一种竹蛏活性六肽及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种竹蛏活性六肽，其氨基酸序列为：Val‑Pro‑Trp‑Asp‑Thr‑Asp，ESI/MS检测分子量为731.7Da；通过以下步骤制得：新鲜竹蛏去壳取肉，竹蛏肉洗净后捣碎，进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值备用；在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，将所得酶解样品进行超滤、G‑25凝胶分离反相高效液相色谱纯化，收集洗脱峰组分并进行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性六肽。该竹蛏活性六肽对人前列腺癌PC‑3细胞的最大增殖抑制率可达90％以上，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础，该竹蛏活性六肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，对进一步研究和开发以竹蛏为基础的药物和食品、提高竹蛏的经济价值具有重大意义。

权利要求

1.一种竹蛏活性六肽，其氨基酸序列为：Val-Pro-Trp-Asp-Thr-Asp，ESI/MS检测分子量为731.7Da。

2.一种如权利要求1所述的竹蛏活性六肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）新鲜竹蛏去壳取肉，洗净后捣碎，按料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值为9.6备用；

（2）在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为50℃，加酶量为300U/g竹蛏肉，酶解时间为8h，酶解完成后于95 100 ℃、10 15min 进行灭酶；

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（3）将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷冻干燥；

（4）对步骤（3）中收集的酶解液进行G-25凝胶分离，收集洗脱峰4；

（5）对步骤（4）中收集的洗脱峰4进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性六肽;前述反相高效液相色谱条件为：Zorbax SB-C18色谱柱 4.6×250mm 5um，检测波长

280nm/214nm，柱温为20℃，进样量为100ul，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，流动相A为0.06%TFA，B为0.05%TFA的乙腈，洗脱程序：0% 0%B 洗脱4分钟，0% 7%B 洗脱25分钟，7% 100%B 洗~ ~ ~脱1分钟，100% 100%B 洗脱5分钟。

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3.一种如权利要求1所述的竹蛏活性六肽在制备抗前列腺癌药物中的应用。

说明书

一种竹蛏活性六肽及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物活性肽领域，尤其涉及一种竹蛏活性六肽及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 竹蛏又名蛏子王，为海产双壳软体动物，体呈延长形，两壳合抱后呈竹筒状，故有竹蛏之名。竹蛏贝壳光滑，呈黄褐色，有光泽，壳质脆薄，表面突出，背缘与腹缘平行，后端纯圆，呈长方形，生长线明显，长约11厘米。我国南北沿海均有分布，肉味鲜美，鲜食、干制均可。竹蛏肉味甘咸、性寒，入心、肝、肾经；具有补阴、清热、除烦，解酒毒等功效；对产后虚阴、烦热口渴、湿热水肿、痢疾以及醉酒等有一定治疗作用。

[0003] 活性肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理作用，发挥生理功能，如：调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细胞代谢，能起到防癌作用等。活性肽一般通过酶解生物活性材料获得，郑惠娜等发现食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽(《海洋蛋白酶解制备生物活性肽的研究进展》，郑惠娜、章超桦、曹文红，水产科学，2008,27(7)，370)。目前关于蛏类活性肽的研究主要集中于缢蛏，如：雷晓凌等对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强(《缢蛏糖胺聚糖的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究》，雷晓凌、吴红棉、范秀萍等，药物生物技术，2004,11(3)：146-149)；张永娟等研究发现提取的缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发育及迟发型变态反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平(《缢蛏多肽的免疫调节及抗氧化作用》，张永娟、郑惠娜，时珍国医国药，2011,22(5)：1076-1077)。

[0004] 竹蛏与缢蛏外形不同，食用时风味也稍有不同，目前关于竹蛏酶解多肽的研究还未见报道，因此对竹蛏酶解多肽进行研究，对进一步研究和开发以竹蛏酶解多肽多基础的功能性食品和药物，提高竹蛏的经济价值具有重大意义。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种具有抗肿瘤活性的竹蛏活性六肽。

[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述竹蛏活性六肽的制备方法。

[0007] 本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述竹蛏活性六肽的应用。

[0008] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种竹蛏活性六肽，其氨基酸序列为：Val-Pro-Trp-Asp-Thr-Asp，ESI/MS检测分子量为731.7Da。

[0009] 本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：上述竹蛏活性六肽的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)新鲜竹蛏去壳取肉，竹蛏肉洗净后捣碎，按料液比1:1～3加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值为8～10.4备用；

[0011] (2)在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，酶解温度为35～50℃，加酶量为300～1200U/g竹蛏肉，酶解时间为2～8h，酶解完成后于95～100℃、10～15min进行灭酶；

[0012] (3)将上述酶解样品过5KD、8KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、分子量为8～5KD以及分子量小于5KD的酶解液组进行冷冻干燥；

[0013] (4)将步骤(3)中的各分子量段的酶解液组分别通过MTT法进行抗肿瘤活性检测，取抗肿瘤活性最高的酶解液组进行G-25凝胶分离，收集相应的洗脱峰；

[0014] (5)对步骤(4)中收集的洗脱峰进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性六肽。

[0015] 作为优选，竹蛏活性六肽的制备方法为：(1)新鲜竹蛏去壳取肉，洗净后捣碎，按料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值为9.6备用；

[0016] (2)在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为50℃，加酶量为300U/g竹蛏肉，酶解时间为8h，酶解完成后于95～100℃、10～15min进行灭酶；

[0017] (3)将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷冻干燥；

[0018] (4)对步骤(3)中收集的酶解液进行G-25凝胶分离，收集洗脱峰4；

[0019] (5)对步骤(4)中收集的洗脱峰4进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性六肽；

[0020] 前述反相高效液相色谱条件为：Zorbax SB-C18色谱柱4.6×250mm 5um，检测波长280nm/214nm，柱温为20℃，进样量为100ul，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，流动相A为0.06％TFA，B为0.05％TFA的乙腈，洗脱程序：0％～0％B洗脱4分钟，0％～7％B洗脱25分钟，7％～
100％B洗脱1分钟，100％～100％B洗脱5分钟。

[0021] 本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种上述竹蛏活性六肽在制备抗肿瘤药物和食品中的应用。

[0022] 所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的增殖活性，所述肿瘤为人前列腺癌。

[0023] 进一步，所述竹蛏活性六肽对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制率与浓度和作用时间呈依赖关系。

[0024] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了一种全新的竹蛏活性六肽，能较好地抑制人前列腺癌细胞增殖活性，对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可高于90％，体外抗前列腺癌效果显著，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础。该竹蛏活性六肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，采用碱性蛋白酶进行酶解，酶解方式温和，酶解产品贴合人体自然需要，对进一步研究和开发以竹蛏为基础的药物、提供竹蛏的经济价值具有重大意义。

附图说明

[0025] 图1为本发明实施例1中分子量小于5KD的酶解液样品的G-25分离纯化图；

[0026] 图2为本发明实施例1峰4样品的反相高效液相色谱图；

[0027] 图3为本发明实施例1中竹蛏活性六肽(Val-Pro-Trp-Asp-Thr-Asp)的质谱(ESI/MS)图；

[0028] 图4为本发明实施例2中竹蛏活性六肽(Val-Pro-Trp-Asp-Thr-Asp)对PC-3细胞增殖活性的影响。

具体实施方式

[0029] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0030] 实施例1：竹蛏活性六肽的制备

[0031] 1、前处理：

[0032] 取新鲜竹蛏，去壳取竹蛏肉，洗净后沥干备用。

[0033] 2、碱性蛋白酶解

[0034] 2.1用高速组织捣碎机将竹蛏肉捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比1:1～3，精密称取匀浆液，用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节匀浆液pH值，加入碱性蛋白酶酶解数小时，酶解条件为：酶解温度35～50℃，pH为8～10.4，酶解时间2～8h，加酶量300～1200U/g竹蛏肉。酶解结束后于100℃下灭酶15min，4℃下离心15min(10000r/min)，取上清液备用。

[0035] 2.2碱性蛋白酶解工艺优化

[0036] 2.2.1选用碱性蛋白酶，以A(温度)、B(pH)、C(加酶量)、D(料液比)和E(时间)5个因素，选4个水平进行L16(45)的正交实验，通过MTT法筛选在不同酶解条件下的酶解液对前列腺癌细胞增殖抑制率最高的酶解条件，从而确定最佳水解条件，并进行大量酶解。碱性蛋白酶因素和水平如表1所示：

[0037] 表1碱性蛋白酶的因素与水平

[0038]

[0039] 2.2.2本实施例中选取前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞(原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存)，细胞培养过程如下：

[0040] (1)、细胞复苏

[0041] 从液氮罐中取出存放的PC-3细胞株，快速的放入37℃恒温水浴锅中进行融化，待融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离心管，加入2mL的F12营养液，1000rpm离心10min，去上清液，加入4ml的营养液，反复吹打使细胞成为单个细胞。然后用吸管将细胞均匀的吸入到2个25mL的培养瓶中，放入5％CO2、37℃的恒温培养箱培养，次日换液倒掉未贴壁的死亡细胞。

[0042] (2)、细胞培养

[0043] 将人前列腺癌细胞PC-3接种到分别含有10％胎牛血清(体积分数)FBS和双抗(青霉素G100IU/mL、链霉素100IU/mL)的F12和1640营养液中，放置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，细胞贴壁生长，每1天换液一次，待细胞长满培养瓶的80％左右时进行传代。按照1∶2的比例进行传代，收集对数生长期细胞进行实验。

[0044] (3)、细胞传代

[0045] 先将长满细胞的培养瓶从恒温培养箱中取出放到无菌操作台上。传代时，先倒掉瓶中的营养液，去除不贴壁生长的死细胞，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液混合消化，不同细胞消化的时间不同，一般消化时间为3-5min；显微镜下观察细胞，当细胞间隙明显变大且细胞变圆变亮时，说明细胞已经消化完毕，去掉消化酶液。在培养瓶中加入2.5mL左右的营养液，反复吹打消化好的贴壁细胞使之成为单个细胞，一般情况下一瓶细胞传2瓶，将传代好的细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。

[0046] (4)、MTT法

[0047] 取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，设5个平行孔，于5％CO2，37℃贴壁16-48h，倒置显微镜下观察，弃去培养液，同时将待测样品以不同浓度分别溶于培养液中。然后分别加入每个孔，同时设不加样品的对照组，置5％CO2、37℃培养箱中孵育36h，用PBS冲洗2遍，加入含有MTT的营养液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。加入二甲基亚枫，置摇床上低速振荡10min，采用酶联免疫检测仪于490nm测吸光度值(OD值)。计算细胞增殖抑制指数(IR，Inhibition rate)，即增殖抑制率，按下列公式计算：

[0048]

[0049] 2.2.3、碱性蛋白酶酶解正交结果如表2所示，可见实验号15时IR值最大，因此碱性蛋白酶酶解得最佳条件为：酶解温度：50℃，酶解pH值：9.6，料液比：1：1，时间：8h，加酶量：300U/g。

[0050] 表2碱性蛋白酶酶解正交试验结果

[0051]

[0052] 3、超滤

[0053] 将酶解液加入超滤系统，用8KD、5KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、分子量为8～5KD和分子量小于5KD的酶解液组，冷冻干燥后分别配置成浓度为10mg/mL的酶解溶液进行MTT试验，作用24h小时后，各酶解液组对前列腺癌PC-3的增殖抑制率分别为34.23％、46.57％、67.21％，可见分子量小于5KD的酶解液组对PC-3的增殖抑制作用效果比其他两个组分要好，因此将分子量小于5KD的酶解液组冷冻干燥后进行进一步纯化。

[0054] 4、G-25凝胶分离

[0055] 将上述分子量小于5KD的酶解样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜得滤液，取1.5ml滤液过Sephadex G-25[90cm×115cm(ID)]，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱。每管收集3ml，于λ280nm处检测，收集各峰洗脱液。

[0056] 结果如图1所示，分子量小于5KD的酶解样品过G-25洗脱液得到6各峰，经上述体外抗肿瘤实验筛选，峰4具有最高的抗肿瘤活性，因此收集峰4，冷冻干燥，通过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化。

[0057] 5、反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测

[0058] 将冷冻干燥好的酶解样品用0.06％TFA的水溶解到0.6ml的离心管中，在12000rpm，离心10min取上清液。反相高效液相条件：系统：Agilent 1260HPLC；选用Zorbax SB-C18(4.6×250，5um)；柱温为20℃；流动相A为0.06％TFA，B为0.05％TFA的乙腈，洗脱程序：0％～0％B洗脱4分钟，0％～7％B洗脱25分钟，7％～100％B洗脱1分钟，100％～100％B洗脱5分钟；流速为1.0ml/min；进样量为100ul；检测波长为280nm/214nm。

[0059] RT-HPLC结果如图2所示，由图2可见，该分子段只有一个洗脱峰，收集该洗脱峰并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Val-Pro-Trp-Asp-Thr-Asp；如图3所示，ESI/MS检测的分子分子量为731.7Da([M+H]+731.7Da)，即得所需的竹蛏活性六肽。

[0060] 上述氨基酸序列检测采用采用N末端氨基酸降解检测方法测定：①建立标准氨基酸图谱：利用混合氨基酸标准品(PTH-AA)，在常规条件下运行生成一张标准品色谱图，对混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件。②样品前处理：将纯样品离心后取上清液备用；将聚凝胺(Polybrene)15ul加到玻璃纤维膜(Glass Fiber Disk)上氮气吹干；上机将玻璃纤维膜预处理，即运行5个循环将足量纯样品点加到预处理后的玻璃纤维膜上，氮气吹干。③上机检测：将加好样品的玻璃纤维膜用PTFE滤膜封置于蛋白测序仪PPSQ-31A的反应器里，设定检测氨基酸数及其他参数。

[0061] 实施例2：竹蛏活性六肽抗PC-3细胞增殖活性研究

[0062] 以F12培养基为对照组，利用上述MTT法比较不同浓度、不同作用时间竹蛏活性六肽对PC-3细胞增殖的影响，试验结果如图4所示，可见竹蛏活性六肽能有效抑制PC-3增殖，且呈浓度和时间依赖性。

[0063] 上述各实施例中使用的主要材料与试剂：

[0064] 竹蛏购自浙江省舟山市南珍市场；前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞(原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存)；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；HamF12培养基，Gibco公司；碱性蛋白酶，美国SIGMA公司；青霉素、链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司；MTT购自美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国AMRESCO公司；其余试剂均为分析纯。

[0065] 上述各实施例所使用的主要仪器：

[0066] DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超滤系统，美国密理博公司；PHS-250pH计，上海理达仪器厂；CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；ZHJH-C1209C型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；Forma 3111型CO2培养箱，美国Thermo公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；微量震荡器，上海精密仪器有限公司。