一种基于疏水性电荷诱导磁性微球的抗体荧光标记方法

摘要

本发明公开了一种基于疏水性电荷诱导磁性微球的抗体荧光标记新方法。具体步骤如下：1)取适量待标记的抗体溶于孵育缓冲液，并加入疏水性电荷诱导磁性微球进行抗体的吸附。2)在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗去未吸附的抗体，计算抗体的吸附量。3)根据抗体的吸附量，加入适量的异硫氰酸荧光素，将异硫氰酸荧光素与上述微球振荡混合，进行标记。4)标记完成后，在外加磁场的辅助下洗涤除去未反应的异硫氰酸荧光素，调节溶液pH至酸性解吸同收已标记的抗体。本发明所开发方法的特色在于设计了一种高效的抗体荧光标记的新方法。

权利要求

1.一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取适量待标记的抗体溶于由生理盐水和0.5M pH 7-9的碳酸钠缓冲液按照体积比9∶

1构成的孵育缓冲液中，与具有疏水性电荷诱导效应的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育0.5-

8小时；

2)测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；

3)根据计算的抗体吸附量，按照每毫克抗体加入0.01-20mg的异硫氰酸荧光素，将异硫氰酸荧光素缓慢添加至装有磁性微球的三角瓶中，4℃下振荡混合1-8小时，进行荧光标记；

4)标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；

5)采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4.0-5.5，4℃下振荡混合5-30分钟，回收标记抗体。

2.根据权利要求1所述的一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记方法，其特征在于所述的具有疏水性电荷诱导效应的磁性微球为偶联有4-巯乙基吡啶或氨基咪唑的磁性琼脂糖微球。

说明书

一种基于疏水性电荷诱导磁性微球的抗体荧光标记方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于疏水性电荷诱导磁性微球的抗体荧光标记新方法。

背景技术

[0002] 随着人们对健康的日益关注和医疗改革的深化，国内体外诊断市场蓬勃发展，据统计2012年体外诊断市场的规模超过167亿元，2013年为215亿元，并仍将以15～20％的速度继续增长。体外诊断的重要途径之一是采用标记抗体特异性地显示抗体与目标分子之间的相互作用或通过放大效应提高检测灵敏度。目前标记抗体的制备主要采用液相法(http：//www.drmr.com/abcon/，2004)，存在对抗体的纯度和浓度要求高、标记反应的偶联程度不易控制、过程冗长和抗体活性易受影响等缺点。近年来，抗体固相标记法成为研究热点(Journal of Molecular Recognition，2004，17：268；Proteomics，2014，14：14)，该方法可以较好地克服液相法存在的缺点，标记的同时兼具对抗体纯化和浓缩的作用，因此具有良好的应用潜力。

[0003] 固相标记材料的性能很大程度上取决于偶联在材料表面的功能配基，功能配基决定了固相材料对抗体的吸附和解吸性能。目前，文献已报道的配基包括金属螯合配基和蛋白A亲和配基(Journal of Molecular Recognition，2004，17：268；Journal of Immunological Methods，2007，22：1)。其中金属螯合配基对抗体的选择性较差，对抗体的纯度要求较高；而蛋白A亲和配基虽然对抗体具有高度的特异性，但价格昂贵、抗体的吸附容量低，同时洗脱条件过酸易导致抗体活性损失(Journal of Chromatography A，2014，1355：12)。疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge induction chromatography，HCIC)是近年来发展起来的抗体分离新方法。HCIC功能配基包含疏水和荷电基团，在中性条件下，利用疏水相互作用实现蛋白的吸附，且具有耐盐吸附的特性；随后通过调节溶液pH，引入静电排斥力协助解吸，可有效避免因亲和力过高而导致的洗脱困难，实现快速洗脱(Molecular Simulation，2010，36：1096；Biotechnology Progress，2010，26：134)。因此，采用HCIC配基不仅能实现抗体固相标记中的选择性吸附，又能在完成标记后高效回收抗体，降低固相标记过程对抗体纯度和浓度的要求，并较好地保存抗体的活性。

[0004] 目前抗体固相标记的操作过程复杂，涉及固相与抗体的混合、抗体与游离标记分子的混合以及标记分子和固相的分离等步骤，如何简化过程，实现高效的抗体标记工艺，是固相标记方法推广亟需解决的问题。磁分离技术可以从复杂的料液中简便快速地分离目标物，实现对目标物质的分离、富集、回收和再利用。磁分离技术中常用的材料是磁性琼脂糖复合微球，该材料不仅具有优良的磁响应性，同时琼脂糖组分亲水性好、生物相容性非特异性吸附低，同时表面富含羟基，可以方便的进行功能配基的偶联。借助磁性复合微球在外加磁场作用下的磁性导向效应，促使微球快速分散和富集，有利于简化固相标记的操作过程。

发明内容

[0005] 本发明公开了一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记新方法。所述的一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记新方法，其特征在于包括如下步骤：

[0006] 1)取适量待标记的抗体溶于由生理盐水和0.5M pH 7-9的碳酸钠缓冲液(9∶1)构成的孵育缓冲液中，与具有疏水性电荷诱导效应的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育0.5-8小时；

[0007] 2)测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；

[0008] 3)根据计算的抗体吸附量，按照每毫克抗体加入0.01-20mg的异硫氰酸荧光素，将异硫氰酸荧光素缓慢添加至装有磁性微球的三角瓶中，4℃下振荡混合1-8小时，进行荧光标记；

[0009] 4)标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；

[0010] 5)采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4.0-5.5，4℃下振荡混合5-30分钟，回收标记抗体。

[0011] 所述的一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记新方法，其特征在于所述的具有疏水性电荷诱导 效应的磁性微球为偶联有4-巯乙基吡啶或氨基咪唑的磁性琼脂糖微球。

[0012] 所述的一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记新方法，其特征在于所述的孵育缓冲液为生理盐水和0.5M pH 7-9的碳酸钠缓冲液按照体积比9∶1的比例混合的缓冲液。

[0013] 所述的一种基于疏水性电荷诱导微球的抗体荧光标记新方法，其特征在于所述的洗脱pH值为4.0-5.5。

[0014] 本发明采用具有疏水性电荷诱导效应的磁性琼脂糖微球进行抗体的荧光标记，充分发挥了疏水性电荷诱导微球的抗体吸附容量大、耐盐吸附以及洗脱温和便利等优点，并结合磁性响应特点使得微球可以通过外加磁场的施加来实现微球与料液的快速分离，尤其在料液中含有细胞或其他固体杂质时。因此，采用具有疏水性电荷诱导效应的磁性微球进行抗体荧光固相标记，可以降低对抗体浓度和纯度的要求，扩大抗体标记的范围，减少透析和凝胶过滤等步骤，极大地提高抗体荧光标记的效率。此外，微球的性质稳定，配基牢固，清洗再生方便。

附图说明

[0015] 附图是采用本发明的方法吸附有荧光染料标记蛋白的介质微球的激光共聚焦显微图。

具体实施方式

[0016] 以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

[0017] 实施例1

[0018] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 7的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有4-巯乙基吡啶的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育0.5小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为45mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入0.45mg异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合8小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4，4℃下振荡混合5分钟，回收标记抗体。

[0019] 实施例2

[0020] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 8的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有4-巯乙基吡啶的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育1小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为42mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入42mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合1小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4.5，4℃下振荡混合10分钟，回收标记抗体。

[0021] 实施例3

[0022] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 9的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有4-巯乙基吡啶的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育8小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为35mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入700mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合1小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至5.5，4℃下振荡混合30分钟，回收标记抗体。

[0023] 实施例4

[0024] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 7.5的碳酸钠缓冲液的体积比为 9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有4-巯乙基吡啶的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育6小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为46mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入4.6mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合8小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4.5，4℃下振荡混合20分钟，回收标记抗体。

[0025] 实施例5

[0026] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 7的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有氨基咪唑的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育0.5小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为48mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入0.48mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合8小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4，4℃下振荡混合5分钟，回收标记抗体。

[0027] 实施例6

[0028] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 9的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有氨基咪唑的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育8小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为30mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入600mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合1小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至5.5，4℃下振荡混合30分钟，回收标记抗体。

[0029] 实施例7

[0030] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 8的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有氨基咪唑的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育2小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为45mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入22.5mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合6小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至4.5，4℃下振荡混合15分钟，回收标记抗体。

[0031] 实施例8

[0032] 取50mg待标记的抗体溶于50mL孵育缓冲液(生理盐水和0.5M pH 9的碳酸钠缓冲液的体积比为9∶1)，配制抗体溶液，与1.0g偶联有氨基咪唑的磁性微球振荡混合，4℃下，孵育6小时；测定吸附前后溶液中抗体的浓度，计算抗体吸附量为30mg/g，在外加磁场辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，洗去未吸附的抗体以及其他杂质；加入600mg的异硫氰酸荧光素，4℃下振荡混合2小时，进行荧光标记；标记完成后，在外加磁场的辅助下，用孵育缓冲液洗涤微球3次，除去游离的异硫氰酸荧光素；采用1M醋酸溶液调节溶液pH至5.5，4℃下振荡混合25分钟，回收标记抗体。