一种检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法

摘要

本发明公开了一种检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法。本发明方法包括如下步骤：(1)测定荧光共振能量转移探针于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F0；(2)向所述荧光共振能量转移探针中加入待测的小牛血清去蛋白注射液进行反应；测定所述反应后的体系于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F；(3)根据式(1)所示的Stern‑Volmer方程，即能计算出所述小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的含量；所述待测的小牛血清去蛋白注射液是经过前处理步骤的。本发明检测方法稳定，并且操作简便，灵敏度高，适合做微量追踪，比色谱的专属性更高；同时操作和对检测设备以及环境的要求比质谱更低，更适合用于对批量生产产品的检测。

权利要求

1.一种检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法，包括如下步骤：(1)测定荧光共振能量转移探针于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F0；

(2)向所述荧光共振能量转移探针中加入待测的小牛血清去蛋白注射液进行反应；测定所述反应后的体系于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F；

(3)根据式(1)所示的Stern-Volmer方程，即能计算出所述小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的含量；

式(1)中，[Q]表示待测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的摩尔浓度，τ0表示所述荧光共振能量转移探针的平均荧光寿命，为1.5×10-9s，kQ表示荧光淬灭速率常数，为1.2×

1011L·mol-1·s-1，KD表示Stern-Volmer常数；

所述荧光共振能量转移探针的能量供体和能量受体分别为β-环糊精修饰的ZnS量子点和三羟基黄酮，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的粒径为2～4nm；所述荧光共振能量转移探针的pH值为4.5；

所述待测的小牛血清去蛋白注射液是按照包括如下步骤的方法进行前处理的：a)向所述待测的小牛血清去蛋白注射液中加入NaOH水溶液，并进行煮制，将体系的pH值调至6.8～7.2；

b)向步骤a)处理后的体系中加入活性炭进行吸附；

c)将步骤b)处理后的体系用微孔膜进行过滤；

d)对经步骤c)处理后的体系进行固相萃取，洗脱剂为甲醇，收集洗脱液，即完成对所述小牛血清去蛋白注射液的前处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述反应的温度为20℃～25℃，所述反应的时间为10～20min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述NaOH水溶液的摩尔浓度为6mol/L，所述NaOH水溶液与所述待测的小牛血清去蛋白注射液的体积比为1：1；

在水浴的条件下进行煮制；所述煮制的温度为59～61℃，时间为35～45min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤b)中，所述活性炭的质量加入量为所述待测的小牛血清去蛋白注射液质量的1.8％～2.0％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤c)中，所述微孔膜的孔径为0.22μm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤d)中，所述固相萃取的固体吸附剂为C18。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述荧光共振能量转移探针中，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的摩尔浓度为5.0×10-5～7.5×10-5mol/L，所述三羟基黄酮的摩尔浓度为1.0×10-6～2.5×10-6mol/L，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点与所述三羟基黄酮的摩尔比为20：1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述荧光共振能量转移探针中，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的摩尔浓度为5.0×10-5mol/L，所述三羟基黄酮的摩尔浓度为2.5×

10-6mol/L。

9.荧光共振能量转移探针在检测药物中单磷酸腺苷中的应用；

所述荧光共振能量转移探针的能量供体和能量受体分别为β-环糊精修饰的ZnS量子点和三羟基黄酮，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的粒径为2～4nm；所述荧光共振能量转移探针的pH值为4.5。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物为小牛血清去蛋白注射液。

说明书

一种检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测单磷酸腺苷含量的方法，具体涉及一种小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法，属于检测技术领域。

背景技术

[0002] 小牛血清去蛋白药物是小牛血清经去蛋白、浓缩、超滤等工艺制备的一类生物药，该类药物中含有小分子多肽、核苷酸、低聚糖等诸多生物活性成份。研究表明该类药物能够在缺氧情况下刺激并增加机体对葡萄糖和氧的吸收与利用，改善代谢平衡。它能够刺激细胞呼吸活性，对缺氧环境下的诱导神经细胞有保护作用。同时，它还具有抑制血小板聚集和血栓形成的作用，起到保护细胞在缺血缺氧的环境下的生存能力。

[0003] 临床实验发现，小牛血清去蛋白药物可用于治疗脑部血液循环障碍和营养障碍性疾病所引起的神经功能缺损而表现出的各种脑功能不全疾病，如缺血性脑梗塞、脑出血等；该药物也被证实能够通过刺激胶原质的合成加速伤口愈合过程，其对放射所致的损伤也有很好的治疗效果。它还用于辅助治疗消化系统疾病，对肝损伤有保护作用。研究还表明该类药物可以通过增加神经元和突触数量起到神经保护的作用来治疗神经系统疾病，在辅助治疗老年痴呆症也取得了一定的效果。

[0004] 小牛血清去蛋白药物的药理药效与其生物活性成份密切相关，因此研究其活性成份的检测方法，可为进一步了解其药理活性提供科学依据。该类药物的活性成份之一为单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate，简称AMP)，是一种在核糖核酸(RNA)中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸盐官能团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。

[0005] 荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)体系，是指当两个荧光分子距离靠近时(小于10nm)发生的能量转移现象，其中一个作为能量供体，另外一个为能量受体。FRET体系可以使能量受体的荧光发射强度显著增强，因此可以明显提高基于此原理设计的荧光探针传感器的检测能力。近年来，以量子点为基础的荧光共振能量转移探针备受关注，广泛应用于小分子的识别、金属离子的检测、生物大分子的检测、细胞成像以及疾病诊断等方面。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷(AMP)的方法，具体是利用一种荧光共振能量转移探针件检测，本发明方法通过对样品的前处理，提高了对单磷酸腺苷的选择性，排除了样品中其他杂质的干扰。

[0007] 本发明所提供的检测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷含量的方法，包括如下步骤：

[0008] (1)测定荧光共振能量转移探针于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F0；

[0009] (2)向所述荧光共振能量转移探针中加入待测的小牛血清去蛋白注射液进行反应；测定所述反应后的体系于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F；

[0010] (3)根据式(1)所示的Stern-Volmer方程，即能计算出所述小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的含量；

[0011]

[0012] 式(1)中，[Q]表示待测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的摩尔浓度，τ0表示所述荧光共振能量转移探针的平均荧光寿命，为1.5×10-9s，kQ表示荧光淬灭速率常数，为1.2×1011L·mol-1·s-1，KD表示Stern-Volmer常数；

[0013] 所述荧光共振能量转移探针的能量供体和能量受体分别为β-环糊精修饰的ZnS量子点和三羟基黄酮，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的粒径为2～4nm；所述荧光共振能量转移探针的pH值为4.5；

[0014] 所述待测的小牛血清去蛋白注射液是按照包括如下步骤的方法进行前处理的：

[0015] 1)向所述待测的小牛血清去蛋白注射液中加入NaOH水溶液，并进行煮制，将体系的pH值调至6.8～7.2；

[0016] 2)向步骤1)处理后的体系中计入活性炭进行吸附；

[0017] 3)将步骤2)处理后的体系用微孔膜进行过滤；

[0018] 4)对经步骤3)处理后的体系进行固相萃取，洗脱剂为甲醇，收集洗脱液，即完成对所述小牛血清去蛋白注射液的前处理。

[0019] 上述的方法中，步骤(2)中，所述反应的温度可为20℃～25℃，所述反应的时间可为10～20min。

[0020] 上述的方法中，步骤1)中，所述NaOH水溶液的摩尔浓度可为6mol/L，所述NaOH水溶液与所述待测的小牛血清去蛋白注射液的体积比可为1：1；

[0021] 在水浴的条件下进行煮制；所述煮制的温度可为59～61℃，时间可为35～45min，如在60℃下煮制40min。

[0022] 上述的方法中，步骤2)中，所述活性炭的质量加入量可为所述待测的小牛血清去蛋白注射液质量的1.8％～2.0％，如2％。

[0023] 上述的方法中，步骤3)中，所述微孔膜的孔径可为0.22μm。

[0024] 上述的方法中，步骤4)中，所述固相萃取的固体吸附剂可为C18。

[0025] 上述的方法中，所述荧光共振能量转移探针中，所述β-环糊精修饰的ZnS量子点的-5 -5 -5摩尔浓度可为5.0×10 ～7.5×10 mol/L，具体可为5.0×10 mol/L，所述三羟基黄酮的摩尔浓度可为1.0×10-6～2.5×10-6mol/L，具体可为2.5×10-6mol/L；

[0026] 所述β-环糊精修饰的ZnS量子点与所述三羟基黄酮的摩尔比可为20：1。

[0027] 本发明方法中所使用的β-环糊精修饰的ZnS量子点可按照如下方法进行制备：

[0028] 1)按照文献(Freeman,R.,Finder,T.,Bahshi,L.,Gill,R.,Willner,I.,Adv.Mater.2012,24(48),6416-6421.；Li-Yun Wang,Ling-Yu Dong,Luan Chen,Ya-Bing Fan,Jing Wu,Xiang-Feng Wang and Meng-Xia Xie*New J.Chem.,2015,39(1),555-565)中的方法制备单-6-硫基-β-环糊精(单-6-硫基-β-CD)；

[0029] 2)将醋酸锌、单-6-硫基-β-CD和水加入三颈烧瓶中，搅拌至溶解；再用1.0mol/L的NaOH水溶液将混合溶液的pH调节至10.0；在室温下，通N215min以除去空气，然后将混合物加热回流。在回流的条件下，注入硫化钠水溶液，并在N2保护下搅拌，然后将溶液在室温(25℃)下老化6h，得到β-环糊精修饰的ZnS量子点。

[0030] 小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的含量为10×10-5mol/L～200×10-5mol/L时，可使用本发明方法进行检测。

[0031] 本发明方法是基于下述机理实现对单磷酸腺苷含量的检测的：三羟基黄酮可以进入到β-CD的疏水性空腔中，在激发状态下，发生量子点的电子向3-羟基黄酮醇转移，导致了三羟基黄酮在λ＝526nm处发射峰的显著增强；当单磷酸腺苷(AMP)存在时，它与β-CD空腔体内的三羟基黄酮发生结合，阻碍了能量转移的发生，使其荧光发生峰强度的淬灭；当将待测品加入荧光探针体系中，经反应，检测反应后体系在λ＝526nm处发射峰的荧光光强，通过Stern-Volmer方程即能得到待测品中AMP的含量。

[0032] 本发明检测方法稳定，并且操作简便，灵敏度高，适合做微量追踪，比色谱的专属性更高；同时操作和对检测设备以及环境的要求比质谱更低，更适合用于对批量生产产品的检测。

附图说明

[0033] 图1为本发明实施例1中3-HF与80μL不同摩尔浓度的β-CD修饰ZnS QDs的水溶液混合后的荧光发射谱图，其中，526nm处的荧光发射峰从下至上，β-CD修饰ZnS QDs的水溶液的摩尔浓度依次为0、1.875×10-3、2.8125×10-3、3.75×10-3、5.625×10-3、9.375×10-3、1.5×10-2和2.8125×10-2mol/L。

[0034] 图2(a)为本发明实施例2中AMP水溶液的摩尔浓度依次为10×10-5、25×10-5、50×10-5、100×10-5、150×10-5和200×10-5mol/L时反应体系的荧光发射光谱图；图2(b)为根据Stern-Volmer方程得到的线性回归曲线。

具体实施方式

[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 下述实施例中所用药品和试剂如下：小牛血清去蛋白注射液(10ml/支，锦州奥鸿药业有限责任公司)；β-环糊精(β-CD，98.0％，北京索莱宝科技有限公司)；对甲苯磺酰氯(98.0％，天津市大茂化学试剂厂，中国)；硫脲(99.0％，北京化工厂)；三氯乙烯(99.0％，汕头市西陇化工厂有限公司，中国)醋酸锌二水合物(Zn(Ac)2·2H2O，99.0％)和硫化钠九水合物(Na2S·9H2O，98.0％)从国药集团化学试剂北京有限公司购买；3-羟基黄酮(TCI(上海)化成工业发展有限公司)；腺苷5'-单磷酸(阿拉丁化学有限公司)；Millipore超纯水(18.3MΩcm-1)。

[0038] 下述实施例中所用仪器如下：荧光发射光谱，FluoroMax-4fluorometer(HORIBA JY，法国)；紫外可见吸收光谱，SPECORD 200spectrophotometer(analytikjena，德国)；红外光谱仪，NEXUS 670FTIR spectrometer(Thermo Nicolet Co.，美国)；透射电子显微镜，Tecnai F20electron microscopy(FEI，荷兰)。

[0039] 实施例1、制备荧光共振能量转移探针

[0040] 一、制备β-CD修饰的ZnS量子点

[0041] 1)制备单-6-硫基-β-CD：单-6-硫基-β-CD的合成是根据文献(Freeman,R.,Finder,T.,Bahshi,L.,Gill,R.,Willner,I.,Adv.Mater.2012,24(48),6416-6421.；Li-Yun Wang,Ling-Yu Dong,Luan Chen,Ya-Bing Fan,Jing Wu,Xiang-Feng Wang and Meng-Xia Xie*New J.Chem.,2015,39(1),555-565)中报道的方法进行制备的：在室温下，将β-环糊精(60.0g，52.8mmol)和水(471mL)加入到反应烧瓶中，搅拌呈悬浮液；滴加17.1mL的NaOH(5.67g，142mmol)水溶液；然后向其中逐滴滴加对甲苯磺酰氯(8.67g，45.6mmol)的乙腈(25.8mL)溶液；室温下反应2h后终止反应，抽滤除去沉淀物，将滤液于4℃过夜；将滤液进行抽滤，用水重结晶三次得到白色沉淀物，真空干燥后得到纯的白色固体产物β-CD-OTs。

[0042] 将β-CD-OTs(4.0g，3.04mmol)和硫脲(4.0g，52.4mmol)加入到反应瓶中，加入甲醇(约160ml)和水(40ml)的混合溶剂，然后将混合物加热回流48h，通过旋转蒸发将反应溶剂除去，得到白色固体，并进一步纯化、重结晶，得到单-6-硫基-β-CD。

[0043] 2)制备β-CD修饰的ZnS量子点：将醋酸锌(0.11g，0.5mmol)、单-6-硫基-β-CD(1.0g，0.88mmol)和水(50mL)加入三颈烧瓶中，搅拌至溶解；再用1.0mol/L的NaOH水溶液将混合溶液的pH调节至10.0；在室温下，通N215min以除去空气，然后将混合物加热回流20min。在回流的条件下，注入硫化钠(0.12g，0.5mmol)水溶液，并在N2保护下搅拌20min，然后将溶液在室温(25℃)下老化6h，形成β-CD的修饰的ZnS量子点。向得到的量子点溶液中加入乙醇，离心分离3次，在真空中干燥，将其储存在4℃冰箱中。

[0044] 上述制备过程中，通过β-CD的羟基用对甲苯磺酰氯磺化后，用硫脲把其羟基转换成巯基，再通过巯基把环糊精链接在硫化锌(ZnS)量子点的表面上，对β-CD修饰的ZnS量子点和β-CD分别做红外光谱图，发现两者的谱图相近，说明β-CD成功的修饰在了量子点表面。主要谱带如下：在3375.4cm-1处的谱带源于O-H振动吸收；2925.7cm-1处的谱带对应于C-H的非对称振动υa(C-H)吸收；1158.0cm-1处的强带对应于C-O-C的变性振动；在1080.9和
1028.2.cm-1处的谱带分别对应于C-C和C-O的变性振动。

[0045] 本实施例制备的β-CD的修饰的ZnS量子点的透射电镜图显示，其粒径在2～4nm之间，因此在溶液中具有良好的分散性。

[0046] 二、制备荧光共振能量转移探针

[0047] 取20μL 1.5×10-4mol/L三羟基黄酮醇(3-HF)的乙醇溶液和80μLβ-CD修饰的ZnS QDs(β-CD修饰的ZnS量子点)的水溶液(浓度依次为0、1.875×10-3、2.8125×10-3、3.75×10-3、5.625×10-3、9.375×10-3、1.5×10-2和2.8125×10-2mol/L)分别加入到2.9mL pH4.5的PBS缓冲溶液里，反应溶液的总体积保持恒定为3.0mL。在20℃下反应1min后，分别测量其荧光光谱。激发波长设为：300nm，发射波长范围：310～700nm。

[0048] 相应的测试结果如图1所示，通过测量3-HF与不同量的β-CD修饰ZnS QDs的水溶液混合后的荧光发射谱图，得知如下结论：随着β-CD修饰ZnS QDs的加入量的增加，3-HF在526nm处的荧光发射峰强度逐渐增强，当量子点的加入量达到一定程度时，发射峰的强度保持恒定，说明它们之间达成了平衡，形成了能量共振转移荧光探针。

[0049] 本实施例制备的荧光共振能量转移探针中，三羟基黄酮醇(3-HF)分子进入β-CD修饰的ZnS量子点中的β环糊精(β-CD)的疏水性空腔体内，进而构建了以ZnS量子点作为荧光能量供体，三羟基黄酮醇作为能量受体的新颖荧光探针，其中，所述β-CD修饰的ZnS量子点的粒径为2～4nm。

[0050] 本实施例制备的荧光共振能量转移探针中，3-羟基黄酮可以进入到β-CD的疏水性空腔中，在激发状态下，发生量子点的电子向3-羟基黄酮醇转移，导致了3-羟基黄酮在λ＝526nm处发射峰的显著增强。当单磷酸腺苷(AMP)存在时，其与β-CD空腔体内的3-羟基黄酮发生结合，阻碍了能量转移的发生，使其荧光发生峰强度的淬灭。β-CD修饰的硫化锌量子点的紫外吸收峰与3-HF的荧光发射峰之间具有重叠，亦说明两者之间可以发生能量共振转移现象(Elmlinger MW,Kriebel M,Ziegler D.Neuromolecular Med2011Dec；13(4):266-
74.；Li-Yun Wang,Ling-Yu Dong,Luan Chen,Ya-Bing Fan,Jing Wu,Xiang-Feng)。

[0051] 实施例2、利用荧光共振能量转移探针(FRET荧光探针)检测AMP

[0052] 为了研究β-CD修饰ZnS QDs与3-HF之间形成的FRET荧光探针用来检测AMP的可行性，研究了不同浓度AMP水溶液对FRET荧光探针荧光发射强度的影响。

[0053] 取20μL 3.75×10-4mol/L的3-HF的乙醇溶液和80μL 1.875×10-3mol/L的β-CD修饰的ZnS QDs水溶液加入到2.8mL pH 4.5的PBS缓冲溶液里，反应溶液的总体积保持恒定为3.0mL。在20℃下反应1min后，然后向其中分别加入100μL的AMP水溶液(浓度依次为10×10-5、25×10-5、50×10-5、100×10-5、150×10-5和200×10-5mol/L)，分别测量其荧光光谱，荧光光谱图如图2(a)所示。

[0054] 将上述实验数据用Stern-Volmer方程(式(1)所示)进行计算(Xie,M X；Long,M；Liu,Y；Qin,C；Wang,Y D.Biochim.Biophys.Acta 2006,1760：1184-1193.；Xie M X，Xu X Y,Wang Y D.Biochim.Biophys.Acta 2005,1724,215-224.)：

[0055]

[0056] 其中，F0和F分别为加入AMP前后荧光共振能量转移探针的荧光发射峰的强度；[Q]为AMP的摩尔浓度；τ0为所述荧光共振能量转移探针的平均荧光寿命，τ0≈1.5×10-9s；KD为Stern-Volmer常数；kQ为荧光淬灭速率常数。

[0057] 根据Stern-Volmer方程得到的线性回归曲线如图2(b)所示，从图2(b)中可得知：两者之间呈现良好的线性关系，线性回归系数为0.996，线性回归方程为Y＝160.2[Q]+
0.006；由该线性回归曲线的斜率可得到kQ约为1.2×1011L·mol-1·s-1，远大于最大动态扩散猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1，说明AMP对荧光探针的淬灭机制主要为静态淬灭。

[0058] 实施例3、本发明检测方法的选择性(排除干扰)

[0059] (1)考察本发明检测方法中的纯化步骤的排除干扰效果

[0060] 采用碱水解、活性炭吸附和C18固相萃取柱净化的方法对小牛血清去蛋白注射液进行纯化，以排除干扰；因为小牛血清去蛋白注射液成分比较复杂，内含多种成分，其中的一些生物分子例如多肽、多糖、核苷酸、ATP等都有可能对荧光探针产生猝灭作用。

[0061] 上述纯化步骤为：

[0062] 碱水解：向待测的小牛血清去蛋白注射液中加入等体积的6mol/L的NaOH水溶液，60℃水浴煮40min，将pH值调到7.0。

[0063] 活性炭吸附：向经上步骤处理后的体系中加入活性炭，10min后经过0.22μm微孔膜滤过，其中，活性炭的加入量为小牛血清去蛋白注射液质量的2％。

[0064] C18固相萃取柱净化：用C18填料的固相萃取柱进行萃取，用甲醇洗脱，收集洗脱液。

[0065] 经过上述纯化后的样品进行质谱分析，由质谱图可知，经纯化后的样品中除了AMP外，基本没有上述干扰物。

[0066] (2)考察本发明检测方法中的纯化步骤对待测品中AMP含量的影响

[0067] 分别取四份2mL小牛血清去蛋白注射液(10mL/支，锦州奥鸿药业有限责任公司生产，批号20141011，AMP浓度为11.2×10-5mol/L)，分别标记为样品1、样品2、样品3和样品4，分别进行如下处理：

[0068] a)样品1加水定容到10ml备用。

[0069] b)向样品2中加入6mol/L的NaOH水溶液2mL，60℃水浴煮40min，将pH值调到7.0，定容到10mL，备用。

[0070] c)样品3在经方法a)处理后的基础上加入40mg活性炭，10min后经过0.22μm微孔膜滤过，定容到10mL备用。

[0071] d)向样品4中加入6mol/L的NaOH水溶液2mL，60℃水浴煮40min，将pH值调到7.0；向其中加入40mg活性炭，10min后经过0.22μm微孔膜滤过；上样到装有3g C18填料的固相萃取柱，用10mL甲醇缓慢洗脱，收集洗脱液，定容(加水或者减压浓缩)到10mL备用。

[0072] 分别对样品1-样品4中的AMP进行检测：

[0073] 1)配制荧光共振能量转移探针

[0074] 取20μL 3.75×10-4mol/L的3-HF的乙醇溶液和80μL 1.875×10-3mol/L的β-CD修饰的ZnS QDs水溶液加入到2.8mL pH 4.5的PBS缓冲溶液里，反应溶液的总体积保持恒定为3.0mL。

[0075] 检测荧光共振能量转移探针于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F0；

[0076] 2)分别向荧光共振能量转移探针中加入样品1、样品2、样品3和样品4，在20℃下反应1min后，分别测量体系于526nm处的荧光发射峰的强度，记作F。

[0077] 3)根据式(1)所示的Stern-Volmer方程，即能换算出小牛血清去蛋白注射液中AMP的含量，结果如表1中所示；

[0078]

[0079] 式(1)中，[Q]表示待测小牛血清去蛋白注射液中单磷酸腺苷的摩尔浓度，τ0表示所述荧光共振能量转移探针的平均荧光寿命，约为1.5×10-9s，kQ表示荧光淬灭速率常数，为1.2×1011L·mol-1·s-1，KD表示Stern-Volmer常数。

[0080] 表1样品1-样品4中AMP的含量

[0081]-5
样品 AMP浓度(×10 mol/L)
1 20.8
2 17.6
3 14.3
4 11.4

[0082] 由表1中的数据可以看出，每次净化处理都可以排除一些干扰，使检测结果更接近真实值。

[0083] (3)考察本发明检测方法中的纯化步骤对待测品中AMP的消耗

[0084] 配制浓度为20×10-5mol/L腺苷5'-单磷酸(AMP)两份2mL标记为样品A和样品B，样品A用水定容到10mL备用，样品B按照上述样品4的方法处理。

[0085] 按照上述检测方法分别对样品A和样品B进行检测，按体积换算出AMP的浓度，结果如表2中所示：

[0086] 表2样品A和样品B中AMP的含量

[0087]样品 AMP浓度(×10-5mol/L)
A 18.2
B 17.8

[0088] 由表2中的数据可以看出，样品A和样品B的检测结果接近，表明本发明检测方法中的净化处理步骤对样品中的AMP损耗很少，对检测结果影响不大。