一种诊治鼻咽癌的分子标志物

摘要

本发明公开了一种用于鼻咽癌早期诊断的分子标志物‑SMPD3基因及其表达产物。本发明利用QPCR和Western blot方法证明SMPD3基因在鼻咽癌患者和正常人中存在差异表达，可以作为早期诊断鼻咽癌的指标。另外，本发明还公开了SMPD3基因及其表达产物可以作为鼻咽癌治疗的靶标，用于指导新药的研发。

权利要求

1.检测SMPD3基因表达的产品在制备诊断鼻咽癌的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测SMPD3基因表达以诊断鼻咽癌的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增SMPD3基因的引物；所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增SMPD3基因的引物；所述用免疫检测诊断鼻咽癌的产品包括：与SMPD3蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断鼻咽癌的产品包括：与SMPD3基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断鼻咽癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SMPD3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SMPD3基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括的一对特异扩增SMPD3基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测SMPD3基因表达的试剂；

所述试剂包括检测SMPD3基因mRNA的引物和/或探针、检测SMPD3蛋白的抗体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测SMPD3基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

7.一种诊断鼻咽癌的工具，其特征在于，所述工具包括检测SMPD3基因表达的试剂；所述试剂包括检测SMPD3基因mRNA的引物和探针、或检测SMPD3基因mRNA的探针。

8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测SMPD3基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

9.SMPD3基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述促进剂包括促进SMPD3基因表达的试剂、促进SMPD3基因表达产物稳定性的试剂、促进SMPD3基因表达产物活性的试剂、促进SMPD3基因表达产物功能的试剂。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，促进SMPD3基因表达的试剂包括含有SMPD3基因的试剂、携带SMPD3基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SMPD3蛋白质的试剂。

说明书

一种诊治鼻咽癌的分子标志物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及SMPD3基因在鼻咽癌的诊断、治疗中的用途。

背景技术

[0002] 鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。中国是全球范围内鼻咽癌最高发的地方，尤其在华南地区和广东省，所以鼻咽癌在我国又被称为“广东瘤”。据中山大学肿瘤防治中心统计，每年新诊断的鼻咽癌病例接近3000例，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。

[0003] 目前早期的鼻咽癌患者治疗效果非常好，5年生存率可以高达90％以上，中晚期患者单纯放疗的疗效较差，5年生存率仅50％左右。因此对鼻咽癌进行早起诊断能够有效提高病人的生存率，但是目前用于鼻咽癌早期诊断方法包括EB病毒血清学标志物、鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间粘附因子以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，但是它们缺乏足够的灵敏度和特异性。基于这样的现状，本发明提供了一种灵敏度和特异性较高的基因诊治标志物，该标志物具有广泛的临床应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种可用于鼻咽癌早期诊断的分子标志物。相比传统的鼻咽癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断鼻咽癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明提供了检测SMPD3基因表达的产品在制备诊断鼻咽癌的工具中的应用。

[0007] 进一步，所述检测SMPD3基因表达的产品包括检测SMPD3基因mRNA水平的产品、和/或检测SMPD3蛋白水平的产品。

[0008] 进一步，所述检测SMPD3基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测SMPD3基因及其表达产物的表达水平以诊断鼻咽癌的产品。

[0009] 进一步，所述用RT-PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增SMPD3基因的引物；所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增SMPD3基因的引物；所述用免疫检测诊断鼻咽癌的产品包括：与SMPD3蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断鼻咽癌的产品包括：与SMPD3基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断鼻咽癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SMPD3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SMPD3基因的核酸序列杂交的探针。

[0010] 所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括的一对特异扩增SMPD3基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

[0011] 所述检测SMPD3基因表达的产品可以是检测SMPD3基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

[0012] 所述诊断鼻咽癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断鼻咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SMPD3基因的异常与鼻咽癌相关也属于SMPD3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

[0013] 本发明还提供了一种诊断鼻咽癌的工具，所述工具包括检测SMPD3基因表达的试剂；所述试剂包括检测SMPD3基因mRNA的引物和/或探针、检测SMPD3蛋白的抗体。

[0014] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SMPD3基因转录水平的针对SMPD3基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SMPD3蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括SMPD3基因在内的多个基因(例如，与鼻咽癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括SMPD3蛋白在内的多个蛋白质(例如与鼻咽癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与鼻咽癌的标志物同时检测，可大大提高鼻咽癌诊断的准确率。

[0016] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测SMPD3基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括SMPD3蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测SMPD3基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对SMPD3基因的引物和/或探针。根据SMPD3基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测SMPD3基因表达水平的引物和探针。

[0017] 所述试纸包括检测SMPD3基因表达的试剂。

[0018] 所述高通量测序平台包括检测SMPD3基因表达的试剂。

[0019] 与SMPD3基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

[0020] 进一步，所述SMPD3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述SMPD3蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与SMPD3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

[0021] 在本发明的具体实施方案中，所述检测SMPD3基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

[0022] 本发明还提供了SMPD3基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。

[0023] 所述促进剂包括促进SMPD3基因表达的试剂和促进SMPD3基因表达产物的试剂；所述促进SMPD3基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进SMPD3蛋白含量的试剂；所述促进SMPD3基因表达产物的试剂包括促进SMPD3基因表达产物稳定性的试剂、促进SMPD3基因表达产物活性的试剂、促进SMPD3基因表达产物功能的试剂。

[0024] 具体地，所述促进SMPD3基因表达的试剂包括：含有SMPD3基因的试剂、携带SMPD3基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SMPD3蛋白质的试剂。

[0025] 本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的SMPD3蛋白的缺失或不足，通过提高SMPD3蛋白的表达，从而治疗因SMPD3蛋白缺乏导致的鼻咽癌。另一方面可以用于促进SMPD3蛋白的活性或者功能，从而治疗鼻咽癌。

[0026] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

[0027] 在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

[0028] 本发明还提供了一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的SMPD3基因和/或其表达产物的促进剂。

[0029] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

[0030] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有SMPD3基因的药物或者含有SMPD3蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有SMPD3基因的药物或者含有SMPD3蛋白质的药物注入体内组织中。

[0031] 本发明的药物还可与其他治疗鼻咽癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

[0032] 在本发明的上下文中，“SMPD3基因”包括SMPD3基因以及SMPD3基因的任何功能等同物的多核苷酸。SMPD3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SMPD3基因(NC_000016.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

[0033] 优选地，SMPD3基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

[0034] (1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

[0035] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

[0036] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

[0037] 在本发明的具体实施方案中，所述SMPD3基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

[0038] 在本发明的上下文中，SMPD3基因表达产物包括SMPD3蛋白以及SMPD3蛋白的部分肽。所述SMPD3蛋白的部分肽含有与鼻咽癌相关的功能域。

[0039] “SMPD3蛋白”包括SMPD3蛋白以及SMPD3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括SMPD3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与SMPD3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

[0040] 优选地，SMPD3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

[0041] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0042] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

[0043] (3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

[0044] 在本发明的具体实施方案中，所述SMPD3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

[0045] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

[0046] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是SMPD3蛋白的融合蛋白。对于与SMPD3蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留SMPD3蛋白的生物学活性即可。

[0047] 本发明的SMPD3蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留SMPD3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

[0048] 在本发明的上下文中，“诊断鼻咽癌”既包括判断受试者是否已经患有鼻咽癌、也包括判断受试者是否存在患有鼻咽癌的风险。

[0049] 在本发明的上下文中，“治疗鼻咽癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

[0050] 本发明的优点和有益效果：

[0051] 本发明首次发现了SMPD3基因表达与鼻咽癌相关，通过检测受试者鼻咽组织中SMPD3的表达，可以判断受试者是否患有鼻咽癌、或者判断受试者是否存在患有鼻咽癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

[0052] 本发明发现了一种新的分子标记物-SMPD3基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现鼻咽癌的早期诊断，从而降低鼻咽癌的死亡率。

附图说明

[0053] 图1显示利用QPCR检测SMPD3基因在鼻咽上皮组织中的表达情况；

[0054] 图2显示利用Western blot检测SMPD3蛋白在鼻咽上皮组织中的表达情况；

[0055] 图3显示利用QPCR在转录水平上检测SMPD3基因的过表达情况；

[0056] 图4显示利用Western blo检测SMPD3蛋白的过表达情况；

[0057] 图5显示利用MTT实验检测SMPD3基因表达对鼻咽癌细胞增殖的影响。

[0058] 具体的实施方式

[0059] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0060] 实施例1正常组织和鼻咽癌组织中SMPD3基因的表达差异

[0061] 1、研究对象：

[0062] 经确诊为鼻咽癌的患者40例，经确诊为鼻咽癌慢性炎症的患者40例(充当正常鼻咽上皮组织对照)，分别利用显微切割技术获取鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。

[0063] 2、在转录水平上检测SMPD3基因的差异表达

[0064] 2.1组织RNA的提取

[0065] 1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

[0066] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；

[0067] 3)加入300uL Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；

[0068] 4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；

[0069] 5)加入600ul RNase-Free Water，用漩涡器混匀；

[0070] 6)加入20ul蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；

[0071] 7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；

[0072] 8)加入450ul的95％乙醇，涡旋混匀；

[0073] RNA吸附：

[0074] 9)取650ul含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；

[0075] 10)弃下层，重置收集管于柱上；

[0076] 11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；

[0077] 12)加入400ulWash solution，14000g离心2min；

[0078] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；

[0079] DNase处理：

[0080] 14)加入100ulEnzyme Incubation Buffer和15ulDNase I，14000g离心1min；

[0081] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；

[0082] 16)室温放置15min；

[0083] RNA洗涤：

[0084] 17)加入400ulWash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；

[0085] 18)加入400ulWash solution，14000g离心2min，弃收集管；

[0086] RNA洗脱：

[0087] 19)把柱子放入1.7mL Elution管中；

[0088] 20)加入30ul Elution Buffer；

[0089] 21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min。

[0090] 2.2逆转录

[0091] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。

[0092] 2.3QPCR

[0093] (1)引物设计

[0094] 根据Genbank中SMPD3基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

[0095] SMPD3基因：

[0096] 正向引物为5’-AACAAGTGTAACGACGAT-3’(SEQ ID NO.3)；

[0097] 反向引物为5’-CGATTCTTTGGTCCTGAG-3’(SEQ ID NO.4),

[0098] GAPDH基因：

[0099] 正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；

[0100] 反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

[0101] (2)按照表1配制PCR反应体系：

[0102] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

[0103] 表1PCR反应体系

[0104]试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl

[0105] (3)PCR反应条件：95℃ 10min，(95℃15s，60℃40s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

[0106] 2.4统计学方法

[0107] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0108] 2.5结果

[0109] 结果如图1所示，与正常组织相比，鼻咽癌组织中SMPD3基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0110] 3、在蛋白水平上检测SMPD3基因的差异表达

[0111] 3.1提取组织总蛋白

[0112] 按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

[0113] 3.2Western blot检测

[0114] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。

[0115] 3.3统计学处理

[0116] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0117] 3.4结果

[0118] 结果如图2所示，与正常组织相比，鼻咽癌组织中SMPD3蛋白含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0119] 实施例2 SMPD3基因表达质粒构建

[0120] 1、SMPD3基因表达载体的构建

[0121] 根据SMPD3基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-ATGGTTTTGTACACGAC-3’(SEQ  ID  NO.7)，反向引物为5’-CTATGCCTCCTCCTCCCCCGA-3’(SEQ ID NO.8)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：
638831)中扩增全长的SMPD3基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-SMPD3用于后续实验。

[0122] 2、鼻咽癌细胞的培养与转染

[0123] 将人类鼻咽癌细胞株HONE-1培养于添加10％胎牛血清、100μg/ml链霉素和100单位/ml(units/ml)青霉素的RPMI-1640培养基内(购自Hyclone)，取对数生长期的鼻咽癌按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(转染pcDNA3.1)和实验组(转染pcDNA3.1-SMPD3)，转染质粒的工作浓度是0.5μg/ml。

[0124] 2、利用QPCR实验检测质粒转染的效果。

[0125] 2.1提取细胞总RNA 利用常规方法进行操作。

[0126] 2.2逆转录

[0127] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。

[0128] 3、QPCR检测

[0129] 3.1提取细胞总RNA 利用常规方法进行操作。

[0130] 3.2逆转录

[0131] 步骤同实施例1。

[0132] 3.3QPCR

[0133] 步骤同实施例1。

[0134] 3.4统计学方法

[0135] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0136] 4、Western检测

[0137] 具体步骤同实施例1。

[0138] 5、结果

[0139] 如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-SMPD3的细胞中SMPD3的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-SMPD3的细胞中SMPD3的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0140] 实施例4 SMPD3基因对鼻咽癌细胞增殖的影响

[0141] 采用MTT实验检测SMPD3基因对鼻咽癌细胞增殖能力影响。

[0142] 1、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测
72h，共7次。本实验重复3次。

[0143] 2、统计学方法

[0144] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0145] 3、结果

[0146] 图5所示的结果显示：转染pcDNA3.1-SMPD3组的细胞生长速度明显低于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)上述结果表明SMPD3表达能够抑制鼻咽癌细胞的生长。

[0147] 实施例5 SMPD3基因对鼻咽癌细胞的细胞周期的影响

[0148] 使用流式细胞仪检测细胞周期，在此过程中使用的PI单染试剂购自美国BD公司产品。

[0149] 1、步骤：各组细胞转染48h后胰酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涤2次，70％的乙醇固定过夜。按操作说明加相应试剂，避光放置30min，流式细胞仪检测各组细胞周期。

[0150] 2、统计学方法

[0151] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0152] 3、结果

[0153] 如表1中显示的结果，与转染pcDNA3.1空载体组细胞相比，转染pcDNA3.1-SMPD3组细胞处于G1期的细胞明显增多，处于S期的细胞明显减少。上述结果表明，SMPD3基因表达能够抑制细胞周期。

[0154] 表1细胞转染后细胞周期变化

[0155]组别 G1期 G2期 S期
转染pcDNA3.1空载体组 31.02±1.15 15.21±0.42 53.77±0.59
转染pcDNA3.1-CALN1 69.01±1.34* 13.26±1.28 17.73±1.05*

[0156] 注：与转染pcDNA3.1空载体组相比，*P<0.05。

[0157] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。