含有1,000U的肝素(抗凝)的灭菌离心管内中；向上述离心管中加入9ml PBS中以1500r/min离心5min，弃上清液；用10ml PBS重悬血球，2000r/min离心10min，弃上清，如此将红细胞洗涤三次；最后根据所需用量，用PBS配成体积分数1％的小鼠红细胞悬液。

[0172] 3.2、HA

[0173] 在96孔微量血凝板上进行，自左至右各孔加50μL PBS；于左侧第1孔加50μL HPV 16L1VLP，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，吸弃50μL；第11、12孔为红细胞对照；稀释完毕后自右至左依次向各孔加入体积分数1％小鼠红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡混匀，室温放置3h后分析结果，判断HPV16 VLP凝集鼠红细胞的最低浓度。

[0174] 3.3、HI

[0175] HPV 16 L1 VLP抗血清与等体积的体积分数1％的小鼠红细胞悬液混合，4℃过夜以除去抗血清中的非特异凝集素，4℃1500r/min离心5min，弃红细胞。将起始浓度为1:20经倍比稀释后的HPV 16 L1 VLP免疫的小鼠血清50μL分别与能凝集鼠红细胞的HPV16 VLP最低浓度50μL混合加入血凝板，置37℃1h，再加入等体积体积分数1％的小鼠红细胞悬液混合后，室温放置3h后观察分析结果，判断单抗的血凝抑制效价。以能完全抑制血细胞凝集的血清最高稀释倍数为血凝抑制效价。如图8所示，血凝抑制效价为1:5120。

[0176] 4、血清抗体对假病毒的阻断作用的实验

[0177] 4.1、假病毒的制备

[0178] 将报告基因质粒(pcDNA3.1-eGFP)与结构基因质粒pShell16(Invitrogen)分别共转染293FT细胞(Invitrogen)。转染48h后用胰酶消化并收集细胞，用10ml DMEM(含10％FBS)重悬细胞，并转移到一个细胞离心瓶中，1500r/min离心5min，弃上清，加1ml DPBS洗涤细胞，1500r/min离心5min；弃上清，加入DPBS溶液洗涤细胞，并将悬液移入新的离心管中，1500r/min离心10min；弃上清。估计离心管中细胞颗粒的体积(可用加入等量液体的空硅化管测量)，加入约为细胞沉淀1.5倍体积的DPBS缓冲液(含9.5mmol/L MgCl2和终浓度10μg/ml双抗(Pen/Strep))简短涡旋或轻弹以重悬细胞。1500r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀以1×108个/ml的浓度溶于DPBS溶液[含9.5mmol/L MgCl2、0.5％Triton X-100、0.1％RNase mix(Ambion)，2.5％的1M硫酸铵(pH9、经0.22μm滤器过滤除菌)]中，一般情况下细胞沉淀的体积会占最终体积的1/3左右。置于37℃培养箱中(无CO2)24h，隔一段时间通过上下颠倒使裂解液混匀，特别是最初的两个小时要频繁一些。将混合物置于冰上5min，4℃，5000r/min离心5min。上清移至新的硅化离心管中。沉淀用2倍体积的含0.8M NaCl的DPBS清洗重悬后，置于冰上10～20min。4℃5000r/min离心5min，留上清液，将此次上清与上一步上清混合，即获得假病毒液，-80℃保存。

[0179] 4.2、假病毒病毒滴度测定

[0180] 将293FT细胞铺于24(96)孔DMEM细胞培养板中，每孔细胞数为2×105个，于37℃和-25％CO2下在培养箱中培养72h。假病毒液用含10％FBS的DMEM进行10倍梯度稀释(10 ～10-6)，分别取100μl不同浓度假病毒稀释液感染铺于24孔细胞培养板中的293FT细胞。培养
48h-72h后置于倒置荧光显微镜下采用蓝光激发观察，采集荧光图像。同时用流式细胞仪检测孔中表达GFP的细胞数量，测定假病毒的滴度(TU/ml)，假病毒的滴度结果为3×107TU/ml。

[0181] 4.3、假病毒中和试验

[0182] 将293FT细胞铺于96孔细胞培养板中(1.5×104/孔)，37℃，5％CO2孵箱中培养。12h后进行中和实验，将待检血清样品(HPV 16 L1 VLP抗血清)用10％FBS的DMEM从10倍起进行连续倍比稀释，然后取50μl分别与50μl稀释于10％FBS的DMEM的假病毒液[200TCID50(组织细胞半数感染剂量)]混合。4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞96孔细胞培养板中，37℃培养48h后用流式细胞仪分别检测各孔细胞的感染率。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。感染抑制率＝(1－阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100％。20倍稀释后能达到50％以上感染抑制率的单抗为中和单抗。流式结果显示抗体抑制效价约为5120，该结果与HI结果一致。