一种具有杀虫效果的DNA片段及其在农业上的应用

摘要

本发明涉及一种具有杀虫效果的DNA片段及其在农业上的应用，属于生物转基因技术领域。本发明所述的一种具有杀虫效果的DNA片段，包括：信号肽序列、毒素蛋白序列、植物凝集素序列以及辅助序列，本发明将具有杀虫作用的蜘蛛毒素序列和植物凝结素序列以特定的方式连接起来，并添加辅助序列增加其表达量，形成一种具有杀虫效果的DNA片段，在害虫趋避防治方面具有积极的效果。该DNA片段在农业上的应用方式包括：可将DNA可转录翻译成一种融合蛋白，也可将DNA片段与植物启动子构建的多核苷酸组合物转入植物体内表达形成抗性植物。

权利要求

1.一种具有杀虫效果的DNA片段，包括：信号肽序列、毒素蛋白序列、植物凝集素序列以及辅助序列；

其特征在于：

所述的辅助序列具有蛋白特异性，辅助序列的选择与其连接的毒素蛋白序列相关，辅助序列具有帮助毒素蛋白折叠，提高蛋白活性的功能；

辅助序列选自 SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:10、SEQID NO.:14、SEQID NO.:18 序列；

辅助序列与毒素蛋白序列相连接，毒素蛋白序列与植物凝集素序列相连接；

所述毒素蛋白序列来源于蜘蛛毒素蛋白；其中，蜘蛛毒素蛋白来源于漏斗网蜘蛛、狼蛛、黑腹栉足蛛、悉尼漏斗网蜘蛛；

所述的植物凝集素序列来源于雪花莲凝集素或者与雪花莲凝集素功能等同的植物凝集素，其中，与雪花凝集素功能等同的植物凝集素包括伴刀豆凝集素(ConA)、大蒜凝集素。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：所述毒素蛋白序列选自SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:13、SEQID NO.:17、SEQID NO.:21，以及上述毒素蛋白一种或者几种组合物。

3.根据权利要求1所述具有杀虫效果的DNA片段在农业上的应用，其特征在于：所述DNA片段可转录翻译成一种融合蛋白，所述融合蛋白对于靶标昆虫具有杀虫效果。

4.根据权利要求1所述具有杀虫效果的DNA片段在农业上的应用，其特征在于：将DNA片段与植物启动子构建的多核苷酸组合物转入植物体内表达形成抗性植物，抗性植物对靶标昆虫具有抗性。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物启动子包括：CaMV35S启动子、泛素启动子、actin启动子、Nos启动子以及特异性表达启动子，其中特异性表达启动子包括：韧皮部特异性启动子RSs1、叶部特异性启动子rbcS启动子。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗性植物包括小麦，玉米，烟草，水稻，油菜，高粱，马铃薯，番茄，大麦，豆科作物，棉花。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述靶标昆虫包括但不限于盲蝽蟓、桃蚜、豌豆蚜、棉蚜、麦长管蚜、甘蓝夜蛾、马铃薯甲虫。

说明书

一种具有杀虫效果的DNA片段及其在农业上的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于生物转基因技术领域，涉及一种具有杀虫效果的DNA片段及其在农业上的应用。背景技术：

[0002] 在20世纪80年代，人们已经开始利用生物转基因技术来进行害虫的防治以及抗虫性植物的培养，然而，时至今日抗虫基因仍然以苏云金芽孢杆菌毒素基因(Bt)为主，将该基因转入棉花中通过多年应用发现，刺吸式害虫如盲蝽蟓由次要害虫逐步上升为主要害虫，主要因为上述抗虫基因对刺吸式口器害虫的作用效果不明显。同时，单一抗虫基因的长期使用可造成害虫抗性的增加，也限制了此类抗虫基因的进一步应用。因此，开发一种新型环保高效的抗虫基因或蛋白能够有效补充这一空白。

[0003] 蜘蛛毒素由于可作用于靶细胞膜的离子通道，而昆虫的离子通道相对保守，所以其对昆虫的作用具有广谱的杀虫性，对蜚蠊目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目、直翅目等害虫均具有抗虫作用。但由于昆虫的外表皮以及围食膜的障碍，使蜘蛛毒素无法有效的进入昆虫体内/离子通道，直接影响其杀虫效果，因此，在蜘蛛毒素的基础上增加了壳多糖酶以及植物凝集素，壳多糖酶可以突破昆虫外表皮的障碍作用，植物凝集素可以和昆虫围食膜表面、消化道上皮细胞的糖缀合物、或糖基化的消化酶等结合，诱发昆虫消化道产生病灶而达到杀虫的目的。例如：现有技术公开号为CN103154022A的文献中，将壳多糖酶通过分泌信号序列连接于蜘蛛毒性序列上，蜘蛛毒素序列与植物凝集素序列连接上，来降低昆虫外骨架的保护作用，使蜘蛛毒素更好的作用于与昆虫上，然而，将壳多糖酶与植物凝集素同时连接在毒素蛋白的两端会极大影响毒素的活性，因为大部分毒素蛋白的作用位点通常是在N端或C端。另外，即使将毒素与壳多糖酶连接在凝集素的两端，同样也会影响凝集素蛋白的活性。因此，现有技术很难发挥融合蛋白的作用。

[0004] 综上，现有利用蜘蛛毒素序列进行转基因的方法不能充分发挥蜘蛛毒素的作用，因此需要一种具有杀虫效果的DNA片段，该片段既能够实现毒素蛋白序列对刺吸式害虫以及其他类害虫具有良好的趋避杀虫效果，也能够保证该片段在基因转入过程中的稳定性。发明内容：

[0005] 本发明一种具有杀虫效果的DNA片段及其在农业上的应用是针对现有技术所存在的一系列缺陷，将具有杀虫作用的蜘蛛毒素序列和植物凝结素序列以特定的方式连接起来，并添加辅助序列增加其表达量，形成一种具有杀虫效果的DNA片段，该片段在植物、酵母等各种宿主具有表达量高，广谱性的特点。

[0006] 本发明技术方案如下：

[0007] 1、一种具有杀虫效果的DNA片段，其特征在于：所述一种具有杀虫效果的DNA片段包括：信号肽序列、毒素蛋白序列、植物凝集素序列以及辅助序列。

[0008] 2、根据技术方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述一种具有抗虫效果的DNA片段还可以包括蛋白水解酶抑制基因。蛋白水解酶抑制剂基因如CPTI等，主要与蛋白酶分子作用中心上的一些基团结合，使昆虫体内的蛋白酶活力下降甚至消失，保护毒素蛋白不被蛋白水解酶分解。

[0009] 3、根据技术方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述辅助序列与毒素蛋白序列相连接，毒素蛋白序列与植物凝集素序列相连接。其中，辅助序列不与植物凝集素连接，相关序列的连接均需考虑到连接序列在翻译后形成的氨基酸序列不影响毒素蛋白和植物凝集素的空间结构。当前，现有技术多采用壳多糖酶与植物凝集素同时连接在毒素的两端，然而大部分的毒素蛋白的作用位点通常是在N端或C端，这种连接方式极大影响了毒素的活性。此外，即使将毒素与壳多糖酶连接在凝集素的两端，同样也会影响凝集素蛋白的活性。因此现有技术很难发挥融合蛋白的杀虫作用。而采用本发明所用的额连接方式可充分发挥融合蛋白杀虫效果。

[0010] 4、根据技术方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述毒素蛋白序列来源于蜘蛛毒素蛋白或者与蜘蛛毒素蛋白具有功能等同的毒性蛋白；其中，蜘蛛毒素蛋白可来源于漏斗网蜘蛛、狼蛛、黑腹栉足蛛、悉尼漏斗网蜘蛛。蜘蛛毒素蛋白对于靶向昆虫的神经系统具有损伤作用，但对哺乳动物、蜜蜂无毒，无害。

[0011] 5、根据权利要求4所述的DNA片段，其特征在于：所述毒素蛋白序列可选自SEQ 6、SEQ13、SEQ17、SEQ21，以及上述毒素蛋白序列80％以上同源的其他毒素蛋白中的一种或者几种组合物。

[0012] 6、根据技术方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述的植物凝集素序列来源于雪花莲凝集素(GNA)或者与雪花莲凝集素功能等同的植物凝集素。采用雪花莲凝集素或者与雪花莲凝集素功能等同的植物凝集素克服了蜘蛛毒素易被昆虫消化道中消化蛋白水解的难题。与雪花凝集素功能等同的植物凝集素包括伴刀豆凝集素(ConA)、大蒜凝集素等植物凝集素，上述植物凝集素对人、畜以及蜜蜂无害。

[0013] 7、根据技术方案1所述的DNA片段，其特征在于：其特征在于：所述的辅助序列具有蛋白特异性，其中，辅助序列的选择与其连接的毒素蛋白序列相关，辅助序列具有帮助毒素蛋白折叠，提高蛋白活性的功能。

[0014] 其中，辅助序列可选自SEQ3、SEQ10、SEQ14、SEQ18序列，但不局限于上述序列。辅助序列为特异性序列，与所用毒素蛋白相关，不同毒素蛋白辅助序列不同，根据技术方案5提出的SEQ 6，SEQ13、SEQ17、SEQ21的毒素蛋白，其对应的辅助序列分别为SEQ3、SEQ10、SEQ14、SEQ18，该辅助序列具有帮助毒素蛋白折叠，提高蛋白活性的功能。该功能可使有效毒素蛋白的表达量增加，同时，在DNA片段转录过程中本段序列被切掉，不增加该该融合片段DNA的长度，减少了在通过细胞膜过程中断裂的概率。

[0015] 8、一种具有抗虫效果的DNA片段及其在农业上的应用，其特征在于：所述DNA片段可转录翻译成一种融合蛋白，所述融合蛋白对于靶标昆虫具有杀虫效果。该融合蛋白主要成分为毒素蛋白以及植物凝集素蛋白，使其本来不具有经口活性的毒素蛋白具备了经口的杀虫活性，本融合蛋白可作为杀虫物质的主要成分来进行靶标害虫的防治。

[0016] 9、一种具有抗虫效果的DNA片段及其在农业上的应用，其特征在于：将DNA片段与植物启动子构建的DNA片段组合物转入植物体内表达形成抗性植物，所述抗性植物对靶标昆虫具有一定的抗性。

[0017] 10、根据技术方案8所述的应用，其特征在于：所述植物启动子包括：CaMV35S启动子、泛素启动子、actin启动子、Nos启动子以及特异性表达启动子，其中特异性表达启动子包括：韧皮部特异性启动子RSs1、叶部特异性启动子rbcS启动子。以上植物启动子均为非花表达的启动子，避免了该段DNA片段在植物花部位的表达而造成的花粉逸散，降低了转基因污染的风险。

[0018] 11、根据技术方案9所述的应用，其特征在于：所述植物包括小麦，玉米，烟草，水稻，油菜，高粱，马铃薯，番茄，大麦，豆科作物，棉花。

[0019] 12、根据技术方案8或9所述的应用，其特征在于：所述靶标昆虫的种类包括半翅目昆虫、同翅目昆虫、鳞翅目昆虫、鞘翅目昆虫。

[0020] 13、根据技术方案12所述的应用，其特征在于：所述靶标昆虫具体包括盲蝽蟓、桃蚜、豌豆蚜、棉蚜、麦长管蚜、甘蓝夜蛾以及马铃薯甲虫。

[0021] 综上所述：本发明将蜘蛛毒素蛋白序列和植物凝集素蛋白序列融合成具有杀虫效果的DNA序列的过程，去除壳多糖酶的序列，同样实现了其害虫灭杀的效果，也避免了由于序列过长而造成转入、表达以及发挥作用的不稳定。本发明采用辅助序列与毒素蛋白序列连接，帮助毒素蛋白序列折叠，提高毒素蛋白的活性，同时，该辅助基因不增加转入目标序列的长度，进一步保证了基因表达和发挥作用的稳定性。关于本发明在农业害虫防治上的应用：一、可以将本发明的DNA序列转录翻译成融合蛋白，将融合蛋白作为杀虫剂的主要成分，来进行害虫的防治。二、可将DNA序列转入植物中，从而开发出抗虫性的作物。

附图说明

[0022] 结合以下附图详细描述本发明的示例性实施例，其中：

[0023] 图1为示意性示出本发明所述实施例1的实验结果的电泳图；具体实施方式：

[0024] 通过实施例对本发明作进一步的说明，实施例不应该当作对本发明的限制。

[0025] 实施例1：

[0026] 本发明在陆地棉的植物转化中进行表达选择序列片段1，3，5，7依次连接，形成本发明所述的DNA片段。棉花转基因方法请参考transgenic cotton methods and protocols(edited by Baohong zhang)，以CaMV35S启动子为本发明启动子，连同目的基因构建到载体pCIMBIA2300中，采用农杆菌介导的组织培养法完成转基因过程，该方法非常成熟已经发展为本领域公知，故不在此赘述。选用中棉所23棉花品种的下胚轴为受体材料完成转基因过程。

[0027] 通过卡纳抗性和PCR检测获得阳性棉花植株，选取棉花针叶，提取总蛋白，通过Western Blot技术，检测该蛋白是否在棉花中表达。

[0028] 实验结果如图1所示：

[0029] 结果说明：

[0030] +为蛋白阳性对照，0、1为阳性苗，2为阴性对照以未转基因的原始棉花提蛋白检测。

[0031] 0和1阳性植株检测到了特异蛋白条带，证明转基因成功，本发明在陆地棉的植物转化中成功表达

[0032] 同时，本发明可以与Bt基因协同表达在陆地棉中抗虫，也可以单独表达形成抗虫棉。

[0033] 实施例2：

[0034] 本发明与现有技术的表达量、杀虫效果比较

[0035] 选择序列片段1，10，12，7依次连接，形成本发明所述的DNA片段，标记为片段A。

[0036] 选择序列片段9，12，7依次连接，形成现有技术所述的DNA片段，标记为B。即将植物分泌前导肽和壳多糖酶、蜘蛛毒素和GNA相连。

[0037] 用上述2个片段构建载体进行拟南芥转基因对比。

[0038] 转基因方法：拟南芥转基因方法已经为生物研究领域的成熟方法，故不在此赘述，本实施例参考方法来源于Simplified Arabidopsis Transformation Protocol，Steve Clough and Andrew Bent,University of Illinois at Urbana-Champaign[0039] 转化过程中发现，采用相同转化方法，转化片段A获得365颗转化植株，而转化片段B获得了280颗转化植物，同时，对阳性植株提总蛋白进行Western blot检测目标蛋白发现，片段A的表达量高，目标蛋白表达量占总蛋白的2％，而片段B表达蛋白量仅占蛋白总量的0.3％，两者存在显著差异。

[0040] 筛选出第三代纯合体，分别选择出表达量不同的含有转基因A蛋白的株系A-1(高表达量)，A-2(中等表达量)，A-3(低表达量)，同时如上所述，也选择出表达量不同的含有转基因B蛋白的株系命名为B-1(高表达量)，B-2(中等表达量)，B-3(低表达量)，每个株系采2片叶子，叶柄用湿润的棉花包裹住放在培养皿中，每皿接入20头2龄甘蓝夜蛾，设置3个重复，以野生型拟南芥作为空白对照，观察虫子取食和死亡情况，实验结果如下：

[0041]

[0042] 从上表可以看出，在高表达量、中等表达量以及低表达量的同一表达量的比较，采用本发明转化拟南芥得到的抗虫植物目标蛋白表达量高，对害虫杀虫效果好，害虫的死亡率高，其杀虫效果平均为对比文献得到抗虫植物的效果的1.35倍。

[0043] 分析可能的原因为：1.本发明中辅助序列有效提高了目标蛋白活性，2现有技术将壳多糖酶与植物凝集素同时连接在毒素的两端会极大影响毒素的活性，很难发挥融合蛋白的作用。

[0044] 实施例3:

[0045] 将本发明对应的转基因拟南芥与不含有辅助序列的转基因拟南芥与野生型对比，抗蚜虫效果比较。

[0046] 本发明：选择序列片段1，14，16，7依次连接，形成本发明所述的DNA片段。在拟南芥上开展转化，将获得的T3代植株开展实验，将测得融合蛋白表达量高、中、低三个株系命名为Z-1，Z-2，Z-3；

[0047] 对照1：将上述DNA片段去掉辅助序列即1，16，7依次连接形成的新的DNA片段1用同样方法进行转基因，获得T3代植株，将测得融合蛋白表达量高、中、低三个株系命名为ZWF-1，ZWF-2，ZWF-3；

[0048] 对照2：野生型拟南芥；

[0049] 实验方法：将新生桃蚜若虫20头放在离体叶片上，放置于培养皿中，叶柄插入到含水琼脂培养基的1.5ml离心管。每个处理3个重复，2天更换一次叶片。放在25℃培养箱中，每24小时观察一次，观察记录死亡数量试验重复2次，计算死亡率或校正死亡率。

[0050] 结果如下：

[0051]

[0052]

[0053] 结果显示，应用本发明获得的转基因拟南芥对蚜虫有明显的杀虫作用，通过观察发现，只要取食了本发明的转基因拟南芥，蚜虫活力明显下降，72h后虫子开始死亡，死亡率可达到81.67％。野生型拟南芥处理的害虫平均死亡率为1.11％。

[0054] 而未加入辅助序列的DNA片段转基因所得的拟南芥ZWF-1、ZWF-2、ZWF-3，虽然对蚜虫也具有一定杀虫效果，但72小时死亡虫数、死亡率以及平均死亡率显著低于Z-1、Z-2、Z-3的杀虫效果，说明辅助基因在本发明所构建的DNA片段的杀虫效果方面具有重要的作用，主要是辅助序列具有帮助毒素蛋白折叠，提高蛋白活性的功能。

[0055] 实施例4：

[0056] 目的基因转化到烟草中与野生型烟草对比抗棉铃虫效果

[0057] 本发明：选择序列片段1，18，20，7依次连接，形成本发明所述的DNA片段。在烟草上开展转基因。烟草转基因流程和方法为本领域公知故不在此赘述，将获得转基因阳性苗命名为ZY1-1，ZY1-2，ZY1-3；

[0058] 对照1：野生型三生烟；

[0059] 将两者进行杀虫效果比较，具体实验方法如下：

[0060] 选择转基因烟草顶部或枝顶展开的嫩叶2张，分别放在2个培养皿中，每皿放入3龄幼虫12头，放在28℃培养箱中，每24小时更换一次并观察一次，观察记录死亡数量、存活数量及叶片受损情况，以野生型植株叶片作为阴性对照。试验重复3次，测定虫子体长和死亡率，观察叶片受损情况并记录，结果见下表：

[0061]

[0062] 结果表明：

[0063] 本发明提供的转基因烟草对棉铃虫有很强的驱避作用，并在一定程度上有阻碍棉铃虫生长作用。本发明处理的棉铃虫几乎100％观察发现都不在叶片上趴着，都爬在皿其他位置。虽然与BT文献报道的杀棉铃虫效果有一定差距，但在田间趋避作用也能很好的帮助植物免受害虫危害，从叶片受损程度可以看出来。同时本发明中我们也建议可连接BT基因一起开展转基因。