用于转染细胞的方法和产品

摘要

本发明部分涉及编码蛋白质的核酸；含有非规范核苷酸的核酸；包含核酸的治疗剂；用于诱导细胞表达蛋白质的方法、试剂盒和装置；用于转染、基因编辑和重新编程细胞的方法、试剂盒和装置；以及使用这些方法、试剂盒和装置产生的细胞、生物体和治疗剂。本文公开了使用RNA用于诱导细胞表达蛋白质和用于重新编程和基因编辑细胞的方法。还公开了用于从患者样品中产生细胞的方法、使用这些方法产生的细胞以及包含使用这些方法产生的细胞的治疗剂。

权利要求

1.一种细胞培养基，其包含：DMEM/F12，10μg/mL胰岛素，5.5μg/mL转铁蛋白，6.7ng/mL亚硒酸钠，20ng/mLbFGF和5mg/mL人血清白蛋白，其中所述人血清白蛋白以离子交换树脂和/或木炭处理。

2.权利要求1的细胞培养基，其进一步包含下列至少一种：15mM HEPES，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，2μg/mL乙醇胺，4.5μg/mL胆固醇，25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯，和1μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物。

3.权利要求1的细胞培养基，其中所述人血清白蛋白还以辛酸钠处理。

4.权利要求1的细胞培养基，其中所述人血清白蛋白还被温育至至少40℃的温度。

5.权利要求1的细胞培养基，其中所述人血清白蛋白是重组的。

6.一种细胞培养基，其包含：DMEM/F12，10μg/mL胰岛素，5.5μg/mL转铁蛋白，6.7ng/mL亚硒酸钠，20ng/mLbFGF和5mg/mL重组人血清白蛋白，其中所述白蛋白以辛酸钠处理，以至少40℃的温度处理，并以离子交换树脂和/或木炭处理。

7.权利要求6的细胞培养基，其进一步包含下列至少一种：15mM HEPES，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，2μg/mL乙醇胺，4.5μg/mL胆固醇，25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯，和1μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物。

8.包含权利要求1的细胞培养基的试剂盒。

9.权利要求8的试剂盒，其中所述白蛋白是重组的。

10.权利要求8的试剂盒，其进一步包含一种或多种合成的RNA分子，其中所述一种或多种合成的RNA分子包括至少一种编码一种或多种重编程因子的RNA分子。

11.权利要求10的试剂盒，其中所述一种或多种合成的RNA分子包括至少一种编码下列至少一种的RNA分子：Oct4蛋白，Sox2蛋白，Klf4蛋白，和c-Myc蛋白。

12.权利要求10的试剂盒，其中所述一种或多种合成的RNA分子包括至少一种编码Oct蛋白的RNA分子，至少一种编码Sox2蛋白的RNA分子，至少一种编码Klf4蛋白的RNA分子，和至少一种编码c-Myc蛋白的分子。

13.权利要求10的试剂盒，其中所述一种或多种合成的RNA分子包括下列至少一种：假尿苷残基和5-甲基胞苷残基。

说明书

用于转染细胞的方法和产品

[0001] 本申请是申请号为201280068223.0的专利申请的分案申请。

[0002] 优先权

[0003] 本申请要求2011年12月5日提交的美国临时申请号61/566,948、2011年12月12日提交的美国临时申请号61/569,595、2012年4月24日提交的美国临时申请号61/637,570、2012年5月7日提交的美国申请号13/465,490以及2012年6月26日提交的美国临时申请号
61/664,494的优先权，所述申请都特此以引用的方式整体并入。
发明领域

[0004] 本发明部分涉及编码蛋白质的核酸；含有非规范核苷酸的核酸；包含核酸的治疗剂；用于诱导细胞表达蛋白质的方法、试剂盒和装置；用于转染、基因编辑和重新编程细胞的方法、试剂盒和装置；以及使用这些方法、试剂盒和装置产生的细胞、生物体和治疗剂。

[0005] 电子呈送的文本文件的描述

[0006] 由此电子呈送的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：FABI_001_01WO_SeqList_ST25.txt；记录日期：2012年12月4日；文件大小：18KB)。

[0007] 背景

[0008] 核酸转染

[0009] 可以通过在体外和体内使核酸与带电的脂质、利匹哆异德(lipidoid)、肽、其聚合物或混合物预先复合来将核酸递送至细胞。此类转染试剂为可商购的，并且广泛用于将核酸递送至培养的细胞。暴露于转染试剂-核酸复合物的细胞可以通过内吞作用或其它方式内化这些复合物。一旦在细胞里面，核酸可以进行它的预期的生物功能。在蛋白质编码RNA的情况下，例如，RNA可以通过细胞的核糖体翻 译成蛋白质。

[0010] 无血清细胞培养

[0011] 动物血清如胎牛血清(FBS)通常用作细胞培养基中的补充剂以促进许多类型的细胞的生长。然而，血清的不确定性质使得与这种组分接触的细胞对于研究和治疗应用而言不可取。因此，已开发了无血清细胞培养基以消除批料与批料之间的变化和被与血清缔合的毒性物质和/或病原物质污染的危险。

[0012] 血清中最丰富的蛋白质为血清白蛋白。血清白蛋白在体外和体内结合各种各样的分子，包括激素、脂肪酸、钙离子和金属离子以及小分子药物，并且可以在体外和体内将这些分子运输至细胞。血清白蛋白(最经常地牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA))是无血清细胞培养基中的常见成分，其中它通常在1g/L至10g/L的浓度下使用。血清白蛋白传统上通过乙醇分级分离(“科恩(Cohn)”工艺)由血浆制备。分离含有血清白蛋白的级分(“科恩级分V”或简单地“级分V”)，并且通常不需进一步处理而使用。因此，血清白蛋白的标准制剂包含蛋白质部分(血清白蛋白多肽)和缔合分子部分(包括结合血清白蛋白多肽的盐、脂肪酸等等)。血清白蛋白的缔合分子组分的组成通常是复杂和未知的。

[0013] 可以处理血清白蛋白用于某些专门的应用(参见Barker A method for the deionization of bovine serum albumin.Tissue Culture Association.1975；Droge等Biochem Pharmacol.1982；31:3775-9；Ng等Nat Protoc.2008；3:768-76；美国专利申请公布号US2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并入)。这些处理方法最常见用来使球蛋白和污染病毒从血清白蛋白的溶液中去除，并且经常包括通过添加短链脂肪酸、辛酸，接着是热灭活/沉淀污染物来稳定血清白蛋白多肽。针对高度专门化的干细胞培养应用，使用离子交换树脂使过量盐从BSA溶液中去除已示出增加细胞存活力(参见Ng等Nat Protoc.2008；3:768-76；美国专利申请公布号US2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并 入)。然而，重组血清白蛋白没有获益于所述处理，甚至在相同敏感的干细胞培养应用中(参见Ng等Nat Protoc.2008；3:768-76；美国专利申请公布号US 2010/0168000，所述参考文献和专利申请的内容特此以引用的方式并入)，证明了这些应用中的去离子化的作用是为了使过量盐从白蛋白溶液中去除，并不改变白蛋白的缔合分子组分。另外，先前尚未探索所述处理对其它细胞类型如人成纤维细胞的作用和所述处理对转染效率和转染相关的毒性的作用。此外，白蛋白缔合的脂质已示出是对人多能干细胞培养关键的，并且从白蛋白中去除这些已示出会导致人多能干细胞的自发分化，甚至当将脂质分开地添加至细胞培养基中(参见Garcia-Gonzalo等PLoS One.2008；3:
e1384，所述参考文献的内容特此以引用的方式并入)。因此，认为含有带未修饰的缔合分子组分的白蛋白的细胞培养基是对人多能干细胞培养关键的。重要地，先前尚未探索脂质载体如白蛋白的缔合分子组分与转染效率和转染相关的毒性之间的关系。

[0014] 细胞重新编程

[0015] 可以通过将它们暴露于具体细胞外信号(cue)和/或通过异位表达具体蛋白质、微RNA等等来重新编程细胞。虽然先前已描述了若干重新编程方法，但是依靠异位表达的大多数方法要求引入外源DNA，这会携带突变危险。已报道了基于直接递送重新编程蛋白的无DNA重新编程方法，然而这些方法效率太低并且对于商业使用而言不可靠。另外，已描述了基于RNA的重新编程方法，然而，当在成年细胞上进行时，现有的基于RNA的重新编程方法是缓慢的、不可靠的和效率低的，要求许多转染(导致相当大的费用和出错机会)，可以仅重新编程有限数量的细胞类型，可以使细胞重新编程为仅有限数量的细胞类型，要求使用免疫抑制剂并且要求使用多种人来源的组分，所述人来源的组分包括血液来源的HSA和人成纤维细胞供给者(feeder)。先前公开的细胞重新编程方法的许多缺点使得它们对于研究和治疗使用而言不可取。

[0016] 基因编辑

[0017] 若干天然存在的蛋白质含有DNA结合结构域，所述DNA结合结构域可以识别具体DNA序列，例如锌指(ZF)和转录激活因子样效应子(TALE)。含有一个或多个DNA结合结构域和核酸酶的催化结构域的融合蛋白可以用来在细胞中的DNA的希望的区中产生双链断裂。当与含有同源于细胞的DNA的一个或多个区的DNA模板组合时，基因编辑蛋白可以用来插入DNA序列或另外地以控制的方式改变细胞的DNA的序列。然而，用于基因编辑细胞的大多数目前的方法使用基于DNA的载体来表达基因编辑蛋白。因此，这些基因编辑方法是效率低的，并且携带不受控制的诱变的危险，使得它们对于研究和治疗使用而言不可取。先前尚未探索用于无DNA基因编辑体细胞的方法，或用于同时或依次基因编辑和重新编程体细胞的方法。最后，先前尚未探索在抗细菌、抗病毒或抗癌治疗中使用基因编辑。

[0018] 模式生物

[0019] 已通过胚胎微注射编码锌指核酸酶和TALE-核酸酶(TALEN)的核酸来产生基因敲除大鼠。还已经通过将编辑锌指核酸酶的核酸注射到胚胎中而在小鼠和大鼠中报道了引入序列特异性突变(又称为“敲入”)的基因编辑。使用胚胎干细胞产生基因修饰的大鼠，并且通过体细胞重新编程产生有种系形成能力的大鼠多能干细胞。然而，先前尚未探索使用基因编辑的重新编程细胞来产生基因修饰的生物体，包括小鼠和大鼠。

[0020] 本领域中存在对用于转染细胞的改进方法和产品的需要。

[0021] 发明概述

[0022] 因此，本发明提供了用于诱导细胞表达蛋白质和用于转染、重新编程和基因编辑细胞的试剂、方案、试剂盒以及装置。不像先前报道的方法，本发明的某些实施方案不涉及使细胞暴露于外源DNA或异源或动物来源的材料。

[0023] 一方面，本发明提供包含三个或更多个非规范核苷酸的合成RNA分子，所述每个非规范核苷酸包括来自以下的一个或多个取代：嘧啶位置2C、嘧啶位置4C、嘧啶位置5C、嘌呤位置6C、嘌呤位置7N 以及嘌呤位置8C。在一些实施方案中，合成RNA分子由体外转录产生。在其它实施方案中，合成RNA分子进一步包含以下的至少一种：5'-帽、5'-帽1结构和3'-聚(A)尾。在其它实施方案中，至少两个非规范核苷酸为嘧啶。在还其它的实施方案中，非规范核苷酸包括以下的至少一种：假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、
5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、
5-氨基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、N6-甲基腺苷、7-脱氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷。在其它实施方案中，至少两个非规范核苷酸各包含小于20％的合成RNA分子。在还其它的实施方案中，非规范核苷酸包括以下的至少一种：假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、
5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷以及5-氨基假尿苷；以及以下的至少一种：假异胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷以及5-甲基假异胞苷。在另一实施方案中，非规范核苷酸进一步包括以下的至少一种：N6-甲基腺苷、7-脱氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷。

[0024] 另一方面，本发明提供了包含非规范核苷酸并且编码基因编辑蛋白的合成RNA分子。

[0025] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含本文所描述的合成RNA分子的治疗组合物。

[0026] 另一方面，本发明提供了治疗组合物，其包含编码基因编辑蛋白的合成RNA分子和转染试剂。

[0027] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于使用核酸转染细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的合成RNA分子接触。

[0028] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导哺乳动物细胞表达感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的合成RNA分子接触。在另一个实施方案中，本发明提供了用于重新编程细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的合成RNA分子接触。在另一个实施方案中，本发明提供了用于基因编辑细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的合成RNA分子接触。

[0029] 另一方面，本发明提供了用于使用核酸转染细胞的方法，所述方法包括：使细胞与含有氢化可的松和/或白蛋白的培养基接触，其中白蛋白用离子交换树脂或木炭处理；以及使细胞与核酸接触。在一个实施方案中，白蛋白用短链脂肪酸处理，和/或使其达到至少40℃的温度。在其它实施方案中，方法进一步包括使细胞与转染试剂接触。在其它实施方案中，细胞为哺乳动物细胞，并且哺乳动物细胞被诱导表达感兴趣的蛋白质。在其它实施方案中，方法进一步包括在连续5天期间使细胞与核酸接触至少两次。在一些实施方案中，核酸编码重新编程蛋白。在其它实施方案中，细胞被重新编程。在又另一个实施方案中，细胞为皮肤细胞，并且进一步包括在支持以下的至少一种生长的条件下培养皮肤细胞：皮肤细胞、多能干细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞以及视网膜细胞，并且其中皮肤细胞被重新编程为选自以下的细胞：皮肤细胞、多能干细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞以及视网膜细胞。在又另一个实施方案中，核酸编程Oct4蛋白。在又另一个实施方案中，方法进一步包括使细胞与编码以下的至少一种的核酸接触：Sox2蛋白、Klf4蛋白和c-Myc蛋白。在又另一个实施方案中，方法进一步包括使细胞与编码Sox2蛋白、Klf4蛋白和c-Myc蛋白的一种或多种核酸接触。在还其它的实施方案中，核酸编码基因编辑蛋白。在还其它的实施方案中，核酸编码单独作用或与一个或多个其它分子组合作用而在DNA分子中产生单链或双链断裂的蛋白质。在各种实施方案中，细胞被基因编 辑。在一些实施方案中，单链或双链断裂处于选自以下的基因的转录起始位点的约5,000,000个碱基内：CCR5、CXCR4、GAD1、GAD2、CFTR、HBA1、HBA2、HBB、HBD、FANCA、XPA、XPB、XPC、ERCC2、POLH、HTT、DMD、SOD1、APOE、APP、LRRK2、PRNP、BRCA1和BRCA2或其类似物、变体或家族成员。
在一些实施方案中，方法进一步包括使细胞与以下的至少一种接触：聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、RGD肽、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原以及层粘连蛋白或其生物活性片段、功能性变体或家族成员。在还其它的实施方案中，核酸为合成RNA分子，所述合成RNA分子可以含有以下的至少一种：假尿苷、5-甲基假尿苷和5-甲基胞苷。在一些实施方案中，方法提供了使细胞与分化因子接触和/或从患者中收获细胞和/或将细胞递送至患者。

[0030] 另一方面，本发明提供了包含白蛋白的培养基，其中白蛋白为重组的，并且用离子交换树脂或木炭处理。在另一个实施方案中，培养基进一步包含缓冲的盐溶液和氨基酸和/或以下的一种或多种：胰岛素、转铁蛋白和硒和/或胆固醇和/或类固醇(例如，氢化可的松)和/或免疫抑制剂(例如B18R)。

[0031] 另一方面，本发明提供了包含氢化可的松和/或白蛋白以及合成RNA分子的试剂盒，其中白蛋白用离子交换树脂或木炭处理。在一个实施方案中，合成RNA分子编码以下的至少一种：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、Nanog蛋白、Lin28蛋白以及Utf1蛋白。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含转染试剂和/或本文所描述的合成RNA分子。在另一个实施方案中，试剂盒为重新编程试剂盒和/或基因编辑试剂盒。

[0032] 另一方面，本发明提供了包含核酸和转染试剂的核酸转染-试剂复合物，其中核酸转染-试剂复合物通过冷却来固化。在一些实施方案中，核酸转染-试剂复合物通过使核酸转染-试剂复合物与在液相和/或汽相下的液氮接触来固化。

[0033] 另一方面，本发明提供了用于转染细胞的方法，所述方法包括使 细胞与本文所描述的核酸转染-试剂复合物接触。

[0034] 另一方面，本发明提供了用于转染细胞的系统，所述系统包括用于使细胞与转染培养基接触的装置和用于使细胞与核酸转染-试剂复合物接触的装置。在一些实施方案中，细胞周围的大气含有大约5％二氧化碳和/或大约5％氧气。

[0035] 在一些实施方案中，本发明提供了细胞和/或生物体和/或治疗组合物和/或包含通过本文所描述的方法产生的细胞的治疗组合物。

[0036] 在一些方面中，提供了具有低毒性和高翻译效率的合成RNA分子。在其它方面中，提供了用于产生合成RNA分子和将合成RNA分子递送至细胞的方法、试剂盒和装置。在还其它的方面中，提供了用于高效转染、重新编程和基因编辑细胞的细胞培养基。其它方面涉及包含合成RNA分子的治疗剂，所述治疗剂包括用于治疗1型糖尿病、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、重度联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病、癌症以及传染病(包括肝炎和HIV/AIDS)。另外的方面涉及包含细胞的治疗剂，所述治疗剂包括用于治疗1型糖尿病、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、重度联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病、癌症以及传染病(包括肝炎和HIV/AIDS)。

[0037] 附图详述

[0038] 在所附附图中通过实例的方式而并非通过限制的方式说明了本发明，并且其中：

[0039] 图1描绘了在变性甲醛-琼脂糖凝胶上分辨的编码指定蛋白质的RNA。

[0040] 图2A描绘了使用编码Oct4并且包含指定核苷酸的合成RNA转染的原代人成纤维细胞。“A”是指腺苷，“G”是指鸟苷，“U”是指尿苷， “C”是指胞苷，“psU”是指假尿苷，“5mC”是指5-甲基胞苷，“N4mC”是指N4-甲基胞苷，“7dG”是指7-脱氮杂鸟苷，并且“psisoC”是指假异胞苷。核苷酸前面的数字指明体外转录反应中的对应的核苷酸-5'-三磷酸的部分。例如，
0.5N4mC是指在含有等量的N4-甲基胞苷-5'-三磷酸和胞苷-5'-三磷酸的体外转录反应中合成的RNA。固定细胞并且在转染后20h对Oct4蛋白染色。

[0041] 图2B描绘了使用编码Oct4并且包含指定核苷酸的合成RNA转染的原代人成纤维细胞的培养物的Oct4表达和细胞密度。如在图2A中，核苷酸被缩写，除了“7dA”是指7-脱氮杂腺苷，并且“piC”是指假异胞苷。示出细胞密度被归一化为未转染的细胞。示出Oct4表达被归一化为仅含有规范核苷酸的合成RNA。误差棒指明标准误差(n＝3)。

[0042] 图3A描绘了在挑取集落并且铺放在基底膜提取物涂布的板上一天后，通过使用编码蛋白质Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA转染原代人成纤维细胞而产生的重新编程细胞系。

[0043] 图3B描绘了如在图3A中产生、对多能干细胞标记物Oct4和SSEA4染色的重新编程细胞系。标记“Hoechst”的图表明细胞核，并且标记“合并”的图表明来自三个通道的合并信号。

[0044] 图3C描绘了如在图3A中转染和培养的原代人成纤维细胞。总共进行5次转染。在第7天拍摄照片。具有重新编程形态的若干细胞集落是可见的。

[0045] 图4A描绘了1.5mm直径的皮穿孔活组织检查组织样品。

[0046] 图4B描绘了如在图4A中收获并且悬浮在含有酶的溶液的气-液界面处的组织样品。

[0047] 图4C描绘了如在图4A中收获、如在图4B中分离并且铺放在96孔板的孔中的原代人成纤维细胞。

[0048] 图5A描绘了重新编程为胰岛素产生细胞的原代人成纤维细胞。固定细胞并且对胰岛素染色。

[0049] 图5B描绘了重新编程为造血细胞的原代人成纤维细胞。固定细胞并且对CD34染色。

[0050] 图5C描绘了重新编程为搏动心脏细胞的原代人成纤维细胞。

[0051] 图6A描绘了用于产生RNA TALENTM骨架的体外转录模板的正链。

[0052] 图6B描绘了在Golden-Gate克隆反应以并入一系列单体重复从而形成完整的RNA TALENTM模板之后的图6A的模板。

[0053] 图6C描绘了由图6B的模板产生的5'-加帽、3'-聚(A)-加尾的RNA TALENTM。

[0054] 图7描绘了图6B的模板的序列，其中RNA TALENTM被设计为结合DNA的20bp区，并且其中标记“X(02)X”、“X(03)X”等等的区代表可以被选择以靶向具体DNA序列的重复可变结构域(RVD)。这个模板编码RNA TALENTM，其中不考虑RVD，被RNA TALENTM结合的第一残基为胸苷残基，并且因此第一RVD标记为“X(02)X”而不是“X(01)X”。

[0055] 图8描绘了基因编辑和重新编程的原代人成纤维细胞。箭头指明具有重新编程形态的细胞集落。

[0056] 图9A描绘了可以自动或半自动方式转染和/或重新编程细胞的系统的正视图。

[0057] 图9B描绘了图9A的系统的后面板。

[0058] 图9C描绘了图9A的系统的主要组件。

[0059] 图10A描绘了复合培养基内的RNA和转染试剂的复合。

[0060] 图10B描绘了用于分配含有核酸的预先复合的沉淀的两种方法。

[0061] 图10C描绘了用于使用抽吸器使盖子从孔板上去除的方法。

[0062] 图10D描绘了用于使用夹子使盖子从孔板上去除的方法。

[0063] 图11描绘了可以自动或半自动方式与用于成像、孵育和以另外的方式操控细胞的仪器可操作组合转染和/或重新编程细胞的系统。

[0064] 定义

[0065] “分子”意指分子实体(分子、离子、复合物等)。

[0066] “蛋白质”意指多肽。

[0067] “RNA分子”意指包含RNA的分子。

[0068] “合成RNA分子”意指使用生物工程在细胞外部产生的RNA分子或在细胞内部产生的RNA分子，例如在体外转录反应中产生的RNA分子、通过直接化学合成产生的RNA分子或在基因工程化的大肠杆菌(E.coli)细胞中产生的RNA分子。

[0069] “核苷酸”意指核苷酸或其片段或衍生物，例如核碱基、核苷、核苷酸-三磷酸等。

[0070] “核苷”意指核苷酸。

[0071] “转染”意指使细胞与分子接触，其中分子被细胞内化。

[0072] “转染时”意指转染期间或之后。

[0073] “转染试剂”意指与分子缔合并且促进分子递送至细胞和/或通过细胞内化分子的物质或多种物质的混合物，例如阳离子脂质、带电聚合物或细胞穿透肽。

[0074] “基于试剂的转染”意指使用转染试剂转染。

[0075] “细胞培养基”意指可以用于细胞培养的培养基，例如杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)或DMEM+10％胎牛血清(FBS)。

[0076] “复合培养基”意指向其中添加转染试剂和待转染的分子的培养基，并且其中转染试剂与待转染的分子缔合。

[0077] “转染培养基”意指可以用于转染的培养基，例如杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(DMEM)或DMEM/F12。

[0078] “重组蛋白”意指不是在动物或人中产生的蛋白质或肽。非限制性的实例包括在细菌中产生的人转铁蛋白，在小鼠细胞的体外培养物中产生的人纤连蛋白以及在稻米植物中产生的人血清白蛋白。

[0079] “脂质载体”意指可以使脂质或脂溶性分子在水溶液中的溶解度增加的物质，例如人血清白蛋白或甲基-β-环糊精。

[0080] “Oct4蛋白”意指由POU5F1基因编码的蛋白质或其天然或工程化的变体、家族成员、直系同源基因、片段或融合构建体，例如人Oct4蛋白(SEQ ID NO:1)、小鼠Oct4蛋白、Oct1蛋白、由POU5F1假基因2编码的蛋白质、Oct4蛋白的DNA结合结构域或Oct4-GFP融合 蛋白。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。在其它实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。

[0081] “Sox2蛋白”意指由SOX2基因编码的蛋白质或其天然或工程化的变体、家族成员、直系同源基因、片段或融合构建体，例如人Sox2蛋白(SEQ ID NO:2)、小鼠Sox2蛋白、Sox2蛋白的DNA结合结构域或Sox2-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、
90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:2具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。在其它实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:2具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。

[0082] “Klf4蛋白”意指由KLF4基因编码的蛋白质或其天然或工程化的变体、家族成员、直系同源基因、片段或融合构建体，例如人Klf4蛋白(SEQ ID NO:3)、小鼠Klf4蛋白、Klf4蛋白的DNA结合结构域或Klf4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、
90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:3具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。在其它实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:3具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。

[0083] “c-Myc蛋白”意指由MYC基因编码的蛋白质或其天然或工程化的变体、家族成员、直系同源基因、片段或融合构建体，例如人c-Myc 蛋白(SEQ ID NO:4)、小鼠c-Myc蛋白、1-Myc蛋白、c-Myc(T58A)蛋白、c-Myc蛋白的DNA结合结构域或c-Myc-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性，或在其它实施方案中与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:4具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸。在其它实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:4具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总起来说)的氨基酸序列。

[0084] “重新编程”意指引起细胞的表型变化，例如引起β-细胞祖先分化为成熟β-细胞，引起成纤维细胞去分化为多能干细胞，引起角质化细胞转分化为心脏干细胞或引起神经元的轴突生长。

[0085] “重新编程因子”意指当细胞与分子接触和/或细胞表达分子时，可以单独或与其它分子组合引起重新编程的分子，例如Oct4蛋白。

[0086] “供给者”意指可以用来调节培养基或以另外的方式支持培养的其它细胞的生长的细胞。

[0087] “调节”意指使一个或多个供给者与培养基接触。

[0088] “脂肪酸”意指包含具有至少两个碳原子的脂肪链的分子，例如亚油酸、α-亚麻酸、辛酸、白三烯、前列腺素、胆固醇、糖皮质激素、消退素、保护素、血栓烷、脂氧素、maresin、鞘脂、色氨酸、N-乙酰基色氨酸或其盐、甲酯或衍生物。

[0089] “短链脂肪酸”意指包含具有2个与30个之间碳原子的脂肪链的脂肪酸。

[0090] “白蛋白”意指在水中高度溶解的蛋白质，例如人血清白蛋白。

[0091] “缔合分子”意指与另一个分子非共价结合的分子。

[0092] “白蛋白的缔合分子组分”意指结合白蛋白多肽的一种或多种分子，例如结合白蛋白多肽的脂质、激素、胆固醇、钙离子等。

[0093] “处理过的白蛋白”意指经处理以减少、去除、替换或以另外的方式灭活白蛋白的缔合分子组分的白蛋白，例如在升高的温度下孵育的 人血清白蛋白、与辛酸钠接触的人血清白蛋白或与多孔材料接触的人血清白蛋白。

[0094] “离子交换树脂”意指当与含有离子的溶液接触时可以用一个或多个不同的离子替换一个或多个离子的材料，例如可以用一个或多个钠离子替换一个或多个钙离子的材料。

[0095] “生殖细胞”意指精细胞或卵细胞。

[0096] “多能干细胞”意指在体内可以分化成具有所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的细胞。

[0097] “体细胞”意指不是多能干细胞或生殖细胞的细胞，例如皮肤细胞。

[0098] “葡萄糖反应性胰岛素产生细胞”意指当暴露于某一浓度的葡萄糖时可以产生和/或分泌不同于(小于或大于)当细胞暴露于不同浓度的葡萄糖时细胞产生和/或分泌的胰岛素的量的一定量的胰岛素的细胞，例如β-细胞。

[0099] “造血细胞”意指血细胞或可以分化成血细胞的细胞，例如造血干细胞或白细胞。

[0100] “心脏细胞”意指心脏细胞或可以分化成心脏细胞的细胞，例如心脏干细胞或心肌细胞。

[0101] “视网膜细胞”意指视网膜的细胞或可以分化成视网膜的细胞的细胞，例如视网膜色素上皮细胞。

[0102] “皮肤细胞”意指常见于皮肤中的细胞，例如成纤维细胞、角质化细胞、黑素细胞、脂肪细胞、间质干细胞、脂肪干细胞或血细胞。

[0103] “Wnt信号传导激动剂”意指可以进行蛋白质的Wnt家族的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，例如Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。

[0104] “IL-6信号传导激动剂”意指可以进行IL-6蛋白的一种或多种生物功能的分子，例如IL-6蛋白或IL-6受体(又称为可溶的IL-6受体、IL-6R、IL-6Rα等)。

[0105] “TGF-β信号传导激动剂”意指可以进行蛋白质的TGF-β超家族 的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，例如TGF-β1、TGF-β3、活化素A、BMP-4或Nodal。

[0106] “免疫抑制剂”意指可以阻抑免疫系统的一个或多个方面的物质，但所述物质通常不存在于哺乳动物中，例如B18R或地塞米松(dexamethasone)。

[0107] “基因编辑”意指改变细胞的DNA序列。

[0108] “基因编辑蛋白”意指可以单独或与另一个分子组合改变细胞的DNA序列的蛋白质，例如核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、大范围核酸酶、切口酶或其天然或工程化的变体、家族成员、直系同源基因、片段或融合构建体。

[0109] “单链断裂”意指其中连接核苷酸的一个或多个共价键在一个或两个链之一中断裂的单链或双链DNA的区。

[0110] “双链断裂”意指其中连接核苷酸的一个或多个共价键在两个链的每个链中断裂的双链DNA的区。

[0111] 血清白蛋白是无血清细胞培养基的常见组分。现已经发现血清白蛋白可以抑制转染，并且在转染培养基中包括处于通常用于无血清细胞培养基的浓度下的未处理的血清白蛋白可以在转染时导致低转染效率和/或低细胞存活力。血清白蛋白多肽可以在体外和体内结合各种各样的分子，包括脂质、离子、胆固醇等，并且因此，从血液和重组血清白蛋白中分离的血清白蛋白包含多肽组分和缔合分子组分。现已经发现当转染时由血清白蛋白引起的低转染效率和低细胞存活力可以部分地由血清白蛋白的缔合分子组分引起。进一步发现可以通过部分或完全减少、去除、替换或以另外的方式灭活血清白蛋白的缔合分子组分来增加转染效率并且可以减少转染相关的毒性。因此，本发明的某些实施方案涉及用于处理蛋白质以部分或完全减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分的方法。其它实施方案涉及被处理以部分或完全减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分的蛋白质。

[0112] 某些实施方案涉及用于通过使蛋白质与减少当转染时由蛋白质引 起的低转染效率和/或低细胞存活力的一种或多种分子接触来处理蛋白质的方法。发现使血清白蛋白与短链脂肪酸、辛酸钠(又称为“辛酸(octanoic acid)”、“辛酸酯”、“辛酸盐”或“辛酸(caprylic acid)”)接触可减少在某些情况下当转染时由血清白蛋白引起的低转染效率和低细胞存活力。可以用来处理蛋白质的其它物质包括：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、蜡酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、色氨酸、N-乙酰基色氨酸、胆固醇、其它脂肪酸以及其盐、混合物、片段和衍生物。用于处理蛋白质的物质可以是纯物质、明确定义的混合物或复合物或未定义的混合物，如基于动物或基于植物的油，例如鱼肝油。在某些实施方案中，在蛋白质被纯化之后处理蛋白质。在其它实施方案中，在蛋白质被纯化之前处理蛋白质。在还其它的实施方案中，在蛋白质被纯化的同时处理蛋白质。在还其它的实施方案中，处理蛋白质并且不纯化蛋白质。

[0113] 在升高的温度下孵育蛋白质可以引起蛋白质的多肽组分部分或完全变性，这可以减少或消除可能是对维持蛋白质的缔合分子组分关键的结合位点。因此，某些实施方案涉及用于通过在升高的温度下孵育蛋白质来处理蛋白质的方法。在一个实施方案中，在至少约40℃的温度下孵育蛋白质至少约10分钟。在另一个实施方案中，在至少约50℃的温度下孵育蛋白质至少约10分钟。在另一个实施方案中，在至少约55℃的温度下孵育蛋白质至少约30分钟。在一个实施方案中，使蛋白质与辛酸钠接触并且然后在约60℃下孵育若干小时，如约1小时与约24小时之间或约2小时与约6小时之间。在另一个实施方案中，辛酸钠的浓度为约5mM与约50mM之间或约10mM与约40mM之间。在某些实施方案中，辛酸钠可以被以下的至少一种元素(element)替换或与以下的至少一种元素组合使用：癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、蜡酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、 α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、色氨酸、N-乙酰基色氨酸以及胆固醇或其盐、混合物、片段和衍生物。

[0114] 糖化和糖基化是通过其使一个或多个糖分子结合蛋白质的方法。糖化和糖基化可以影响蛋白质的结合性质，并且血清白蛋白含有若干个潜在的糖化部位。因此，某些实施方案涉及用于通过使蛋白质糖化或糖基化来处理蛋白质的方法。

[0115] 离子交换树脂(包括阴离子交换树脂、阳离子交换树脂和混合床树脂)通常用来使溶液去离子化。蛋白质(如血清白蛋白)的缔合分子组分可以包含离子。因此，某些实施方案涉及用于通过使蛋白质与一种或多种离子交换树脂接触来处理蛋白质的方法。在一个实施方案中，一种或多种离子交换树脂包括含有具有质子(H+)和羟基(OH-)形式的官能团的混合床树脂。在另一个实施方案中，一种或多种离子交换树脂包括当树脂变为与离子饱和时改变颜色的指示剂。除了与一种或多种离子交换树脂接触之外，其它方法可以用来减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分，包括使蛋白质与木炭接触，所述木炭可以被活化和/或用化学品(如硫酸葡聚糖)处理；透析(包括导致缔合分子组分解缔合的稀释，无论解缔合的分子随后是否从溶液中去除)；结晶；色谱法；电泳；热处理；低温处理；高pH处理；低pH处理；有机溶剂沉淀以及亲和纯化。

[0116] 用于处理蛋白质的某些方法可以优选地减少、去除、替换或以另外的方式灭活具体类型的分子。在某些情况下，组合两种或更多种用于处理蛋白质以减少当转染时由蛋白质引起的低转染效率和/或低细胞存活力的方法因此可以是有益的。因此，某些实施方案涉及用于使用两种或更多种方法以减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分来处理蛋白质的方法。在一个实施方案中，使蛋白质与一种或多种离子交换树脂和活性炭接触。在另一个实施方案中，使蛋白质与辛酸钠接触、在升高的温度下孵育、与一种或多种离子交换树脂接触以及与活性炭接触。在另一个实施方案中，蛋白质为血清白蛋白，并且升高的温度为至少约50℃。

[0117] 蛋白质的缔合分子组分的某些元素可以有益于培养的细胞和/或转染，例如某些消退素、保护素、脂氧素、maresin、类花生酸、前列环素、血栓烷、白三烯、环戊烯酮前列腺素以及糖皮质激素。因此，某些实施方案涉及用于处理蛋白质以减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分而没有减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分的一种或多种有益元素的方法。其它实施方案涉及用于处理蛋白质以减少、去除、替换或以另外的方式灭活蛋白质的缔合分子组分，并且进一步使蛋白质与一个或多个包含蛋白质的缔合分子组分的一种或多种有益元素的分子接触的方法。

[0118] 还其它的实施方案涉及用于通过使蛋白质与一个或多个包含蛋白质的缔合分子组分的一种或多种有益元素的分子接触来处理蛋白质以减少当转染时由蛋白质引起的低转染效率和/或低细胞存活力的方法。还其它的实施方案涉及用于通过使细胞与一个或多个包含蛋白质的缔合分子组分的一种或多种有益元素的分子接触来在转染时增加转染效率和/或增加细胞存活力的方法。在一个实施方案中，使蛋白质与一种或多种离子交换树脂或木炭接触，并且进一步使其与糖皮质激素接触，如氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、地塞米松或倍他米松(betamethasone)。在另一个实施方案中，使细胞与糖皮质激素接触，如氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、地塞米松或倍他米松。已经进一步发现在某些情况下，在转染培养基中包括一种或多种类固醇和/或一种或多种抗氧化剂可以增加转染效率、重新编程效率和基因编辑效率。因此，某些实施方案涉及用于通过在含有类固醇的培养基中培养细胞并且使细胞与一个或多个合成RNA分子接触来诱导细胞表达感兴趣的蛋白质的方法。在一个实施方案中，类固醇为氢化可的松。在另一个实施方案中，氢化可的松以约0.1uM与约10uM之间或约1uM的浓度存在于培养基中。其它实施方案涉及用于通过在含有抗氧化剂的培养基中培养细胞并且使细胞与一个或多个合成RNA分子接触来诱导细胞表达感兴趣的蛋白质的方法。在一个实施方案中，抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸盐。在另一个实 施方案中，抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸盐以约0.5mg/L与约500mg/L之间(包括约50mg/L)的浓度存在于培养基中。还其它的实施方案涉及用于通过在含有类固醇和/或抗氧化剂的培养基中培养细胞并且使细胞与一个或多个合成RNA分子接触来重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中一个或多个合成RNA分子编码一种或多种重新编程蛋白和/或基因编辑蛋白。在某些实施方案中，细胞存在于生物体中，并且将类固醇和/或抗氧化剂递送至生物体。

[0119] 已经报道了在某些情况下将转铁蛋白添加至复合培养基中来增加质粒转染的效率。现已经发现，将转铁蛋白添加至复合培养基中还可以增加用合成RNA分子转染的效率。因此，某些实施方案涉及用于通过将一个或多个合成RNA分子和转染试剂添加至含有转铁蛋白的溶液中来诱导细胞表达感兴趣的蛋白质的方法。在一个实施方案中，转铁蛋白以约
1mg/L与约100mg/L之间(如约5mg/L)的浓度存在于溶液中。在另一个实施方案中，转铁蛋白为重组的。

[0120] 其它实施方案涉及含有根据本发明的一种或多种方法处理的蛋白质的培养基。在某些实施方案中，在与培养基的一种或多种其它成分混合之前处理蛋白质。在一个实施方案中，培养基为转染培养基。在另一个实施方案中，培养基还支持有效的转染和高细胞存活力。在某些实施方案中，将蛋白质和减少当转染时由蛋白质引起的低转染效率和/或低细胞存活力的一个或多个分子独立地添加至培养基中。在一个实施方案中，在与培养基的一种或多种其它成分混合之前处理蛋白质。在另一个实施方案中，通过首先由使血清白蛋白的浓缩溶液与一种或多种离子交换树脂接触，然后使一种或多种离子交换树脂从血清白蛋白的浓缩溶液中去除来处理血清白蛋白的浓缩溶液，并且然后将处理过的血清白蛋白的浓缩溶液添加至培养基的其它组分中来制备培养基。在另一个实施方案中，在将血清白蛋白的浓缩溶液添加至培养基的其它组分之前使血清白蛋白的浓缩溶液进一步与木炭接触。在还另一个实施方案中，首先使血清白蛋白的浓缩溶液与辛酸钠接触，然后升高到至少约50℃的温度持续至少约10分钟，然后与一种或多种离 子交换树脂接触，然后与活性炭接触，并且然后添加至培养基的其它组分中。

[0121] 现已经发现，使用含有缓冲的盐溶液、氨基酸、胆固醇、氢化可的松以及血清白蛋白的培养基转染细胞可以产生有效的转染，并且使用基本上由缓冲的盐溶液、氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、氢化可的松、血清白蛋白以及成纤维细胞生长因子组成的培养基转染细胞可以产生有效的转染和有效的重新编程。因此，某些实施方案涉及含有以下的转染培养基：缓冲的盐溶液、氨基酸、胆固醇、氢化可的松以及血清白蛋白。其它实施方案涉及基本上由以下组成和/或包含以下的转染培养基：缓冲的盐溶液、氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、氢化可的松、血清白蛋白以及成纤维细胞生长因子。还其它的实施方案涉及基本上由以下组成和/或包含以下的重新编程培养基：缓冲的盐溶液、氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、氢化可的松、血清白蛋白以及成纤维细胞生长因子。在一个实施方案中，培养基还包括聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和/或D-α-生育酚乙酸酯。在另一个实施方案中，培养基还包括例如约1mg/L与约100mg/L之间的浓度的抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸酯。在一个实施方案中，氢化可的松以约1uM的浓度存在。在另一个实施方案中，成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，并且碱性成纤维细胞生长因子以约1ng/mL与约200ng/mL之间，如约4ng/mL与约100ng/mL之间、或约10ng/mL与约50ng/mL之间或约20ng/mL的浓度存在。在一个实施方案中，血清白蛋白为人血清白蛋白，并且人血清白蛋白以约0.05％与约2％之间，包括约0.1％与约1％之间，如约0.5％的浓度存在。在另一个实施方案中，人血清白蛋白为重组的。在又另一个实施方案中，胆固醇以约4.5mg/L的浓度存在。在一个实施方案中，培养基不含有任何动物来源的组分。在另一个实施方案中，培养基不含有任何未定义的组分，例如鱼肝油脂肪酸或血清。在一个实施方案中，培养基含有TGF-β抑制剂，例如A83-01或SB431542。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂以约0.1uM与约10uM之间的浓度存在。在一个实施方案中， 培养基含有Wnt信号传导激动剂，如Wnt3a。在另一个实施方案中，Wnt信号传导激动剂以约10ng/mL与约500ng/mL之间，包括约50ng/mL与约200ng/mL之间的浓度存在。在一个实施方案中，培养基含有硒来源，如亚硒酸钠。

[0122] 在某些情况下，用非动物来源和/或重组组分替换动物来源的组分可以是可取的，部分因为非动物来源和/或重组组分可以产生具有比动物来源的组分更高程度的一致性，并且部分因为非动物来源和/或重组组分携带比动物来源的组分更少的被毒性物质和/或致病物质污染的危险。因此，某些实施方案涉及为非动物来源和/或重组的蛋白质。其它实施方案涉及培养基，其中培养基的一些或所有组分为非动物来源和/或重组的。在一个实施方案中，蛋白质为重组血清白蛋白。在另一个实施方案中，蛋白质为重组人血清白蛋白。在又另一个实施方案中，蛋白质为重组血清白蛋白并且培养基的所有组分为非动物来源和/或重组的。

[0123] 血清白蛋白的N-末端可以含有镍结合结构域和铜结合结构域，所述镍结合结构域和铜结合结构域可以是重要的抗原决定子。使天冬氨酸残基从血清白蛋白的N-末端上缺失可以消除血清白蛋白的镍结合活性和铜结合活性，并且可以产生蛋白质的低过敏原性变体。因此，某些实施方案涉及具有改良的结合特征和/或其它可取的特征如低过敏原性的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质为血清白蛋白，并且血清白蛋白缺乏N-末端天冬氨酸。

[0124] 其它实施方案涉及用于转染细胞的方法。在一个实施方案中，用一种或多种核酸转染细胞，并且使用转染试剂(如基于脂质的转染试剂)进行转染。在一个实施方案中，一种或多种核酸包括至少一个RNA分子。在另一个的实施方案中，用一种或多种核酸转染细胞，并且一种或多种核酸编码以下的至少一种：p53、TERT、细胞因子、分泌蛋白、膜结合蛋白、酶、基因编辑蛋白、染色质修饰蛋白、DNA结合蛋白、转录因子、组蛋白脱乙酰酶、病原相关分子模式以及肿瘤相关抗原或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员。在另一个实施方案 中，重复地转染细胞，如在连续约10天期间至少约2次，或在连续约7天期间至少约3次，或在连续约6天期间至少约4次。

[0125] 可以通过用编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸转染细胞，并且在支持重新编程细胞的培养基中培养细胞来进行重新编程。重新编程因子的实例包括但不限于：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、1-Myc蛋白、TERT蛋白、Nanog蛋白、Lin28蛋白、Utf1蛋白、Aicda蛋白、miR200微小RNA、miR302微小RNA、miR367微小RNA、miR369微小RNA以及其生物活性片段、类似物、变体和家族成员。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法。在一个实施方案中，通过用编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸转染细胞来重新编程细胞。在一个实施方案中，一种或多种核酸包括编码Oct4蛋白的RNA分子。在另一个实施方案中，一种或多种核酸还包括编码Sox2蛋白、Klf4蛋白和c-Myc蛋白的一个或多个RNA分子。在又另一个实施方案中，一种或多种核酸还包括编码Lin28蛋白的RNA分子。在一个实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且人皮肤细胞被重新编程为多能干细胞。在另一个实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且人皮肤细胞被重新编程为葡萄糖反应性胰岛素产生细胞。可以被重新编程的其它细胞和细胞可以被重新编程为其它细胞的其它细胞的实例包括但不限于：皮肤细胞、多能干细胞、间质干细胞、β-细胞、视网膜色素上皮细胞、造血细胞、心脏细胞、气道上皮细胞、神经干细胞、神经元、神经胶质细胞、骨细胞、血细胞以及牙髓干细胞。在一个实施方案中，在支持重新编程细胞的培养基中培养细胞。在一个实施方案中，培养基还支持细胞。

[0126] 重要地，已经报道了用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒感染皮肤细胞、组合在支持心肌细胞生长的培养基中培养细胞可引起皮肤细胞重新编程为心肌细胞，而没有首先将皮肤细胞重新编程为多能干细胞(参见Efs等Nat Cell Biol.2011；13:215-22，所述参考文献的内容特此以引用的方式并入)。在某些情况下，例如当产生个性化治疗剂时，直接重新编程(重新编程一种体细胞为另一种体细胞而没有首先 重新编程体细胞为多能干细胞，又称为“转分化”)可以是可取的，部分因为培养多能干细胞会是耗时和昂贵的，在建立和表征稳定的多能干细胞系中所涉及的额外处理可以携带增加的污染危险，并且与首先产生多能干细胞相关的培养中的额外时间可以携带增加的基因组不稳定性和获得突变的危险，包括点突变、拷贝数变化以及核型异常。因此，某些实施方案涉及用于重新编辑体细胞的方法，其中细胞被重新编程为体细胞，并且其中不产生被表征的多能干细胞系。

[0127] 用于通过用编码重新编程因子的RNA转染它们来重新编程细胞的先前报道的方法要求使用供给者。在许多情况下，供给者的使用可能不是可取的，部分因为供给者可能来源于动物或异源，并且可能因此携带免疫原性和被病原体污染的危险。现已经发现，本发明的培养基可以使不具有供给者的RNA重新编程实现。进一步发现根据本发明的方法重新编程细胞可以是快速、有效和可靠的，其中使细胞不与供给者接触。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中使细胞不与供给者接触。

[0128] 现已经发现，当根据本发明的方法重新编程细胞时，重新编程效率可以与起始细胞密度相关。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中以约100个细胞/cm22 2
与约100,000个细胞/cm之间的密度铺放细胞。在一个实施方案中，以约100个细胞/cm 与约
10,000个细胞/cm2之间或约2000个细胞/cm2与约20,000个细胞/cm2之间或约1000个细胞/cm2与约2000个细胞/cm2之间的密度铺放细胞。

[0129] 进一步发现在某些情况下，根据本发明的方法重新编程细胞可以比根据其它方法要求更少的总转染。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中在连续约20天期间进行约2次与约12次之间的转染，或在连续约15天期间进行约4次与约10次之间的转染，或在连续约10天期间进行约4次与约8次之间的转染。认识到当将核酸添加至其中培养细胞的培养基中时，细胞很可能会与多于一个核酸分子同时或在不同时间下接触和/或内化。因此，细胞可以与核酸接触多于一次，例如重复地，甚至当仅一次将核酸添加至其中培养细胞的 培养基中时。

[0130] 供给者可以通过分泌分子如结合表面的胶原(“细胞粘附分子”)来促进细胞粘附至表面。细胞表面上的蛋白质(包括整联蛋白)可以结合这些细胞粘附分子，这可以产生粘附至表面的细胞。现已经发现，可以通过用一个或多个细胞粘附分子涂布表面来重新编程细胞，包括不具有供给者。进一步发现了细胞粘附分子纤连蛋白和玻连蛋白特别适用于这种目的。因此，某些实施方案涉及用于转染、重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中使细胞与接触一个或多个细胞粘附分子的表面接触。在一个实施方案中，一个或多个细胞粘附分子包括以下的至少一种：聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、RGD肽、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原以及层粘连蛋白或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员。在另一个实施方案中，一个或多个细胞粘附分子为纤连蛋白或其生物活性片段。在又另一个实施方案中，纤连蛋白为重组的。在还另一个实施方案中，一个或多个细胞粘附分子为纤连蛋白和玻连蛋白或其生物活性片段的混合物。在另一个实施方案中，纤连蛋白和玻连蛋白各以约100ng/cm2的浓度存在于表面上和/或以约1ug/mL的浓度存在于用来涂布表面的溶液中。在又另一个实施方案中，纤连蛋白和玻连蛋白均是重组的。使表面与一个或多个细胞粘附分子接触可以作为独立步骤进行和/或通过将一个或多个细胞粘附分子包括在培养基中。

[0131] 值得注意的是，核酸可以含有一个或多个非规范或“修饰的”残基(例如除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及胞嘧啶以外的残基或其标准核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸衍生物)。特别值得注意的是，假尿苷-5'-三磷酸可以在体外转录反应中取代尿苷-5'-三磷酸以产生合成RNA，其中合成RNA的高达至100％的尿苷残基可以被假尿苷残基替换。体外转录可以产生具有残留免疫原性的RNA，甚至当假尿苷和5-甲基胞苷分别完全取代尿苷和胞苷时(参见Angel Reprogramming Human Somatic Cells to Pluripotency Using RNA[Doctoral Thesis].Cambridge,MA:MIT；2011，所述参考文献的内容特此以引用的方式并入)。出于这个原因，当用RNA转染细胞时，将 免疫抑制剂添加至转染培养基中是常见的。在某些情况下，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可能不是可取的，部分因为最常见用于这个目的的重组免疫抑制剂B18R会是昂贵的并且难以制造。现已经发现，可以根据本发明的方法而不使用B18R或任何其它免疫抑制剂转染和/或重新编程细胞。进一步发现了根据本发明的方法不使用免疫抑制剂重新编程细胞可以是快速、有效和可靠的。因此，某些实施方案涉及用于转染细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。其它实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中转染培养基不含有免疫抑制剂。在某些情况下，例如当使用高细胞密度时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可以是有益的。因此，某些实施方案涉及用于转染细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。其它实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。在一个实施方案中，免疫抑制剂为B18R或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员或地塞米松或其衍生物。在一个实施方案中，以小于约20,000个细胞/cm2的密度铺放细胞，并且转染培养基不含有免疫抑制剂。在另一个实施方案中，转染培养基不含有免疫抑制剂，并且选择核酸剂量以防止过量毒性。在还另一个实施方案中，核酸剂量为6孔板的小于2μg/孔，如6孔板的约0.25μg/孔或6孔板的约1μg/孔。

[0132] 根据本发明的某些实施方案产生的重新编程细胞适合用于治疗应用，包括当它们不含有外源DNA序列时移植到患者中，并且它们不暴露于动物来源或人来源的产品中，所述产品可以是未定义的，并且所述产品可以含有毒性污染物和/或致病污染物。此外，本发明的某些实施方案的高速度、效率和可靠性可以减少获得和积累突变和其它染色体异常的危险。本发明的某些实施方案可以因此用来产生具有适合在治疗应用中使用的安全性特征的细胞。例如，使用本发明的RNA和培养基重新编程细胞(其中培养基不含有动物来源或人来源的组分)可以产生尚未曝露于异源材料的细胞。因此，某些实施方案涉及具有可取的安全性特征的重新编程细胞。在一个实施方案中，重新编程细胞具有正常核型。在另一个实施方案中，相对于患者基因组，重新编 程细胞具有小于约5个拷贝数变化(CNV)，如相对于患者基因组小于约3个拷贝数变化，或相对于患者基因组没有拷贝数变化。在又另一个实施方案中，相对于患者基因组，重新编程细胞在编码区具有正常核型和小于约100个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区中具有小于约50个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区中具有小于约10个单核苷酸变体。

[0133] 内毒素和核酸酶可以共同纯化和/或变为与其它蛋白质(如血清白蛋白)缔合。具体来说重组蛋白可以经常具有高水平的缔合内毒素和核酸酶，部分由于在它们的产生过程中发生的细胞溶解。可以通过本发明的许多方法减少、去除、替换或以另外的方式灭活内毒素和核酸酶，所述方法包括例如通过乙酰化；通过添加稳定剂如辛酸钠，接着通过热处理；通过将核酸酶抑制剂添加至白蛋白溶液和/或培养基中；通过结晶；通过与一种或多种离子交换树脂接触；通过与木炭接触；通过制备型电泳或通过亲和色谱法。现已经发现，使内毒素和/或核酸酶从培养基和/或从培养基的一种或多种组分中部分或完全减少、去除、替换或以另外的方式灭活可以增加针对可以被转染和重新编程的细胞的效率。因此，某些实施方案涉及用于使用一种或多种核酸转染细胞的方法，其中处理转染培养基以部分或完全减少、去除、替换或以另外的方式灭活一种或多种内毒素和/或核酸酶。其它实施方案涉及引起核酸最小程度降解的培养基。在一个实施方案中，培养基含有小于约1EU/mL、或小于约
0.1EU/mL或小于约0.01EU/mL。

[0134] 在某些情况下，基于蛋白质的脂质载体如血清白蛋白可以被基于非蛋白质的脂质载体如甲基-β-环糊精替换。本发明的培养基还可以在没有脂质载体的情况下使用，例如当使用可以不要求或可以不获益于脂质载体存在的方法，例如使用一种或多种基于聚合物的转染试剂或基于肽的转染试剂进行转染时。

[0135] 许多蛋白质缔合分子(如金属)可以是对细胞高度毒性的。这种毒性可以引起培养的存活力降低以及获得突变。因此，某些实施方案具有产生不含毒性分子的细胞的额外益处。

[0136] 可以通过将蛋白质悬浮在溶液中并且测量溶液的电导率来测量蛋白质的缔合分子组分。因此，某些实施方案涉及含有蛋白质的培养基，其中10％的蛋白质水溶液的电导率为小于约500μmhο/cm。在一个实施方案中，溶液的电导率为小于约50μmhο/cm。

[0137] 低氧环境可以有益于许多类型的细胞的培养。因此，某些实施方案涉及用于培养、转染、重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中在低氧环境中培养、转染、重新编程和/或基因编辑细胞。在一个实施方案中，低氧环境含有约2％与约10％之间的氧气、或约4％与约6％之间的氧气。

[0138] 可以增加递送至细胞的核酸的量以增加核酸的希望的作用。然而，增加递送至细胞的核酸的量超过某一点会引起细胞的存活力降低，部分由于转染试剂的毒性。现已经发现，当将核酸递送至处于固定体积的一群细胞(例如，处于组织的区中的细胞或生长在细胞培养容器中的细胞)时，递送至各细胞的核酸的量可以取决于递送至细胞群的核酸的总量和细胞的密度，其中更高的细胞密度导致递送至各细胞的核酸更少。在某些实施方案中，使用一种或多种核酸转染细胞多于一次。在某些条件下，例如当细胞正在增殖时，细胞密度可能在一次转染至下一次转染之间变化。因此，某些实施方案涉及用于使用核酸转染细胞的方法，其中转染细胞多于一次，并且其中对于两次转染而言递送至细胞的核酸的量不同。在一个实施方案中，细胞在两次转染之间增殖，并且对于两次转染的第二次而言递送至细胞的核酸的量比对于两次转染的第一次而言更大。在另一个实施方案中，转染细胞多于两次，并且对于三次转染的第二次而言递送至细胞的核酸的量比对于相同的三次转染的第一次而言更大，并且对于相同的三次转染的第三次而言递送至细胞的核酸的量比对于相同的三次转染的第二次而言更大。在又另一个实施方案中，转染细胞多于一次，并且对于至少两次连续的转染而言，在每次转染过程中递送至细胞的核酸的最大量足够低以产生至少约80％存活力。

[0139] 现已经发现，调节一系列转染中的递送至一群增殖细胞的核酸的 量可以导致核酸的作用增加和细胞的存活力增加。进一步发现在某些情况下，当在一系列转染中使细胞与编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸接触时，重新编码的效率可以对于一系列转染的至少部分而言当在后面的转染中递送的核酸的量大于在前面的转染中递送的核酸的量时有所增加。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中在一系列转染中将一种或多种核酸重复地递送至细胞，并且对于至少一次后面的转染而言递送至细胞的核酸的量比对于至少一次前面的转染而言更大。在一个实施方案中，转染细胞约2次与约10次之间，或约3次与约8次之间，或约4次与约6次之间。在另一个实施方案中，一种或多种核酸包括至少一个RNA分子，转染细胞约2次与约10次之间，并且在每次转染中递送至细胞的核酸的量与先前最近转染中递送至细胞的核酸的量相同或比其更大。在又另一个实施方案中，在第一次转染中递送至细胞的核酸的量为约20ng/cm2与约250ng/cm2、或100ng/cm2与600ng/cm2之间。在又另一个实施方案中，在约12小时与约48小时之间的间隔下转染细胞约
5次，并且对于第一次转染而言递送至细胞的核酸的量为约25ng/cm2，对于第二次转染而言
2 2 2
约50ng/cm ，对于第三次转染而言约100ng/cm ，对于第四次转染而言约200ng/cm ，并且对于第五次转染而言约400ng/cm2。在又另一个实施方案中，在第五次转染之后进一步转染细胞至少一次，并且递送至细胞的核酸的量为约400ng/cm2。

[0140] 某些实施方案涉及用于使用核酸转染细胞的方法，其中通过测量细胞密度并且基于细胞密度的测量选择核酸的量来转染而确定核酸的量。在一个实施方案中，细胞存在于体外培养物中，并且通过光学装置测量细胞密度。在另一个实施方案中，重复地转染细胞，细胞密度在两次转染之间有所增加，并且对于两次转染的第二次而言转染的核酸的量比对于两次转染的第一次而言更大。

[0141] 现已经发现在某些情况下，在本发明的培养基中培养的细胞的转染效率和存活力可以通过调节培养基来改进。因此，某些实施方案涉及用于调节培养基的方法。其它实施方案涉及被调节的培养基。在一 个实施方案中，供给者为成纤维细胞，并且培养基被调节大约24小时。其它实施方案涉及用于转染细胞的方法，其中转染培养基被调节。其它实施方案涉及用于重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中培养基被调节。在一个实施方案中，有丝分裂灭活供给者，例如通过曝露于化学品如丝裂霉素-C或通过曝露于γ射线。在某些实施方案中，仅使用自体材料以部分地(例如并且不希望受理论约束)避免从供给者至细胞的疾病传播的危险可以是有益的。因此，某些实施方案涉及用于转染细胞的方法，其中转染培养基被调节，并且其中供给者来源于与被转染的细胞相同的个体。其它实施方案涉及用于重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中培养基被调节，并且其中供给者来源于与被重新编程和/或基因编辑的细胞相同的个体。

[0142] 可以通过调节将若干分子添加至培养基中。因此，某些实施方案涉及补充有存在于调节的培养基中的一个或多个分子的培养基。在一个实施方案中，培养基补充有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在另一个实施方案中，培养基补充有TGF-β或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在又另一个实施方案中，根据本发明的方法重新编程细胞，其中培养基没有在约1天与约5天之间补充TGF-β，并且然后在至少约2天补充TGF-β。在又另一个实施方案中，培养基补充有IL-6、IL-6R或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在又另一个实施方案中，培养基补充有鞘脂或脂肪酸。在还另一个实施方案中，鞘脂为溶血磷脂酸、溶血神经鞘氨酯
(lysosphingomyelin)、鞘氨醇-1-磷酸酯或其生物活性类似物、变体或衍生物。

[0143] 除了有丝分裂灭活细胞之外，在某些条件下，辐射可以改变细胞的基因表达，引起细胞产生更少的某些蛋白质和更多的非辐射细胞的某些其它蛋白质，例如蛋白质的Wnt家族的成员。另外，蛋白质的Wnt家族的某些成员可以促进细胞的生长和转化。现已经发现在某些情况下，可以通过使细胞与使用辐射过的供给者代替丝裂霉素-c处理过的供给者调节的培养基接触来极大地增加RNA重新编程的效率。 进一步发现，当使用辐射过的供给者时观察到的重新编程效率的增加部分地由供给者分泌的Wnt蛋白引起。因此，某些实施方案涉及用于重新编程细胞的方法，其中使细胞与Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、家族成员或激动剂接触，包括Wnt蛋白的下游靶标的激动剂和/或模拟Wnt蛋白的一种或多种生物作用的试剂，例如2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。

[0144] 现已经发现本发明的培养基可以用来维持培养的细胞，包括成纤维细胞和人多能干细胞(即，作为“维持培养基”)。因此，某些实施方案涉及用作维持培养基的培养基。在一个实施方案中，培养基不含有任何人来源的组分。在另一个实施方案中，培养基被化学定义。

[0145] 由于许多基于DNA的重新编程方法的低效率，这些方法可能难以或不可能与来源于患者样品的细胞一起使用，所述患者样品可能仅含有少量的细胞。相比之下，本发明的某些实施方案的高效率可以允许从少量的细胞中(包括从单细胞中)进行可靠的重新编程。某些实施方案可以因此用来重新编程来自活组织检查样品的细胞，包括不需要首先建立大型培养。在某些情况下(例如当产生个性化治疗剂时)直接从活组织检查中重新编程细胞可以是可取的，部分因为建立原代细胞的大型培养会可能是耗时的，在建立大型培养中涉及的额外处理可以携带增加的污染危险，并且培养的额外时间可以携带增加的基因组不稳定性和获得突变的危险，包括点突变、拷贝数变化以及核型异常。因此，某些实施方案涉及用于通过首先从患者或从活组织检查样品中收获细胞并且然后重新编程细胞来重新编程细胞的方法。在一个实施方案中，在没有首先建立大型培养的情况下重新编程细胞，优选地在培养物传代多于两次之前进行第一次转染。在另一个实施方案中，从患者中收获细胞，并且在离第一次铺放细胞的时间不多于约14天之后进行第一次转染。在又另一个实施方案中，从活组织检查样品中收获细胞，并且在离第一次铺放细胞的时间不多于约7天之后进行第一次转染。在又另一个实施方案中，活组织检查是全厚度皮穿孔活组织检 查，通过用一种或多种酶处理来从活组织检查样品中收获细胞，将细胞铺放在被一个或多个细胞粘附分子涂布的表面上和/或将细胞铺放在含有细胞粘附分子的培养基中，用包含至少一个RNA分子的一种或多种核酸转染细胞，并且在离第一次铺放细胞的时间不多于约14天之后进行第一次转染。在还另一个实施方案中，酶为胶原酶。在又另一个实施方案中，胶原酶为无动物组分。在另一个实施方案中，胶原酶以约0.1mg/mL与约10mg/mL之间、或约0.5mg/mL与约5mg/mL之间的浓度存在。在又另一个实施方案中，从血液中收获细胞。在又另一个实施方案中，将细胞铺放在含有来源于患者的血液的一种或多种蛋白质的培养基中。在还另一个实施方案中，将细胞铺放在DMEM/F12+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+约5％与约25％之间的患者来源的血清或约10％与约20％之间的患者来源的血清或约20％患者来源的血清中。

[0146] 现已经发现在某些情况下，使用本发明的培养基用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的RNA的混合物转染细胞可以引起细胞的增殖速率增加。当递送至细胞的RNA的量太低而不能确保所有细胞被转染时，仅一部分细胞可以示出增加的增殖速率。在某些情况下，如当产生个性化治疗剂时，增加细胞的增殖速率可以是可取的，部分因为这样做可以减少产生治疗剂所必要的时间，并且因此可以减少治疗剂的成本。因此，某些实施方案涉及用于使用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的RNA的混合物转染细胞的方法，其中细胞展现出增加的增殖速率。在一个实施方案中，从培养物中分离示出增加的增殖速率的细胞。在另一个实施方案中，使示出增加的增殖速率的细胞在支持一种或多种细胞类型的生长的培养基中扩增和培养，并且重新编程为具有所述一种或多种细胞类型之一的细胞。

[0147] 许多疾病与一种或多种突变相关。通过使细胞与编码蛋白质的核酸接触来校正突变，所述蛋白质单独或与其它分子组合校正突变(基因编辑的实例)。此类蛋白质的实例包括：锌指核酸酶和TALEN。因此，某些实施方案涉及用于使用核酸转染细胞的方法，其中核酸编码蛋白 质，所述蛋白质单独或与其它分子组合而在DNA分子中产生单链或双链断裂。在一个实施方案中，蛋白质为锌指核酸酶或TALEN。在另一个实施方案中，核酸为RNA分子。在又另一个实施方案中，单链或双链断裂处于选自以下组的基因的转录起始位点的约5,000,000个碱基内：CCR5、CXCR4、GAD1、GAD2、CFTR、HBA1、HBA2、HBB、HBD、FANCA、XPA、XPB、XPC、ERCC2、POLH、HTT、DMD、SOD1、APOE、PRNP、BRCA1和BRCA2或其类似物、变体或家族成员。在又另一个实施方案中，通过在单链或双链断裂的区中引起DNA序列的插入或通过在单链或双链断裂的区中引起DNA序列以另外方式改变来使用用作修复模板的核酸转染细胞。在又另一个实施方案中，重新编程细胞，并且随后基因编辑细胞。在又另一个实施方案中，基因编辑细胞，并且随后重新编程细胞。在又另一个实施方案中，在彼此约7天之内进行基因编辑和重新编程。在又另一个实施方案中，同时或在同一天发生基因编辑和重新编程。在又另一个实施方案中，细胞为皮肤细胞，皮肤细胞被基因编辑以破坏CCR5基因，皮肤细胞被重新编程为造血干细胞，因此产生用于HIV/AIDS的治疗剂，并且将治疗剂引入到患有HIV/AIDS的患者中。在又另一个实施方案中，皮肤细胞来源于治疗剂被引入其中的相同患者。

[0148] 可以根据本发明的方法编辑以产生本发明的治疗剂的基因包括可以被编辑以恢复正常功能的基因以及可以被编辑以减少或消除功能的基因。此类基因包括，但不限于：β珠蛋白(HBB)，在其中的突变可以引起镰状细胞疾病(SCD)和β-地中海贫血；早发性乳癌1(BRCA1)和早发性乳癌2(BRCA2)，在其中的突变可以增加对乳癌的易感性；C-C趋化因子受体5(CCR5)和C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)，在其中的突变可以赋予HIV感染抗性；囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)，在其中的突变可以引起囊性纤维化；肌营养不良蛋白(DMD)、在其中的突变可以引起肌营养不良(包括假肥大型肌营养不良和贝克氏肌营养不良)；谷氨酸脱羧酶1和谷氨酸脱羧酶2(GAD l、GAD2)，在其中的突变可以防止β-细胞的自身免疫破坏；血红蛋白α1、血红蛋 白α2和血红蛋白δ(HBA1、HBA2和HBD)，在其中的突变可以引起地中海贫血；亨廷顿病(HTT)，在其中的突变可以引起亨廷顿氏病；超氧化物歧化酶1(SOD1)，在其中的突变可以引起肌萎缩性侧索硬化(ALS)；XPA、XPB、XPC、XPD(ERCC6)和聚合酶(DNA指导的),η(POLH)，在其中的突变可以引起着色性干皮病；富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)，在其中的突变可以引起帕金森氏病和范科尼贫血；互补组A、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、P(FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCP)以及RAD51同系物C(酿酒酵母(S.cerevisiae))(RAD51C)，在其中的突变可以引起范科尼贫血。

[0149] 某些实施方案涉及治疗剂，其包含编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸。其它实施方案涉及治疗剂，其包含根据本发明的方法转染、重新编程和/或基因编辑的一个或多个细胞。在一个实施方案中，细胞被转染、重新编程和/或基因编辑，并且转染、重新编程和/或基因编辑的细胞被引入到患者中。在另一个实施方案中，从转染、重新编程和/或基因编辑的细胞被引入其中的相同患者中收获细胞。可以使用本发明的治疗剂治疗的疾病的实例包括，但不限于：阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化、囊性纤维化、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、亨廷顿氏病、糖尿病、镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、着色性干皮病、肌营养不良、重度联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、癌症以及HIV/AIDS。在某些实施方案中，治疗剂包含化妆品。在一个实施方案中，从患者中收获细胞，将细胞重新编程和扩增为大量的脂肪细胞，因此产生化妆品，并且将化妆品引入到患者中。在还另一个实施方案中，化妆品用于组织重建。

[0150] 当本文提供产生具体类型的细胞和产生包含具体类型的细胞的治疗剂的详细实例时，应该认识到本发明的方法可以例如通过根据本发明的方法重新编程细胞并且通过提供与形成期间存在于细胞微环境中 的条件类似的条件在模拟形成的一个或多个方面的条件下培养细胞而用来产生许多其它类型的细胞和产生包含一种或多种许多其它类型的细胞的治疗剂。

[0151] 某些实施方案涉及具有各种各样人白细胞抗原(HLA)类型的细胞文库(“HLA-匹配的文库”)。HLA-匹配的文库可以是有益的，部分因为它可以提供快速产生和/或分布治疗剂而不会使患者必须等待待从患者的细胞中产生的治疗剂。这样一种文库可以是对心脏病和血液和/或免疫系统的疾病的治疗特别有益的，针对这些疾病患者可以受益于立即获得治疗剂。

[0152] 某些实施方案涉及用于组织/器官建模和/或疾病建模的细胞。在一个实施方案中，使皮肤细胞重新编程和扩增为大量的心脏细胞，并且心脏细胞用于针对心脏毒性筛选生物活性分子(安全性测试的实例)。在另一个实施方案中，使来自患有阿尔茨海默氏病的患者的皮肤细胞重新编程和扩增为大量的皮层神经元，并且皮层神经元用于筛选减少不溶性斑块积累的生物活性分子(效力测试的实例)。因此，本发明的某些实施方案有用于安全性测试和/或效力测试。

[0153] 某些实施方案涉及用于包囊细胞和/或使细胞种植在支架中的方法，并且涉及包囊的细胞和/或种植在支架中的细胞。在某些情况下，包囊细胞可以是有益的，部分因为包囊的细胞可以是比未包囊的细胞免疫原性小。在一个实施方案中，细胞被重新编程为葡萄糖反应性胰岛素产生细胞，将葡萄糖反应性胰岛素产生细胞包囊在如海藻酸盐的材料中，并且将包囊的葡萄糖反应性胰岛素产生细胞引入到患有1型糖尿病的患者中。在另一个实施方案中，引入是通过腹膜内注射或门脉内注射。在某些情况下，使细胞种植在支架中可以是有益的，部分因为支架可以提供机械稳定性。在一个实施方案中，使细胞重新编程和扩增为大量的成纤维细胞和角质化细胞，使成纤维细胞和角质化细胞种植在包含胶原的支架中，并且将所种植的支架涂敷于伤口上，形成合成皮肤移植物。在另一个实施方案中，重新编程细胞，将重新编程的细胞与呈液体或泥浆形式的支架混合，将混合物引入到患者中， 并且在引入时或引入后支架的硬度增加。

[0154] 某些实施方案涉及用于纯化细胞的方法。转染、重新编程和基因编辑可以经常产生细胞群，所述细胞群包括具有希望的表型的细胞和具有一种或多种不希望的表型的细胞。因此，某些实施方案涉及用于纯化转染的细胞、重新编程的细胞和/或基因编辑的细胞的方法。在一个实施方案中，使用密度梯度纯化细胞。在另一个实施方案中，通过使细胞与允许具有一种或多种希望的表型的细胞与具有一种或多种不希望的表型的细胞分离的一种或多种抗体接触的来纯化细胞。在另一个实施方案中，抗体与基底结合，优选地磁珠。在又另一个实施方案中，抗体与荧光分子结合，并且通过荧光激活细胞分选法(FACS)或其它类似方式进行分离。在另一个实施方案中，优选地通过使细胞与防止细胞分裂的一个或多个分子接触来防止具有不希望的表型的细胞增殖，所述分子优选地丝裂霉素-c、5-氮杂-脱氧胞苷、氟尿嘧啶或其生物活性类似物或衍生物。其它实施方案涉及包含被纯化以富集具有一种或多种希望的表型的细胞级分的细胞的治疗剂。

[0155] 某些实施方案涉及用于产生动物模型的方法，所述模型包括突变和疾病的模型。在一个实施方案中，基因编辑动物皮肤细胞并且重新编程为多能干细胞。在另一个实施方案中，将约1至100个重新编程和基因编辑的细胞注射到胚泡中，并且将胚泡植入到动物的子宫角中。在一个实施方案中，动物选自以下组：猫、狗、小鼠、猪、马、奶牛、鸡、绵羊、山羊、鱼、灵长类动物以及大鼠。在另一个实施方案中，动物为大鼠。

[0156] 当并入到合成RNA分子中时，某些非规范核苷酸可以部分地通过干扰检测外源核酸的蛋白质(例如蛋白激酶R、Rig-1和蛋白质的寡腺苷酸合成酶家族)的结合来减少合成RNA分子的毒性。已经报道的当并入其中时减少合成RNA分子的毒性的非规范核苷酸包括：假尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷以及其某些组合。然而，可以使它们能够实现降低合成RNA分子的毒性的非规范核苷酸的化学特征直到此时仍未知。此外，并入大量的大多数非规范的核苷酸(例如，5-甲基尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞苷以及N6-甲基腺苷)可以减少合成RNA分子可以翻译成蛋白质的效率，在要求蛋白质表达的应用中限制含有这些核苷酸的合成RNA分子的效用。另外，虽然在合成RNA分子中假尿苷可以完全取代尿苷而没有减少合成RNA分子可以翻译成蛋白质的效率，但是在某些情况下，例如当进行频繁的重复转染时，仅含有腺苷、鸟苷、胞苷和假尿苷的合成RNA分子可以展现过量的毒性。

[0157] 现已经发现，含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一个或多个非规范核苷酸的合成RNA分子可以比仅含有规范核苷酸的合成RNA分子毒性小，部分由于这些位置上的取代干扰由检测外源核酸的蛋白质识别合成RNA分子的能力，并且此外，在这些位置上的取代可以对合成RNA分子可以翻译成蛋白质的效率具有最小的影响，部分由于缺乏在这些位置上的取代与碱基配对和碱基堆积相互作用的干扰。

[0158]

[0159] 在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的非规范核苷酸的实例包括，但不限于：2-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、假尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基-5-氮杂尿苷、5-氨基-5-氮杂尿苷、5-羟基-5-氮杂尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基假尿苷、4-硫代-5-氮杂尿苷、4-硫代假尿苷、4-硫代-5-甲基尿苷、4-硫代-5-氨基尿苷、4-硫代-5-羟基尿苷、4-硫代-5-甲基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-氨基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-羟基-5-氮杂尿苷、4-硫代-5-

[0160] 甲基假尿苷、4-硫代-5-氨基假尿苷、4-硫代-5-羟基假尿苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、N4-氨基胞苷、N4-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-氨基胞苷、5-羟基胞苷、5-甲基-5-氮杂胞苷、5-氨基-5-氮杂胞苷、5-羟基-5-氮杂胞苷、5-甲基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-羟基假异胞苷、N4-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代-5-氮杂胞苷、2-硫代假异胞苷、2-硫代-N4-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基胞苷、2-硫代-N4-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、2-硫代-5-氨基胞苷、2-硫代-5-羟基胞苷、2-硫代-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-5-甲基假异胞苷、
2-硫代-5-氨基假异胞苷、2-硫代-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-甲基胞苷、N4-甲基-5-氨基胞苷、N4-甲基-5-羟基胞苷、N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-氨基假异胞苷、N4-甲基-5-羟基假异胞苷、N4-氨基-
5-氮杂胞苷、N4-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-甲基胞苷、N4-氨基-5-氨基胞苷、N4-氨基-5-羟基胞苷、N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-甲基假异胞苷、N4-氨基-5-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、N4-羟基-5-羟基胞苷、N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-甲基假异胞苷、N4-羟基-5-氨基假异胞苷、N4-羟基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-甲基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氮杂胞苷、
2-硫代-N4-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞 苷、2-硫代-N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-甲基假异胞苷、
2-硫代-N4-氨基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-氨基-5-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、
2-硫代-N4-羟基-5-羟基胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-甲基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-氨基假异胞苷、2-硫代-N4-羟基-5-羟基假异胞苷、N6-甲基腺苷、N6-氨基腺苷、N6-羟基腺苷、7-脱氮杂腺苷、8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮杂腺苷、N6-甲基-
8-氮杂腺苷、7-脱氮杂-8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮杂腺苷、N6-氨基-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-脱氮杂-8-氮杂腺苷、N6-羟基腺苷、N6-羟基-7-脱氮杂腺苷、N6-羟基-8-氮杂腺苷、N6-羟基-7-脱氮杂-8-氮杂腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂鸟苷。注意到，针对某些非规范核苷酸存在替代的命名方案。例如，在某些情况下，5-甲基假尿苷可以称为“3-甲基假尿苷”或“N3-甲基假尿苷”。

[0161] 含有前缀“氨基”的核苷酸可以是指含有与核苷酸的指定位置上的原子结合的氮原子的任何核苷酸，例如5-氨基胞苷可以是指5-氨基胞苷、5-甲基氨基胞苷以及5-硝基胞苷。类似地，含有前缀“甲基”的核苷酸可以是指含有与核苷酸的指定位置上的原子结合的碳原子的任何核苷酸，例如5-甲基胞苷可以是指5-甲基胞苷、5-乙基胞苷以及5-羟甲基胞苷，含有前缀“硫代”的核苷酸可以是指含有与核苷酸的给定位置上的原子结合的硫原子的任何核苷酸，并且含有前缀“羟基”的核苷酸可以是指含有与核苷酸的给定位置上的原子结合的氧原子的任何核苷酸。

[0162] 因此，某些实施方案涉及合成RNA分子，其中合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核 苷酸。其它实施方案涉及治疗剂，其中治疗剂含有一个或多个合成RNA分子，并且其中一个或多个合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核苷酸。在一个实施方案中，治疗剂包含转染试剂。在另一个实施方案中，转染试剂包含阳离子脂质、脂质体或胶束。在还另一个实施方案中，脂质体或胶束包含叶酸盐并且治疗组合物具有抗癌活性。在另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括以下的至少一种：假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、7-脱氮杂腺苷、7-脱氮杂鸟苷、6-硫代鸟苷以及6-硫代-7-脱氮杂鸟苷。在另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括以下的至少一种：假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷以及5-氨基假尿苷；以及以下的至少一种：假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷以及5-甲基假异胞苷。在还另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括以下的至少一种：假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷和5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷以及以下的至少一种：
假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷和5-甲基假异胞苷以及以下的至少一种：7-脱氮杂鸟苷、6-硫代鸟苷和6-硫代-7-脱氮杂鸟苷。在又另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括：5-甲基胞苷和7-脱氮杂鸟苷。在另一个实施方 案中，一种或多种核苷酸还包括假尿苷或4-硫代尿苷或5-甲基尿苷或5-氨基尿苷或4-硫代假尿苷或5-甲基假尿苷或5-氨基假尿苷。在还另一个实施方案中，一种或多种核苷酸还包括7-脱氮杂腺苷。在另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮杂鸟苷以及4-硫代尿苷。在又另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括：假异胞苷或7-脱氮杂鸟苷和假尿苷。在还另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮杂鸟苷。在另一实施方案中，一种或多种核苷酸包括：假尿苷或5-甲基假尿苷和5-甲基胞苷以及7-脱氮杂鸟苷。在另一个实施方案中，一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-脱氮杂鸟苷以及假尿苷。

[0163] 通过通常用于体外转录的RNA聚合酶，某些非规范核苷酸可以比其它非规范核苷酸更有效地并入到合成RNA分子中，部分由于这些确定的非规范核苷酸参与标准碱基配对相互作用和碱基堆积相互作用并且以类似于其中对应的规范核苷酸与RNA聚合酶相互作用的方式与RNA聚合物相互作用的趋势。因此，含有一种或多种非规范核苷酸的某些核苷酸混合物可以是有益的，部分因为含有这些核苷酸混合物的体外转录反应可以产生大量的合成RNA。因此，某些实施方案涉及核苷酸混合物，其含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种核苷酸。核苷酸混合物包括，但不限于(每种核苷酸前面的数字指明体外转录反应中的非规范核苷酸三磷酸的示例性部分，例如，0.2假异胞苷是指含有腺苷-5'-三磷酸、鸟苷-5'-三磷酸、尿苷-5'-三磷酸、胞苷-5'-三磷酸以及假异胞苷-5'-三磷酸的反应，其中假异胞苷-5'-三磷酸以大约等于存在于反应中的假异胞苷-5'-三磷酸+胞苷-5'-三磷酸的总量的0.2倍的量存在于反应中，其中量是基于摩尔或质量而测量的，并且其中核苷酸前面的多于一个数字指明示例性部分的范围)：1.0假尿苷、0.1-0.82-硫代尿苷、0.1-0.85-甲基尿苷、
0.2-1.05-羟基尿苷、0.1-1.05-氨基尿苷、0.1-1.04-硫代尿苷、0.1-1.02-硫代假尿苷、
0.1-1.04-硫代假尿苷、0.1-1.05-羟基假尿苷、0.2-15-甲基假 尿苷、0.1-1.05-氨基假尿苷、0.2-1.02-硫代胞苷、0.1-0.8假异胞苷、0.2-1.05-甲基胞苷、0.2-1.05-羟基胞苷、0.1-
1.05-氨基胞苷、0.2-1.0N4-甲基胞苷、0.2-1.05-甲基假异胞苷、0.2-1.05-羟基假异胞苷、
0.2-1.05-氨基假异胞苷、0.2-1.0N4-甲基假异胞苷、0.2-1.02-硫代假异胞苷、0.2-1.07-脱氮杂鸟苷、0.2-1.06-硫代鸟苷、0.2-1.06-硫代-7-脱氮杂鸟苷、0.2-1.08-氮杂鸟苷、
0.2-1.07-脱氮杂-8-氮杂鸟苷、0.2-1.06-硫代-8-氮杂鸟苷、0.1-0.57-脱氮杂腺苷以及
0.1-0.5N6-甲基腺苷。

[0164] 现已经发现，组合某些非规范核苷酸可以是有益的，部分因为非规范核苷酸对降低合成RNA分子的毒性的贡献可以是额外的。因此，某些实施方案涉及核苷酸混合物，其中核苷酸混合物含有多于一种以上列出的非规范核苷酸，例如，核苷酸混合物含有假异胞苷和7-脱氮杂鸟苷或核苷酸混合物含有N4-甲基胞苷和7-脱氮杂鸟苷等。在一个实施方案中，核苷酸混合物含有多于一种以上列出的非规范核苷酸，并且每种非规范核苷酸以以上列出的部分存在于混合物中，例如核苷酸混合物含有0.1-0.8假异胞苷和0.2-1.07-脱氮杂鸟苷或核苷酸混合物含有0.2-1.0N4-甲基胞苷和0.2-1.07-脱氮杂鸟苷等。

[0165] 在某些情况下，例如当可以不必要或希望使体外转录反应的产率最大化时，可以使用核苷酸部分而不是以上给定的那些。以上列出的示例性部分和部分的范围涉及具有通常纯度(大于90％纯度)的核苷酸-三磷酸溶液。可以通过使用具有更大纯度的核苷酸-三磷酸溶液来使用这些和其它核苷酸的更大部分，所述更大纯度例如大于约95％纯度或大于约98％纯度或大于约99％纯度或大于约99.5％纯度，所述纯度可以例如通过使用现有的化学纯化技术如高压液相色谱法(HPLC)或通过其它方式纯化核苷酸三磷酸溶液来实现。在一个实施方案中，纯化具有多种异构体的核苷酸以富集希望的异构体。

[0166] 其它实施方案涉及用于通过使细胞与合成RNA分子接触来诱导细胞表达感兴趣的蛋白质的方法，所述合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非规范核苷酸。 还其它的实施方案涉及用于通过使细胞与合成RNA分子接触来转染、重新编程和/或基因编辑细胞的方法，所述合成RNA分子含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非规范核苷酸。在一个实施方案中，合成RNA分子由体外转录产生。在一个实施方案中，合成RNA分子编码一种或多种重新编程因子。在另一个实施方案中，一种或多种重新编程因子包括Oct4蛋白。在另一个实施方案中，还使细胞与编码Sox2蛋白的合成RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞与编码Klf4蛋白的合成RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞与编码c-Myc蛋白的合成RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞与编码Lin28蛋白的合成RNA分子接触。

[0167] 在含有规范核苷酸和非规范核苷酸的体外转录反应中，如T7RNA聚合酶的酶可以优选并入规范核苷酸。因此，含有某一部分的非规范核苷酸的体外转录反应可以产生含有与存在于反应中的非规范核苷酸的部分不同(通常更低)部分的非规范核苷酸的RNA。在某些实施方案中，提到核苷酸并入部分(例如，“含有50％假异胞苷的合成RNA分子”或“0.1-0.8假异胞苷”)因此可以是指含有指定部分的核苷酸的RNA分子和在含有指定部分的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如核苷酸-三磷酸)的反应中合成的RNA分子，即使这样的反应可以产生含有与存在于反应中的非规范核苷酸的部分不同的部分的核苷酸的RNA。

[0168] 不同的核苷酸序列可以通过使用替代的密码子来编码相同的蛋白质。在某些实施方案中，提到核苷酸并入部分因此可以是指含有指定部分的核苷酸的RNA分子和编码与不同RNA分子相同的蛋白质的RNA分子，其中不同RNA分子含有指定部分的核苷酸。

[0169] 某些实施方案涉及试剂盒，其含有实践本发明所需要的一种或多种材料。在一个实施方案中，试剂盒含有合成RNA分子。在一个实施方案中，试剂盒含有编码一种或多种重新编程因子和/或基因编辑蛋白的合成RNA分子。在另一个实施方案中，合成RNA分子含有在嘧 啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一个或多个取代的一种或多种非规范核苷酸。在另一个实施方案中，试剂盒含有以下的一种或多种：转染培养基、转染试剂、复合培养基以及涂布溶液。在一个实施方案中，涂布溶液含有纤连蛋白和/或玻连蛋白，优选地重组纤连蛋白和/或重组玻连蛋白。在一个实施方案中，试剂盒的一个或多个组分呈多个等分试样存在。在一个实施方案中，试剂盒含有核酸转染-试剂复合物的等分试样。在另一个实施方案中，试剂盒含有以固体形式，例如呈冷冻或冷冻干燥的沉淀提供的核酸转染-试剂复合物的等分试样。在又另一个实施方案中，试剂盒含有培养基的等分试样，其中每个等分试样含有通过化学处理或通过冷冻稳定的转染试剂-核酸复合物。

[0170] 通常转染和具体地重新编程可以是不同和耗时的技术，所述技术可以是重复的和易于出错。然而，这些技术经常手动进行，由于缺乏自动的转染仪器。因此，某些实施方案涉及可以自动或半自动方式转染、重新编程和/或基因编辑细胞的系统。

[0171] 现参考图9A至图11，某些实施方案涉及能够在多孔板(2)中转染细胞的系统(1)。在一个实施方案中，板被装入从系统滑出的托盘(3)中。在另一个实施方案中，系统能够存放多个板(12)。在又另一个实施方案中，系统包括存放转染培养基的装置(4)。在一个实施方案中，系统包括存放限定温度(优选地2C与6C之间)下的培养基的装置。在一个实施方案中，系统包括存放从孔中去除的液体、废物和/或细胞的装置(5)。在另一个实施方案中，系统包括供应电源的连接(6)。在又另一个实施方案中，系统包括端口(33)以与计算机(34)连通。在一个实施方案中，端口为USB端口。在一个实施方案中，系统包括排出风扇(7)。在另一个实施方案中，系统包括供应真空的连接(8)。

[0172] 细胞存活力可以获益于控制细胞周围的环境。因此，某些实施方案涉及包括用于在指定或希望的温度下孵育细胞的装置的系统。在一个实施方案中，在约35C与39C之间的一个或多个温度下孵育细胞。在一个实施方案中，在约37C的温度下孵育细胞。其它实施方案涉及 包括用于控制在其中孵育细胞的大气的装置的系统。在一个实施方案中，系统包括用于调节大气的二氧化碳浓度的装置。在一个实施方案中，二氧化碳浓度为3％与7％之间，优选地约5％。在另一个实施方案中，系统包括用于调节大气的氧气浓度的装置。在一个实施方案中，系统通过引入氮气来调节氧气浓度。在还另一个实施方案中，氧气浓度为约3％与约7％之间，如约5％。在一个实施方案中，系统包括用于控制在其中孵育细胞的大气的氧气和二氧化碳浓度的装置。在另一个实施方案中，系统包括供应二氧化碳的连接(9)。在又另一个实施方案中，系统包括供应氮气的连接(10)。在又另一个实施方案中，系统包括供应氧气的连接(11)。

[0173] 某些实施方案涉及包括用于分配核酸转染-试剂复合物和/或培养基的装置(24)的系统。在一个实施方案中，系统包括可以分配复合物和/或培养基的一个或多个前面装载吸管。用于分配复合物的其它装置的实例包括，但不限于：后面装载吸管、蠕动泵、微流体装置、电喷雾喷嘴、压电喷射器以及声学液滴喷射器。某些实施方案涉及包括用于产生核酸转染-试剂复合物(13)的装置的系统。在一个实施方案中，系统包括用于组合一种或多种转染试剂(14)和一种或多种核酸(15)的装置。在一个实施方案中，用于组合的装置包括一个或多个前面装载吸管。可以用于组合的其它装置的实例包括，但不限于：后面装载吸管、蠕动泵、微流体装置、电喷雾喷嘴、压电喷射器以及声学液滴喷射器。在一个实施方案中，系统包括一个或多个可去除尖端。在另一个实施方案中，可以消毒一个或多个可去除尖端。在另一个实施方案中，一个或多个可去除尖端为一次性的。在又另一个实施方案中，一个或多个可去除尖端由塑料或玻璃制成。在还另一个实施方案中，塑料为聚丙烯。在一个实施方案中，系统包括用于在一种或多种复合培养基(16)中使用一种或多种转染试剂孵育一种或多种核酸的装置。在另一个实施方案中，系统包括用于存放一种或多种核酸、一种或多种转染试剂以及一种或多种复合培养基的装置。在一个实施方案中，在室温下发生复合。在一个实施方案中，系统包括用于在使细胞与培养 基接触之前加温培养基例如至约20℃与约39℃之间或约30℃与约39℃之间的装置。在一个实施方案中，使用加热元件(25)加温培养基。在一个实施方案中，系统包括用于存放和/或分配多种培养基的装置。

[0174] 某些实施方案涉及用于存放核酸转染-试剂复合物的方法。在一个实施方案中，使一种或多种核酸和一种或多种转染试剂与一种或多种复合培养基组合并且冷却以产生核酸转染-试剂沉淀。在一个实施方案中，通过与液氮接触来进行冷却。其它冷却方法包括，但不限于与以下接触：珀尔贴(Peltier)冷却器、冷却液体丙烷、冷却液体乙烷以及冷却抛光金属表面。在一个实施方案中，方法大致上不含RNA酶。某些实施方案涉及用于使用核酸转染-试剂沉淀转染细胞的方法。在一个实施方案中，在添加至转染培养基之前加温沉淀。在一个实施方案中，通过将沉淀放在小体积的温热转染培养基中来加温沉淀，所述温热转染培养基然后与待转染的细胞接触。在另一个实施方案中，直接将沉淀添加至转染培养基中。某些实施方案涉及可以使用核酸转染-试剂沉淀进行转染的系统。在一个实施方案中，系统包括用于在限定的温度范围内存放沉淀(17)的装置。在一个实施方案中，温度范围为约-90℃与约0℃之间，优选地约-30℃与约-4℃之间。在一个实施方案中，系统包括用于分配沉淀的装置。在一个实施方案中，使用柱塞(19)分配沉淀。在另一个实施方案中，使用转盘(20)分配沉淀，所述转盘(20)含有穿过其中分配沉淀的开口(21)。在一个实施方案中，设备包括用于在将沉淀添加至转染培养基之前加温沉淀的装置。在一个实施方案中，通过将沉淀放在含有温热转染培养基的小容器(22)中来加温沉淀，所述温热转染培养基然后与待转染的细胞接触。在另一个实施方案中，设备含有用于将沉淀直接分配到转染培养基中的装置。在又另一个实施方案中，将沉淀存放在药筒(16)中。在一个实施方案中，系统包括用于替换药筒的装置(36)。

[0175] 在细胞培养过程中，为了添加营养物和/或减少、去除或以另外的方式灭活细胞废物或其它不希望的组分，全部或部分替换培养基或用额外量的培养基或其它补充剂补充培养基可以是有益的，所述细胞废 物或其它不希望的组分可以存在于培养基中，包括残留复合物。因此，某些实施方案涉及包括用于使培养基从细胞中全部或部分去除的装置(23)的系统。在一个实施方案中，系统包括吸气器。

[0176] 某些实施方案涉及包括用于去除孔板的盖子的装置的系统。在一个实施方案中，系统包括用于使用抽吸器(27)去除孔板的盖子(26)的装置。用于去除孔板的盖子的其它装置包括，但不限于：粘合剂、铰接式附属物(28)、夹具、磁铁以及电磁铁。在某些实施方案中，系统包括用于使细胞成像的装置(29)。在一个实施方案中，通过测量含有细胞的容器的光学密度来确定细胞密度。在另一个实施方案中，通过使细胞成像来确定细胞密度。

[0177] 某些实施方案涉及用于与其它仪器可操作组合的系统，所述其它仪器例如用于培养、成像或以另外的方式操控细胞的仪器。在一个实施方案中，使用机械臂(30)来装载系统(1)。在另一个实施方案中，机械臂用来将板转移至孵育器(31)和/或从孵育器(31)中转移板。在又另一个实施方案中，板成像仪(32)用来使细胞成像。在又另一个实施方案中，使用计算机(34)控制系统。在一个实施方案中，系统用于转染、重新编程和/或基因编辑细胞。

[0178] 因此，本发明具有为研究和治疗使用提供产品的目的。

[0179] 在以下所附描述中列举了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但如今描述了说明性的方法和材料。通过描述和通过权利要求书本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。实施例

[0180] 实施例1 RNA合成

[0181] 由DNA模板(表1)合成编码人蛋白质Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28并且包含规范和非规范核苷酸的各种组合的RNA。通 过琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的样品以评价RNA的品质(图1)。然后将RNA稀释至100ng/μL与500ng/μL之间。针对某些实验，在1μL/100μg的RNA的浓度下添加RNA酶抑制剂(Superase·InTM,Life Technologies Corporation)。在4C下存放RNA溶液。针对涉及RNA混合物的某些实验，以3:1:1:1:1的摩尔比混合编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA。

[0182] 表1.

[0183]

[0184]

[0185]

[0186]

[0187] “A”是指腺苷-5'-三磷酸，“G”是指鸟苷-5'-三磷酸，“U”是指尿苷-5'-三磷酸，“C”是指胞苷-5'-三磷酸，“psU”是指假尿苷-5'-三磷酸，“5mC”是指5-甲基胞苷-5'-三磷酸，“2sU”是指2-硫代尿苷-5'-三磷酸，“psisoC”是指假异胞苷-5'-三磷酸，“5mU”是指5-甲基尿苷-5'-三磷酸，“7dA”是指7-脱氮杂腺苷-5'-三磷酸，“7dG”是指7-脱氮杂鸟苷-5'-三磷酸，并且“N4mC”是指N4-甲基胞苷-5'-三磷酸。

[0188] 实施例2转染培养基配制

[0189] 开发支持有效转染、重新编程和基因编辑细胞的培养基：DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。

[0190] 当与具体转染试剂、具体核酸和具体细胞类型一起使用时，还开发了这种培养基的变型来提供改进的性能：DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+4.5μg/mL胆固醇+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白，DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+1μΜ氢化可的松+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白，以及DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+4.5μg/mL胆固醇+1μΜ氢化可的松+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。

[0191] 在某些实验中添加至细胞培养基中的额外组分的实例(与实例浓度一起列出)包括：15mM HEPES、2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、2 μg/mL乙醇胺、10μg/mL脂肪酸、10μg/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)、25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯、lμg/mL至50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物、200ng/mL B18R以及0.1％普罗尼克F-68。

[0192] 针对其中调节培养基的某些实验，使用了以下变型：

[0193] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+4.5μg/mL胆固醇+10μg/mL鱼肝油脂肪酸(甲酯)+25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+1μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物+0.1％普罗尼克F-68+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。

[0194] 针对其中没有调节培养基的某些实验，使用了以下变型。

[0195] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+4.5μg/mL胆固醇+1μM氢化可的松+0μg/mL至25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+50μg/mL L-抗坏血酸
2-磷酸一倍半镁盐水合物+20ng/mL bFGF+5mg/mL处理过的人血清白蛋白。

[0196] 为了制备这些变型，通过添加32mM辛酸钠、接着在60C下加热4h、接着在室温下用离子交换树脂(AG501-X8(D))处理6h、接着在室温下用葡聚糖涂布的活性炭(C6241,Sigma-Aldrich Co.LLC.)处理过夜、接着离心、过滤、用不含核酸酶的水调节至10％溶液、接着添加至培养基的其它组分中来处理所述处理过的人血清白蛋白。针对其中调节培养基的某些实验，对辐射过的人新生儿成纤维细胞供给者调节培养基，持续24h。将细胞铺放在纤连蛋白涂布的板或纤连蛋白和玻连蛋白涂布的板上，除非另外说明。

[0197] 可以调节培养基的配制来满足培养的具体细胞类型的需要。此外，在某些情况下，处理过的人血清白蛋白可以被其它处理过的白蛋白(例如处理过的牛血清白蛋白)替换，其它谷氨酰胺来源可以替代L-丙氨 酰基-L-谷氨酰胺或除了L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺以外(例如L-谷氨酰胺)而使用，其它缓冲体系可以替代HEPES或除了HEPES以外(例如磷酸盐、碳酸氢盐等)而使用，硒可以呈替代亚硒酸钠或除了亚硒酸钠以外(例如亚硒酸)的其它形式提供，其它抗氧化剂可以替代L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯或除了L-抗坏血酸2-磷酸一倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚乙酸酯以外(例如，L-抗坏血酸)而使用，其它表面活性剂可以替代聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和/或普罗尼克F-68或除了聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和/或普罗尼克F-68以外(例如普罗尼克F-127)而使用，其它基础培养基可以替代DMEM/F12或除了DMEM/F12以外(例如MEM、DMEM等)而使用，并且培养基的组分可以随时间而变化，例如通过第0天至第5天使用没有TGF-β的培养基，并且然后在第5天后使用含有2ng/mL TGF-β的培养基。在某些情况下，可以在适当浓度下添加其它成分，例如脂肪酸、溶血磷脂酸、溶血神经鞘氨酯、鞘氨醇-1-磷酸酯、其它鞘脂、蛋白质的TGF-β/NODAL家族的成员、IL-6、蛋白质的Wnt家族的成员等，并且当与那些细胞类型(例如，鞘氨醇-1-磷酸酯和多能干细胞)一起使用时，可以在适当浓度下将已知促进或抑制具体细胞类型和/或蛋白质的激动剂和/或拮抗剂的生长的成分或已知促进或抑制具体细胞类型的生长的其它分子添加至培养基中。成分可以采取纯化的化合物、明确定义的混合物的部分、复合物或未定义的混合物(例如动物油或植物油)的部分的形式，并且可以通过生物方法例如调节来添加。组分的浓度可以不同于将对于本领域中的技术人员而言明显的范围内的所列出的值。

[0198] 实施例3使用合成RNA转染细胞

[0199] 为了在6孔板中转染，首先在复合培养基( Life Technologies Corporation)中分别将2μg RNA和6μL转染试剂(LipofectamineTM RNAiMAX,Life 
Technologies Corporation)各自稀释至60μL的总体积。根据转染试剂制造商的指示，然后混合稀释的RNA和转染试剂并且在室温下孵育15min。然后将复合物添加至培养 的细胞中。
将30μL与240μL之间的复合物添加至6孔板的每个孔中，每个孔已经含有2mL的转染培养基。
然后轻轻摇晃板以使复合物分布在整个孔中。在用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基之前，使用复合物孵育细胞2小时至过夜。放大体积规模用于在24孔板和96孔板中转染。在使用针对Oct4的抗体转染后20h至24h，固定和染色细胞(图2A)。染色和计数细胞核以确定RNA的相对毒性(图2B)。

[0200] 实施例4分析未处理的人血清白蛋白制剂支持核酸转染和RNA重新编程的能力

[0201] 在具有或不具有5mg/mL HSA的培养基中培养原代人新生儿成纤维细胞。筛选科恩级分V(A6784,Sigma-Aldrich Co.LLC.)和四种不同的重组HSA制剂(A6608、A7736、A9731和A9986，所有均来自Sigma-Aldrich Co.LLC.)。根据实施例3转染细胞，其中根据实施例1合成RNA。虽然未转染的细胞在含有任何HSA制剂的培养基中生长良好，但是在转染的孔中，每种HSA制剂产生显著不同的细胞形态和细胞密度，并且没有一种产生指明重新编程的形态变化。

[0202] 实施例5产生辛酸盐处理的人血清白蛋白

[0203] 用22mM氯化钠和16mM辛酸钠(Sigma-Aldrich Co.LLC)预先孵育HSA的10％溶液，并且在组成完全培养基之前在37C下孵育3小时。

[0204] 实施例6使用离子交换色谱法处理人血清白蛋白

[0205] 通过在室温下轻轻搅拌地将2g的HSA溶解在10mL不含核酸酶的水中来制备在毕赤酵母(Pichia pastoris)(A7736，Sigma-Aldrich Co.LLC.)中产生的重组HSA的20％溶液。然后通过首先添加1g的混合床去离子树脂(AG 501-X8(D)，Bio-Rad Laboratories,Inc.)并且在室温下摇动1h来使HSA溶液去离子化。然后将HSA溶液倾析到含有5g新鲜树脂的管中，并且在室温下摇动4h。最后，倾析去离子化的HSA溶液，使用不含核酸酶的水调节至10％的总蛋白质含量，使用0.2μm PES-膜过滤器过滤消毒，并且在4C下存放。

[0206] 实施例7分析在含有辛酸盐处理的人血清白蛋白的培养基中培 养的细胞的转染效率和存活力

[0207] 在含有根据实施例4处理的重组HSA或含有处理过的血液来源的HSA(Bio-Pure HSA，Biological Industries)的培养基中培养原代人新生儿成纤维细胞。在第0天开始，根据实施例3每日转染细胞，其中根据实施例1合成RNA。在第3天拍摄照片。在含有辛酸盐的孔中观察到经历类似于间充质向上皮转化的形态变化的细胞的若干小区域，指明了增加的转染效率。在含有处理过的血液来源的HSA的样品中观察到类似于间充质向上皮转化的形态变化的许多大区域。在这两种情况下，形态变化是重新编程的特征。

[0208] 实施例8使用含有辛酸盐处理的人血清白蛋白重新编程人成纤维细胞

[0209] 在5000个细胞/孔的密度下在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中将原代人新生儿成纤维细胞铺放在6孔板中。6小时后，用含有辛酸盐处理的HSA的转染培养基替换培养基。在第0天开始，根据实施例3每日转染细胞，其中根据实施例1合成RNA。到第5天，孔含有展现出与重新编程一致的形态的细胞的若干区域。这个实验不包括使用供给者或免疫抑制剂。

[0210] 实施例9分析在含有离子交换树脂处理的人血清白蛋白的培养基中培养的细胞的转染效率和存活力

[0211] 在第0天开始，根据实施例3转染原代人新生儿成纤维细胞，其中根据实施例1合成RNA。在第2天拍摄照片。与含有处理过的血液来源的HSA或离子交换树脂处理的重组HSA的孔相比，在含有未处理的HSA的孔中的细胞展现出低存活力。

[0212] 实施例10使用离子交换树脂处理的人血清白蛋白重新编程人成纤维细胞

[0213] 在10,000个细胞/孔的密度下在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中将原代人新生儿成纤维细胞铺放在供给者上的6孔板中。在第0天开始，根据实施例3每日转染细胞，其中根据实施例1合成RNA。在第4天进行具有分流比为1:20的传代。在第10天拍摄照片。 孔含有展现出与重新编程一致的形态的许多细胞大集落。在曝露于含有未处理的HSA的细胞培养基的孔中没有观察到集落。

[0214] 实施例11不使用供给者或免疫抑制剂重新编程人成纤维细胞

[0215] 在20,000个细胞/孔的密度下在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中将原代人成纤维细胞铺放在6孔板中。6小时后，用含有处理过的HSA并且不含有免疫抑制剂的转染培养基替换培养基，并且根据实施例3每日转染细胞，其中根据实施例1合成RNA，除了RNA的剂量减少至1μg/孔并且总共进行5次转染。在第7天拍摄照片。早在第5天，展现出与重新编程一致的形态的细胞小集落变为可见的。在第7天，用在辐射过的小鼠胚胎成纤维细胞上调节24小时的DMEM/F12+20％KnockoutTM血清替代品(Life Technologies Corporation)+1X非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺替换培养基，并且然后补充20ng/mL bFGF和10μΜY-
27632。早在第8天，具有重新编程形态的大集落变为可见的。在第10天获取集落，并且铺放在用基底膜提取物( Human BME Trevigen Inc.)涂布的孔中
(图3A)。细胞快速生长，并且传代以建立系。建立的系针对多能干细胞标记物Oct4和SSEA4染色阳性(图3B)。重复整个方案，并且获得类似结果(图3C)。

[0216] 实施例12来自人皮肤活组织检查组织中的细胞的有效、快速的衍生和重新编程[0217] 根据批准的方案，对31周岁的健康志愿者进行全厚度皮穿孔活组织检查。简单地说，通过局部涂敷2.5％利多卡因使左上臂上的皮肤区域麻醉。用70％异丙醇给所述区域消毒，并且使用1.5mm直径穿孔进行全厚度皮活组织检查(图4A)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗组织，并且放在含有250μL TrypLETM Select CTSTM(Life Technologies Corporation)的1.5mL管中，并且在37C下孵育30min。然后将组织转移至含有250μL DMEM/F 12-CTSTM(Life Technologies Corporation)+5mg/mL胶原酶的1.5mL管中，并且在37C下孵育2h(图TM4B)。使用镊子去除表皮，并且以机械方式剥离组织。用DMEM/F 12-CTS 冲洗细胞两次，并且铺放在24孔板和96孔板的纤连蛋白涂布的孔中。还对相同的志愿者进行了静脉切开术，并且将静脉血收集在 SSTTM管(Becton,Dickinson and Company)中。根据制
造商的方案分离血清。通过混合DMEM/F12-CTSTM+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)+20％人血清来制备等基因涂覆培养基。将来自皮组织样品的细胞铺放在转染培养基或等基因涂覆培养基中。2天后，冲洗孔，并且用转染培养基替换培养基。具有成纤维细胞形态的许多细胞附着并且到第2天开始扩散(图4C)。在第2天开始根据实施例3转染细胞，其中根据实施例1合成RNA，其中放大所有体积以适应更小的孔。到第5天，观察到具有与重新编程一致的形态的细胞区域。

[0218] 实施例13使用含有非规范核苷酸的合成RNA重新编程人成纤维细胞

[0219] 在20,000个细胞/孔的密度下，在转染培养基中将原代人成纤维细胞铺放在用重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白(所述重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白各自用DMEM/F12稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，如在实施例3中转染细胞，其中根据实施例1合成RNA，除了RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔以及第3天2μg/孔。在第4天拍摄照片。在第4天，展现出与重新编程一致的形态的细胞小集落是可见的。

[0220] 实施例14用未调节的转染培养基重新编程人成纤维细胞

[0221] 在20,000个细胞/孔的密度下，在转染培养基中将原代人成纤维细胞铺放在用重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白(所述重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白各自用DMEM/F12稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，如在实施例3中转染细胞，其中根据实施例1合成RNA，除了RNA的剂量为第1天0.5μg/孔、第2天0.5μg/孔、第3天2μg/孔、第4天2μg/孔以及第5天4μg/孔。早在第5天，展现出与重新编程一致的形态的细胞小集落变为可见的。在第7天，用在辐射过的小鼠胚胎成纤维细胞上调节24 小时的DMEM/F12+20％KnockoutTM血清替代品(Life Technologies Corporation)+1X非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺替换培养基，并且然后补充20ng/mL bFGF和10μΜY-27632。早在第8天，具有重新编程形态的大集落变为可见的。在第10天挑取集落，并且铺放在用基底膜提取物(Human BME Trevigen Inc.)涂布的孔中。细胞快速生长，并且
传代以建立系。

[0222] 实施例15葡萄糖反应性胰岛素产生细胞的产生

[0223] 根据实施例11或实施例12重新编程细胞，并且然后在DMEM/F12+0.2％HSA+0.5X N2补充剂+0.5X B27补充剂+100ng/mL活化素A+1μΜ渥曼青霉素中培养4天，接着在1:1F12/IMDM+0.5％HSA+0.5％ITS补充剂+0.5X B27补充剂+2μΜ视黄酸+20ng/mL FGF7+50ng/mL NOGGIN中培养4天，接着在DMEM+0.5％HSA+1％ITS补充剂+1X N2补充剂+50ng/mL EGF中培养5天，接着在DMEM/F12+1％ITS补充剂+10ng/mL bFGF+10mM烟酰胺+50ng/mL艾塞那肽(exendin)-4+10ng/mL BMP4中培养7至9天，以便产生葡萄糖反应性胰岛素产生细胞。可选地，根据实施例11或实施例12重新编程细胞，并且然后在1:1F12/IMDM+0.5％HSA+0.5％ITS补充剂+0.5X B27补充剂+2μΜ视黄酸+20ng/mL FGF7+50ng/mL NOGGIN中培养4天，接着在DMEM+0.5％HSA+1％ITS补充剂+1X N2补充剂+50ng/mL EGF中培养5天，接着在DMEM/F12+
1％ITS补充剂+10ng/mL bFGF+10mM烟酰胺+50ng/mL艾塞那肽-4+10ng/mL BMP4中培养7至9天，以便产生葡萄糖反应性胰岛素产生细胞而没有产生定形内胚层细胞。可选地，根据实施例11或实施例12重新编程细胞，并且然后在1:1F12/IMDM+0.5％HSA+0.5％ITS补充剂+0.5X B27补充剂+2μΜ视黄酸+20ng/mL FGF7+50ng/mL NOGGIN中培养4天，接着在DMEM/F12+1％ITS补充剂+10ng/mL bFGF+10mM烟酰胺+50ng/mL艾塞那肽-4+10ng/mL BMP4中培养7至9天，以便产生葡萄糖反应性胰岛素产生细胞而没有产生定形内胚层细胞并且 没有使祖细胞扩增。虽然可以使内胚层细胞或胰岛素产生细胞与存在于培养物中的其它细胞分离，但是这种方法产生了足够高百分比的一般不要求此种分离的葡萄糖反应性胰岛素产生细胞。然后所得到的细胞可以在体外或体内用于筛选糖尿病研究或开发用于糖尿病的治疗剂的生物活性分子。

[0224] 实施例16使用重组蛋白产生葡萄糖反应性胰岛素产生细胞

[0225] 根据实施例11重新编程细胞，并且然后在DMEM/F12、100ng/ml活化素A、25ng/ml Wnt3a、0.01％重组HSA、1X ITSE中培养1天，接着在DMEM/F12、100ng/ml活化素A、0.01％重组HSA、1X ITSE中培养2天，接着在DMEM/F12、50ng/ml FGF10、0.25μΜKAAD-环杷明、0.01％重组HSA、1X ITSE中培养3天，接着在DMEM/F12、1％B27、2μΜ全反式视黄酸、50ng/ml FGF10、0.25μΜKAAD-环杷明中培养4天，接着在DMEM/F12、1％B27、1μΜγ-分泌酶抑制剂DAPT、50ng/ml艾塞那肽-4、10nMβ细胞素、10mM烟酰胺中培养2天，接着在DMEM/F12、50mg/L抗坏血酸-2-磷酸盐、1％B27、1μΜγ-分泌酶抑制剂DAPT、50ng/ml艾塞那肽-4、50ng/ml IGF-1、50ng/ml HGF、10nMβ细胞素、10mM烟酰胺中培养6天，以便产生葡萄糖反应性胰岛素产生细胞(图5A)。所得到的细胞可以在体外或体内用于筛选糖尿病研究或开发用于糖尿病的治疗剂的生物活性分子。

[0226] 实施例17用于包含重新编程细胞的1型糖尿病的个性化细胞替代疗法

[0227] 根据实施例12和实施例14使患者皮肤细胞重新编程为葡萄糖反应性胰岛素产生细胞。然后从培养容器中酶促释放细胞，并且将约1X106个与约1X 107个之间的细胞注射到腹膜内空间或门静脉。在腹膜内注射的情况下，使细胞与细胞外基质蛋白预先混合以防止过度迁移。细胞移入并且开始产生胰岛素。监测胰岛素/C-肽水平，并且需要时进行额外注射。

[0228] 实施例18 RNA TALEN的合成

[0229] 如在实施例1中由DNA模板合成编码20bp-匹配TALEN的RNA(图6A至图6C和图7)(表2)。通过琼脂糖凝胶电泳来分析所得到的RNA以评价RNA的品质。然后将RNA稀释至200ng/μTM
L，并且在lμL/100μg RNA的浓度下添加RNA酶抑制剂(Superase·In ,Life Technologies Corporation)。在4C下存放RNA溶液。在1:1摩尔比下混合编码每半个TALEN对的RNA。

[0230] 表2.

[0231]

[0232] 实施例19靶向CCR5基因的RNA TALEN的合成

[0233] 根据实施例18合成编码TALEN  L1：TCATTTTCCATACAGTCAGT，L2：TTTTCCATACAGTCAGTATC，R1：TGACTATCTTTAATGTCTGG以及R2：TATCTTTAATGTCTGGAAAT的RNA。
这些TALEN靶向有义链(L1和L2)或反义链(R1和R2)上的CCR5基因内的20-bp位点。制备以下TALEN对：L1&R1、L1&R2、L2&R1以及L2&R2。

[0234] 实施例20使用RNA TALEN和无DNA、无供给者、无免疫抑制 剂、无调节重新编程人成纤维细胞来基因编辑CCR5基因

[0235] 在10,000个细胞/孔的密度下，在转染培养基中将原代人成纤维细胞铺放在用重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白(所述重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白各自用DMEM/F12稀释至1μg/mL、1mL/孔的浓度，在室温下孵育1h)涂布的6孔板中。第二天，如在实施例3中转染细胞，除了RNA的剂量为0.5μg/孔，并且根据实施例19合成RNA。第二天开始，根据实施例11重新编程细胞。如在实施例11中，具有重新编程的形态特征的细胞大集落变为可见的。在第9天拍摄照片(图8)。

[0236] 实施例21用RNA TALEN和DNA修复模板转染细胞

[0237] 首先用复合培养基( )将含有从靶向双链断裂位置的500bp上游跨越至靶向双链断裂位置的500bp下游的1001bp-区的0.5ug RNA+0.5ug DNA和6μL转染试剂(LipofectamineTM2000,Life Technologies Corporation)分别稀释至各自60μL的总体积。
根据转染试剂制造商的指示，然后混合稀释的RNA+DNA和转染试剂并且在室温下孵育
15min。然后将复合物添加至培养的细胞中。向6孔板的每个孔中添加60μL与120μL之间，每个孔已经含有2mL的转染培养基。然后轻轻摇晃板以使复合物分布在整个孔中。在用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基之前，使用复合物孵育细胞2小时至过夜。

[0238] 实施例22使用RNA TALEN和DNA修复模板以及无DNA、无供给者、无免疫抑制剂、无调节重新编程人成纤维细胞来基因编辑

[0239] 在10,000个细胞/孔的密度下在成纤维细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清)中将原代人成纤维细胞铺放在6孔板中。6小时后，用含有处理过的HSA并且不含有免疫抑制剂的转染培养基替换培养基，并且根据实施例21转染细胞。第二天开始，根据实施例11或实施例12重新编程细胞，除了省略初始铺放和培养基变化步骤。

[0240] 实施例23造血细胞的产生

[0241] 根据实施例11重新编程细胞，并且然后在IMDM+0.5％HSA+1x ITS补充剂+450μΜ单硫代甘油+2mM L-谷氨酰胺+1X非必需 氨基酸+50ng/mL BMP4+50ng/mL VEGF+50ng/mL bFGF中培养6天，以便产生造血细胞(图5B)。可选地，根据实施例11或实施例12或实施例20或实施例22重新编程细胞，并且然后在IMDM+0.5％HSA+1x ITS补充剂+450μΜ单硫代甘油+2mM L-谷氨酰胺+1X非必需氨基酸+50ng/mL BMP4+50ng/mL VEGF+50ng/mL bFGF中培养6天，接着在IMDM+0.5％HSA+l x ITS补充剂+0.1mM 2-巯基乙醇+5U/mL肝素+10ng/mL TPO+
25ng/mL SCF+25ng/mL FLT3L+10ng/mL IL-3+10ng/mL IL-6中培养8天，以便产生造血细胞。可选地，根据实施例11或实施例12或实施例20或实施例22重新编程细胞，并且然后重新铺放在胶原IV上并且在IMDM+0.5％HSA+1x ITS补充剂+450μΜ单硫代甘油+2mM L-谷氨酰胺+1X非必需氨基酸+50ng/mL BMP4+50ng/mL VEGF+50ng/mL bFGF中培养6天，接着在IMDM+
0.5％HSA+1x ITS补充剂+0.1mM 2-巯基乙醇+5U/mL肝素+10ng/mL TPO+25ng/mL SCF+
25ng/mL FLT3L+10ng/mL IL-3+10ng/mL IL-6中培养8天，以便产生造血细胞。可选地，根据实施例11或实施例12或实施例20或实施例22重新编程细胞，并且然后在1:1F12/IMDM+
0.5％HSA+1x ITS补充剂+4.5μg/mL胆固醇+10μg/mL鱼肝油脂肪酸+25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚乙酸酯+450μΜ单硫代甘油+2mM L-谷氨酰胺+25ng/mL BMP4+25ng/mL VEGF+25ng/mL bFGF+20ng/mL SCF中培养10天，以便产生造血细胞。

[0242] 实施例24用于包含重新编程细胞的血液疾病的个性化细胞替代疗法

[0243] 根据实施例23使患者皮肤细胞重新编程为造血细胞。然后从培养容器中释放细胞，并且经过若干小时的时间段将每千克患者体重约1X 106个与约1X 107个之间的细胞灌注到主静脉中。

[0244] 实施例25用于包含基因编辑细胞和重新编程细胞的HIV/AIDS的个性化细胞替代疗法

[0245] 根据实施例23使患者皮肤细胞基因编辑和重新编程为造血细胞。 然后从培养容器中酶促释放细胞，并且经过若干小时的时间段将每千克患者体重约1X 106个与约1X 107个之间的细胞灌注到主静脉中。造血干细胞回到骨髓腔并且植入。可选地，根据实施例23使患者皮肤细胞基因编辑和重新编程为造血细胞，然后从培养容器中酶促释放细胞，并且分离CD34+/CD90+/Lin-细胞或CD34+/CD49f+/Lin-细胞。将约1X 103个与约1X 105个之间的细胞灌注到患者的主静脉中。造血干细胞回到骨髓腔并且植入。

[0246] 实施例26用于筛选生物活性分子的心脏病模型

[0247] 根据实施例11重新编程细胞，并且然后在DMEM/F12+0.2％HSA+0.5X N2补充剂+0.5X B27补充剂+100ng/mL活化素A+1μΜ渥曼青霉素中培养4天，接着在1:1F12/IMDM+
0.5％HSA+0.5％ITS补充剂+0.5X B27补充剂+2μΜ视黄酸+20ng/mL FGF7+50ng/mL NOGGIN中培养4天，接着在DMEM/F12+1％ITS补充剂+10ng/mL bFGF+10mM烟酰胺+50ng/mL艾塞那肽-4+10ng/mL BMP4中培养7至9天，以便产生心脏细胞(图5C)。可选地，根据实施例12重新编程细胞。虽然可以使心脏细胞与存在于培养物中的其它细胞分离，但是这种方法产生了足够高百分比的一般不要求此类分离的心脏细胞。所得到的细胞可以在体外或体内用于筛选心脏病研究或开发用于心脏病的治疗剂的生物活性分子。所得到的细胞还可以用于心脏毒性筛选。

[0248] 实施例27用于包含重新编程细胞的缺血性心肌病的个性化细胞替代疗法

[0249] 根据实施例26使患者皮肤细胞重新编程为心脏细胞。然后从培养容器中酶促释放细胞，并且将约1X 106个与约1X 107个之间的细胞注射到心包中或将约1X 103个与约1X 105个之间的细胞注射到一个或多个冠状动脉中。细胞植入，并且需要时进行额外注射。

[0250] 实施例28用于筛选生物活性分子的视网膜疾病模型

[0251] 根据实施例11或实施例12重新编程细胞，并且然后在DMEM/F12+0.2％HSA+0.5X N2补充剂+0.5X B27补充剂中培养7 天以产生视网膜细胞。所得到的细胞可以在体外或体内用于筛选视网膜疾病研究或开发用于视网膜疾病的治疗剂的生物活性分子。

[0252] 实施例29用于包含重新编程细胞的黄斑变性的个性化细胞替代疗法

[0253] 根据实施例28使患者皮肤细胞重新编程为视网膜细胞。然后从培养容器中酶促释放细胞，并且将约1X 104个与约1X 105个之间的细胞注射到视网膜中或视网膜下。细胞植入，并且需要时进行额外注射。

[0254] 等效方案

[0255] 本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。

[0256] 以引用的方式并入

[0257] 本文引用的所有专利和出版物特此以引用的方式整体并入。