一种烟草青枯病综合防控方法转让专利
申请号 : CN201510682109.2
文献号 : CN105309082B
文献日 : 2018-03-23
发明人 : 李想 , 刘艳霞 , 石俊雄 , 蔡刘体 , 陆宁 , 陈兴江
申请人 : 贵州省烟草科学研究院
摘要 :
本发明公开了一种烟草青枯病综合防控方法，在栽种烟草前对土壤进行以下处理：1）土壤预处理：在上一年烟草收获后的10～11月份内，用生石灰90～100kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种绿肥作物，并在来年2‑3月份作压青处理；3）土壤再处理：压青后用生石灰90～100 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻；5）施加生物有机肥。本发明综合防控措施可以有效降低青枯病发病率，增加烟叶产量、产值，降低土壤中病原菌浓度进而减少病原菌对根系的侵染，有利于病害土壤的生态系统向健康可持续发展的方向转化，达到对重病烟区烟草青枯病良好的防控效果，能够解决现有单一措施对青枯病防控效果有限的问题。
权利要求 :
1.一种烟草青枯病综合防控方法，其特征在于：在栽种烟草前对土壤进行以下处理：1）土壤预处理：在上一年烟草收获后的10～11月份内，用生石灰90～100kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种绿肥作物，并在来年2-3月份作压青处理；3）土壤再处理：压青后用生石灰90～100 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻；5）施加生物有机肥；将拮抗菌L-25接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h，然后将发酵液6000×g离心10 min，收集菌体按5%接种量接种于灭菌后的有机肥载体，调节有机肥含水量为40%，发酵5～6 d，定期翻抛得L-25二次发酵的生物有机肥；将L-9接种于高氏一号液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h，然后将发酵液6000×g离心10 min，收集菌体按5%接种量接种于灭菌后的有机肥载体，调节有机肥含水量为40%，发酵5～6 d，定期翻抛得L-9二次发酵的生物有机肥；所述生物有机肥为L-25与L-9分别二次发酵的生物有机肥以质量比1:1混合后制成的生物有机肥；所述绿肥作物为晚熟油菜、小麦或三叶草。
2.根据权利要求1所述的烟草青枯病综合防控方法，其特征在于：所述有机肥载体为菜粕酶解的氨基酸有机肥与牛粪以质量比1:1混合，含有机质33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O5 2.26%、K2O 1.08%。
3.根据权利要求1所述的烟草青枯病综合防控方法，其特征在于：所述L-25为采用前期自健康烟草根际土壤分离筛选到的拮抗菌。
4.根据权利要求1所述的烟草青枯病综合防控方法，其特征在于：所述L-9为采用前期自健康烟草根际土壤分离筛选到的拮抗菌。
说明书 :
一种烟草青枯病综合防控方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种烟草青枯病综合防控方法，属于烟草青枯病防控技术领域。
背景技术
[0002] 烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种以土壤传播为主的毁灭性细菌性烟草病害。烟草青枯病是影响贵州烟叶生产的最主要的细菌性病害之一。近年来，随着科技进步和人们环保意识的加强，生物防控方法逐渐引起了人们的重视，目前对青枯病病原菌的防控都停留在实验室中拮抗菌对病原菌的平板拮抗作用，直接应用于温室试验或田间试验的防控效果甚微，Anuratha等将平板筛选得到的荧光假单胞杆菌直接用于田间试验，其对番茄青枯病的防控率仅为36 %左右。
[0003] 拮抗菌单独施入土壤后不易定殖，提高拮抗菌在土壤根际的定殖成为生物防控的研究重点，目前采用施用拮抗菌结合有机肥或经过2次发酵制成生物有机肥病施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制青枯病的发生。由于环境的复杂性及单一防控措施的局限性对病害发病严重的田块采用单项防控措施的效果并不理想，因此探索一种有效的综合防控青枯病的措施意义重大。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是：发明人针对烟草青枯病发病严重的烟田进行三年长期定位修复，并通过研究土壤中病原菌与拮抗菌的消长关系及土壤微生物区系变化特征，提出了一种烟草青枯病综合防控方法，该方法将各种防控手段有效协同，能够解决现有单一措施对青枯病防控效果有限的问题。
[0005] 本发明的技术方案：一种烟草青枯病综合防控方法，在栽种烟草前对土壤进行以下处理： 1）土壤预处理：在上一年烟草收获后的10～11月份内，用生石灰90～100kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种绿肥作物，并在来年2-3月份作压青处理；3）土壤再处理：压青后用生石灰90～100 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻；5）施加生物有机肥。
[0006] 所述生物有机肥的制备方法为：将拮抗菌L-25接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h，然后将发酵液6000×g离心10 min，收集菌体按5%接种量接种于灭菌后的有机肥载体，调节有机肥含水量为40%，发酵5～6 d，定期翻抛得L-25二次发酵的生物有机肥。
[0007] 所述生物有机肥的制备方法为：将L-9接种于高氏一号液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h，然后将发酵液6000×g离心10 min，收集菌体按5%接种量接种于灭菌后的有机肥载体，调节有机肥含水量为40%，发酵5～6 d，定期翻抛得L-9二次发酵的生物有机肥。本发明中有机肥与拮抗菌相结合制成微生物有机肥后施用，对烟草青枯病害的防控具有很好的效果。
[0008] 所述生物有机肥为将前述L-25与L-9分别二次发酵的生物有机肥以质量比1:1混合后制成的生物有机肥。本发明中L-25具有成本低及防控效果差的特点，L-9具有成本高及防控效果好的特点，将二者结合起来，能起到综合防控效果及兼顾生产成本的作用。
[0009] 所述有机肥载体为菜粕酶解的氨基酸有机肥与牛粪以质量比1:1混合，含有机质33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O5 2.26%、K2O 1.08%。
[0010] 所述绿肥植物为晚熟油菜、小麦或三叶草。该类绿肥植物易于种植，且成本较低。
[0011] 所述L-25为采用前期自健康烟草根际土壤分离筛选到的拮抗菌，所述L-9为采用前期自健康烟草根际土壤分离筛选到的拮抗菌。本发明中采用的拮抗微生物均从烟草根际土筛选获得，在烟草根际上具有很强的定殖能力；同时拮抗菌以有机肥为载体，经过二次固体发酵后施入土壤中，在土壤中的定殖能力更强，对病原菌起到较好的抑制作用，进而推迟烟草植株发病时间和显著降低青枯病发病指数。
[0012] 本发明的有益效果：在本发明中用生石灰进行预处理和再处理以调节土壤pH，能够抑制青枯劳尔氏菌的生长繁殖；播种绿肥作物，能够培养其它类型的微生物，以挤占青枯劳尔氏菌的生存资源；对土壤进行深翻和施用生物有机肥，也能够进一步的抑制青枯劳尔氏菌的繁殖。本发明能通过前述措施可有效改善土壤微生物平衡，恢复被破坏的土壤生态系统，从而建立起复杂而健康的土壤微生物体系。拮抗菌在有机肥协助下形成“基质–菌群”生态系统，更有利于调节土壤微生态环境，可改变根际土壤微生物生态特征和物理化学特征，从而起到防病、抑病的作用。
[0013] 本发明施用抑制烟草青枯病型生物有机肥配合综合防控措施，可以有效降低青枯病发病率，增加烟叶产量、产值，降低土壤中病原菌浓度进而减少病原菌对根系的侵染，有利于病害土壤的生态系统向健康可持续发展的方向转化，达到对重病烟区烟草青枯病良好的防控效果。
附图说明
[0014] 图1是不同年限间土壤中病原菌与拮抗菌的消长关系图；
[0015] 图2是不同处理Beta多样性PCoA分析图；
[0016] 图3是不同处理UPGMA聚类树图；
[0017] 图4是土壤样品制备与上机测序的过程图。
具体实施方式
[0018] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0019] 实施例1：
[0020] 1、材料与方法
[0021] 1.1供试材料
[0022] 烟草品种采用云烟85，该品种易感青枯病。拮抗菌采用前期自健康烟草根际土壤分离筛选到的L-25（短短芽孢杆菌，Brevibacillus brevis）和L-9（娄彻氏链霉菌，Streptomyces rochei），其中，L-25经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（CGMCC No.3175）。有机肥载体为菜粕酶解的氨基酸有机肥与牛粪以1:1（质量比）混合，含有机质33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O5 2.26%、K2O 1.08%。
[0023] 1.2抑制烟草青枯病型生物有机肥的制备
[0024] 将拮抗菌L-25接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，L-9接种于高氏一号液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h。将上述发酵液6000×g离心10 min，收集菌体按5%接种量接种于灭菌后的有机肥载体。调节有机肥含水量为40%，发酵5～6 d，定期翻抛。发酵结束后，通过稀释平板梯度计数和荧光定量PCR测定L-9与L-25生物有机肥有效活菌数及拮抗菌数量（表1）。L-25与L-9分别二次发酵的生物有机肥以1:1（w:w）混合后制成的生物有机肥称为BOF。
[0025] 表1 拮抗菌二次发酵前后微生物数量（cfu/g）
[0026]
[0027] 1.3田间试验设计
[0028] 分别于2012-2014年在贵州省黔南州长顺县广顺镇石洞村（26.03°N，106.45°E）连续开展三年长期定位修复试验。所选的长期定位修复试验点试验前青枯病发病率达到100 %，当年已经决定不再种植烟草。田间试验共设四个处理：T1（CK）：只施用975 kg/hm2的烟草专用复合肥料（N:P2O5:K2O=10:15:25）；T2：生物有机肥处理（BOF），在施用817.5 kg/hm2烟2
草专用复合肥料 基础上加施375 kg/hm的BOF，磷和钾不足的部分分别用过磷酸钙和硫酸钾补齐；T3：在T2基础上采取土壤深翻（打破犁底层），深度大于30cm。T4：在T3处理基础上在移栽前20天施用600 kg/hm2生石灰调节土壤pH。
草专用复合肥料 基础上加施375 kg/hm的BOF，磷和钾不足的部分分别用过磷酸钙和硫酸钾补齐；T3：在T2基础上采取土壤深翻（打破犁底层），深度大于30cm。T4：在T3处理基础上在移栽前20天施用600 kg/hm2生石灰调节土壤pH。
[0029] 供试黄壤pH 5.45，有机质48.6 g/kg，全氮2.29 g/kg，碱解氮158 mg/kg，速效磷48.9 mg/kg，速效钾543 mg/kg。每处理4个重复区组，每区组120株烟株，加保护行等共占地
0.05 hm2。田间管理及追肥的施用与当地其他烟田相同。
0.05 hm2。田间管理及追肥的施用与当地其他烟田相同。
[0030] 1.4 田间试验病害调查及相关性状测量
[0031] 分别于烟草移栽后40至90天每隔10天，观测烟草发病情况并测定根际土壤微生物病原菌与拮抗菌数量及群落结构和功能多样性，烟叶采摘并烘烤后计算各处理产量。
[0032] 1.4.1 病情指数与防控效果
[0033] 青枯病调查分级标准（以株为单位）：调查病情指数以及防控效果，采用Liu等方法进行测定。病情指数与防控效果的计算如下：
[0034]
[0035]
[0036] 1.4.2烟草产量测定
[0037] 烟草移栽后约60～70天，叶片开始自下而上逐渐成熟，根据烟叶成熟情况由下至上分次采收并放于烤房中烘烤，烘烤后计算其产值量。
[0038] 1.5 土壤病原菌与拮抗菌数量消长关系
[0039] 土壤基因组DNA采用Soil DNA Isolation Kit (Omega)提取，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。以样品DNA作为扩增模板，分别用病原菌（Ralstonia solanacearum）与拮抗菌（Brevibacillus brevis）的特异性引物在荧光定量PCR仪（StepOne Plus Real-time PCR System, ABI）上进行扩增反应，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，记录每个样品的Ct值，并将Ct值代入标准曲线方程，计算出样品模板的初始基因拷贝数，最终换算出每克干土的茄科劳尔氏菌或短短芽孢杆菌的基因拷贝数。
[0040] 荧光定量PCR结果显示，茄科劳尔氏菌的扩增效率达到91%，短短芽孢杆菌的扩增2
效率达到100%，标准曲线R >0.99。茄科劳尔氏菌标准曲线方程为CtR=-3.564C0R+38.744，短短芽孢杆菌标准曲线方程为：CtB=-3.322C0B+37.209。
效率达到100%，标准曲线R >0.99。茄科劳尔氏菌标准曲线方程为CtR=-3.564C0R+38.744，短短芽孢杆菌标准曲线方程为：CtB=-3.322C0B+37.209。
[0041] L-9计数采用娄彻氏链霉菌选择性培养基。荧光定量PCR方法测定土壤中短短芽孢杆菌L-25和病原菌茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）数量。拮抗菌数量为L-9和L-25数量之和。
[0042] 1.6 根际土壤微生物区系检测
[0043] 移栽90天后采集根际土壤，将烟株慢慢连根拔起，轻轻震荡掉附着的土块，将根连同根上震荡不掉的土壤置于10mL灭菌水中，超声波震荡15 min后得到的土壤即为根际土壤。
[0044] 1.6.1 PCR反应
[0045] 上述提取的土壤DNA，取矢量的样品于离心管中，使用无菌水稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。 引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R。PCR产物使用2 %浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Thermo Scientific公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。
[0046] 1.62 文库构建、测序和信息分析
[0047] 使用New England Biolabs公司的NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用MiSeq进行上机测序。基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端测序（Paired-End）的方法， 构建小片段文库进行双末端测序。土壤样品制备与上机测序的过程见图4。
[0048] 测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。然后基于有效数据利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对所有样品的全部 Effective Tags 序列聚类，以95%的一致性(Identity)进行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上，可以进行一系列的基于OTUs、Shannon、物种组成的聚类分析、主成分分析（Principal Component Analysis，PCoA）等。
[0049] 2、结果与分析
[0050] 2.1 烟草青枯病的综合防控效果
[0051] 采用生物防控综合措施后，2012年移栽53d后各处理烟株全部暴发青枯病，各处理间的防控效果无显著差异。2013年各处理对烟草青枯病的防控效果显著好于2012年（表2），T4处理在烟草全生育期的防控效果显著高于T2和T3处理，在烟草生育90d后仍分别比T2和T3高78.1%和18.2%。2014年T4和T3处理的青枯病发生比对照推迟40d，T4处理在60d后防控效果显著高于T3和T2处理，在90d后防控效果分别是T2和T3的5.25和0.99倍。
[0052] 表 2 综合防控烟草青枯病防控效果动态变化
[0053]
[0054] 2.2 产量产值
[0055] 由于2012年移栽60d后各处理烟株全部暴发青枯病，各处理间的产值量均为零（表3）。2013年T4处理产量显著高于其他各处理，分别为T1、T2和T3处理的3.71、1.61和1.13倍，T4、T3和T2处理的产值分别是T1的3.44、2.62和1.87倍。2014年T4处理产量和产值显著高于其他处理，T1与T2的产量和产值之间无显著差异菌显著低于T3处理。
[0056] 表3 长顺综合防控试验产值量
[0057]
[0058] 2.3 土壤病原菌与拮抗菌的消长关系
[0059] 从图1中可以看出，修复1年时（2012年）各处理病原菌数量在烟草移栽30d后居高不下，一直保持在107 cfu/g 土以上，而T2、T3和T4处理的拮抗菌数量全生育期基本呈直线下降最后降为104 cfu/g 土；经过2年修复后（2013年），T1处理的病原菌数量在30d后即达到107 cfu/g 土，经过生物有机肥处理的T2、T3和T4处理病原菌数量呈现缓慢上升的趋势，但生物有机肥各处理的拮抗菌在70d之前均显著高于各自对应的病原菌数量，在80d，T3和T4处理的病原菌数量与拮抗菌数量之间无显著差异，而T2处理的病原菌数量是拮抗菌的1.49倍成显著差异； 2014年T1和其他处理病原菌数量在50d前呈现缓慢上升趋势的，在50d后T1处理病原菌数量迅速上升，T2处理病原菌数量在70d后才呈现上升趋势，而T4病原菌数量则始终处于106 cfu/g土数量级以下，在烟草移栽90 d后，各处理除T4外土壤中病原菌数量均增长至107 cfu/g土以上。拮抗菌的数量在全生育期呈现逐渐降低的趋势，T2处理病原菌与拮抗菌的数量交汇时间在72d，T3处理的交汇时间为78d，而T4的拮抗菌数量在90d后仍然高于病原菌数量，达到1.23×106 cfu/g.soil，随着生物修复防控时间的延长拮抗菌的数量降低速度趋于缓慢。
[0060] 2.4 根际土壤微生物区系分析
[0061] 2.4.1 不同处理根际土壤微生物物种丰度水平
[0062] 经分析，T1与T4处理的微生物属水平分布差异显著，T1处理的Planctomyces，Sphingobium，Rhodanobacter，Gemmata，Candidatus_Nitrososphaera和Stenotrophomonas六个属为丰度水平较高的种群，而Chitinophaga、Niastelia、Methylotenera等属相对丰度水平较低，而T4处理丰度水平较高的种群只有Nitrospira和Novosphingobium，较低的只有Phenylobacterium属，其它微生物属之间丰度差异较小，分布水平相近，整体微生物群落处于平衡、均匀的状态。
[0063] 2.4.2 不同处理根际土壤微生物门水平比较
[0064] 经分析，T4处理的Cyanobacteria（蓝细菌门）相对含量远远高于T1处理。蓝细菌是一种能进行自氧光全作用的大型原核微生物，可以通过固氮来提高稻田和其他土壤氮水平，而T1中Acidobacteria（酸杆菌门）和Crenarchaeota（泉古菌）相对含量远远高于T4。
[0065] 2.4.3 不同处理根际土壤微生物alpha多样性指数
[0066] 从表4中可以看出，经过综合防控后的T2、T3和T4，其OTUs数量显著高于T1，多样性指数Shannon从T1到T4四呈逐渐升高状态，T4多样性指数高于T1。
[0067] 表4 不同处理的Alpha多样性
[0068]
[0069] 注：不同处理土壤微生物种水平下的alpha多样性指数基于97%的序列相似性而得到。
[0070] 2.4.4 不同处理根际土壤微生物群落构成PCoA分析
[0071] PCoA是一种从复杂的多维变量数据中提取主要变量，并进行可视化的方法。对Beta多样性进行PCoA分析后，如图2所示，T3与T4处理土壤微生物多样性关系较近，均处在左下半部，T2处理的土壤微生物多样性在像限的左上部，而T1处理与T2、T3和T4处理之间关系较远，处于像限的右上部。
[0072] 2.4.5 不同处理根际土壤微生物物种相似性
[0073] 以UPGMA（Unweighted PairGroup Method with Arithmetic mean）为聚类方法，通过对样品进行聚类分析，研究物种组成的相似性。从图3中可以看出，T3和T4的聚类关系较近，而T1与各处理的聚类关系最远。
[0074] 实施例2：
[0075] 在栽种烟草前对土壤进行以下处理：1）土壤预处理：在上一年烟草收获后1个月，一般在10～11月份内，用生石灰100kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种晚熟油菜，并在来年2-3月份作压青处理；3）土壤再处理：用生石灰100 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻，深度大于30cm；5）施加实施例1中的生物有机肥BOF即可。
[0076] 实施例3：
[0077] 在栽种烟草前对土壤进行以下处理：1）土壤预处理：在上一年烟草收获后1个月，一般在10～11月份内，用生石灰90kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种小麦，并在来年2-3月份作压青处理；3）土壤再处理：用生石灰90 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻，深度大于30cm；5）施加实施例1中经二次发酵的L-25生物有机肥即可。
[0078] 实施例4：
[0079] 在栽种烟草前对土壤进行以下处理：1）土壤预处理：在上一年烟草收获后1个月，一般在10～11月份内，用生石灰90kg/亩，均匀撒在土壤表层；2）在土壤上播种三叶草，并在来年2-3月份作压青处理；3）土壤再处理：用生石灰100 kg/亩再次均匀撒在土壤表层；4）对土壤进行深翻，深度大于30cm；5）施加实施例1中经二次发酵的L-9生物有机肥即可。