本发明涉及一种经血宁胶囊的质量检测方法，属于中药技术领域。包括用薄层色谱法鉴别定性其主要成分白背叶和扶芳藤；用紫外‑分光光度法测定经血宁胶囊中总黄酮的含量；用高效液相色谱法测定山奈酚‑3,7‑二鼠李糖苷和芹菜素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量，总黄酮含量（以无水芦丁计）每粒经血宁胶囊（0.35g）含量不低于56mg，山奈酚‑3,7‑二鼠李糖苷和芹菜素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量每粒不低于0.30mg和4.5mg，本方法首次使用定性鉴别和定量检测的方法对经血宁胶囊进行检测，保证了质量检测标准的准确性、先进性和有效性。
1.一种经血宁胶囊的质量检测方法，其特征在于：包括以下三种检测过程：（1）用薄层色谱法鉴别定性；（2）用紫外-分光光度法测定总黄酮中芦丁成分的含量；（3）用高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷两种成分的含量；
取本品内容物2g，置50ml圆底烧瓶中，加水4ml，搅拌，制成流动膏状物，加乙酸乙酯
20ml，70℃水浴回流2小时，放冷过滤，将滤液移至分液漏斗，吸取上层乙酸乙酯层，浓缩至
取扶芳藤对照药材2g，加70%乙醇30ml，置水浴上加热回流1小时，滤过，药渣用70%乙醇洗3次，每次10ml，合并乙醇溶液，蒸干，残渣加30ml水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇1ml使之溶解，制成扶芳藤对照药材溶液，备用；
取白背叶对照药材1g，按“扶芳藤对照药材溶液的制备方法”制成白背叶对照药材溶液，备用；
取山奈酚-3，7-二鼠李糖苷、山奈酚-3, 7-(4′-乙酰基)-O-α-L-二鼠李糖苷和芹菜素-
7-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液，备用；
薄层色谱法试验：按中国药典2010版 附录VI B试验，吸取供试品溶液10μl、上述两种对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-乙酸体积比=40∶10∶0.1为展开剂展开，取出晾干；在254nm紫外灯下观察；在供试品色谱中，与对照品及对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；
所述紫外-分光光度法测定总黄酮以芦丁计含量的方法如下：a对照品溶液的制备
取干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，制成每1ml含0.3mg的芦丁标准品溶液；精密量取10ml溶液，置50ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得，此时，每1ml含无水芦丁60μg；
分别精密吸取芦丁对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟；以相应试剂为空白，立即按照《中国药典》2010年版一部，附录VA中记载的紫外-可见分光光度法，在
420nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；
取本品内容物0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇7ml，置水浴上微热，并时时振摇30分钟，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀；精密量取溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟，离心取上清液作供试品溶液，备用；另取本品内容物0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，作为空白溶液，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品总黄酮的含量；每粒经血宁胶囊0.35g含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，不得少于56.0mg；
所述高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量方法如下：a色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇=10：2 (V/V) 为流动相A；水-磷酸=
100：0.05 (V/V) 为流动相B，按如下方式进行梯度洗脱：
检测波长为340 nm，理论塔板数按山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷计算应不低于3000；
分别精密称取对照品山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷8.8mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷
2.5mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，分别制成每1ml中含0.88mg和0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
c供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加
60%甲醇25ml，称定重量，水浴回流30分钟，放冷，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得；
每粒经血宁胶囊，重量0.35g，含扶芳藤以山奈酚-3，7-二鼠李糖苷（C27H30O16）计，不少于0.30mg;，每粒经血宁胶囊，重量0.35g，含白背叶以芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷计，不少于
一种经血宁胶囊的质量检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药组合物制剂的质量检测方法，特别涉及经血宁胶囊的质量检测方法。
背景技术
[0002] 经血宁胶囊是由广西金秀圣堂药业有限责任公司生产的中成药，国药准字B20020057。其主要功效为：祛瘀止血；适用于瘀血阻滞症月经过多，经色紫黑有块，腹痛拒按等症；也可用于轻中度消化道出血的辅助治疗；也可用于轻中度消化道出血的辅助治疗。其由白背叶、扶芳藤二味药材经加工制成中药胶囊制剂，广西金秀圣堂药业有限责任公司和广西大学化学化工学院在文献《经血宁颗粒的质量控制标准物质的筛选》一文（大众科技；2014年2月总第16卷174期）中确立了经血宁颗粒的质量控制标准， 作者：许子竞，唐艳秀，庞国。该经血宁颗粒以其中的主要原料之一白背叶，经分离纯化得到化合物Ⅰ，通过定性鉴定为黄酮苷类；HPLC检测为单一纯化合物；MS测定化学分子量为564；H NMR和C NMR数据分析与Corymboside一致，为伞房决明苷，分子式为C26H28O14故以化合物Ⅰ作为经血宁颗粒的质量控制标准物质。
[0003] 但单纯以其中原料之一来定性或检测经血宁胶囊，并作为主要质量控制标准还存在诸多问题，发明人通过对经血宁胶囊的物化性质分析，同步定性鉴别白背叶和扶芳藤，并结合紫外-分光光度法和高效液相色谱对其含有的有效物质进行含量检测，可以有效控制经血宁胶囊产品的质量。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能全面定性、定量检测药物成分的经血宁胶囊质量检测方法，本方法具有检测手段简单、检测结果更加准确、可靠的特点。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 经血宁胶囊的质量检测方法，包括以下三种过程：用薄层色谱法鉴别定性；用紫外-分光光度法测定总黄酮（以芦丁计）成分的含量；用高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷两种成分的含量。
[0007] （1）采用薄层色谱法鉴别扶芳藤、白背叶的方法：扶芳藤以山奈酚-3，7-二鼠李糖苷（C27H30O16）计（还包括山奈酚-3, 7-(4′-乙酰基)-O-α-L-二鼠李糖苷），白背叶以芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷计。
[0008] a供试品溶液制备：
[0009] 取本品内容物2g，置50ml圆底烧瓶中，加水4ml，搅拌，制成流动膏状物，加乙酸乙酯20ml，70℃水浴回流2小时，放冷，将滤液移至分液漏斗，吸取上层乙酸乙酯层，浓缩至4ml，备用；
[0010] b对照溶液制备：
[0011] 取扶芳藤对照药材2g，加70%乙醇30ml，置水浴上加热回流1小时，滤过，药渣用70%乙醇洗3次，每次10ml，合并乙醇溶液，蒸干，残渣加30ml水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇1ml使之溶解，制成扶芳藤对照药材溶液，备用；
[0012] 取白背叶对照药材1g，按“扶芳藤对照药材溶液的制备方法”制成白背叶对照药材溶液，备用；
[0013] 取山奈酚-3，7-二鼠李糖苷、山奈酚-3, 7-(4′-乙酰基)-O-α-L-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液，备用；
[0014] 薄层色谱法试验：按（中国药典2010版 附录VI B）试验，吸取供试品溶液10μl、上述两种对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-乙酸（40∶10∶0.1）为展开剂展开，取出晾干；在紫外灯（254nm）下观察；在供试品色谱中，与对照品及对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；
[0015] （2）紫外-分光光度法测定总黄酮（以芦丁计）含量：
[0016] a对照品溶液的制备
[0017] 取干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，制成每1ml含0.3mg的芦丁标准品溶液；精密量取10ml溶液，置50ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含无水芦丁60μg）；
[0018] b标准曲线绘制
[0019] 分别精密吸取芦丁对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟；
以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部，附录VA），在
420nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线；
[0020] c供试品溶液制备
[0021] 取本品内容物0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇7ml，置水浴上微热，并时时振摇30分钟，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀；精密量取溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟，离心取上清液作供试品溶液，备用；另取本品内容0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，作为空白溶液，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品总黄酮的含量；每粒经血宁胶囊（0.35g）含总黄酮以无水芦丁计，不得少于56.0mg；
[0022] （3）高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量：
[0023] a色谱条件
[0024] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇=10：2 (V/V) 为流动相A；水-磷酸=100：0.05 (V/V) 为流动相B，按如下方式进行梯度洗脱：
[0025]时间(min) A B
0 16 84
25 20 80
50 40 60
80 80 20
[0026] 检测波长为340 nm，理论塔板数按山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷计算应不低于3000；
[0027] b对照品溶液的制备
[0028] 分别精密称取对照品山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷8.8mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷2.5mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，分别制成每1ml中含0.88mg和0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
[0029] c供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇25ml，称定重量，水浴回流30分钟，放冷，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得；
[0030] d测定法
[0031] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0032] 每粒经血宁胶囊（0.35g）含扶芳藤以山奈酚-3，7-二鼠李糖苷（C27H30O16）计，不少于0.30mg;，每粒经血宁胶囊（0.35g）含白背叶以芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷计，不少于4.5mg。
[0033] 本发明还对扶芳藤和白背叶有效成分含量测定方法的方法学进行了考察，结果如下：
[0034] （1）线性关系：精密量取山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷对照品母液（0.88mg/ml）和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品母液（0.25mg/ml）0.25，0.5，1，2，5ml，置于10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。按本发明的方法，注入高效液相色谱仪中，测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰面积。以进样量（m）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷：A=153.8m-126.4，r=0.9997；芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷：A=2001.7m-2038.3，r=0.9994，说明山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷在0.22-4.4mg/ml浓度下线性关系良好，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷在0.0625mg-1.25mg/ml浓度下线性关系良好。
[0035] （2）精密度试验：取浓度为0.88mg/ml的山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和浓度为0.25mg/ml芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的对照样品溶液，各精密吸取10ul，注入液相色谱仪，测定两个有效成分的峰面积，连续测定6次，结果见下表1。
[0036] 表1山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷精密度试验结果
[0037]
[0038] 表2芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷精密度试验结果
[0039]
[0040] 以上结果表明，本方法精密度良好。
[0041] （3）稳定性试验：取本品供试品溶液，每隔一定时间，注入液相色谱仪，测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰面积，结果见表3和表4。
[0042] 表3 山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷稳定性试验结果
[0043]
[0044] 表4 芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷稳定性试验结果
[0045]
[0046] 以上结果表明，样品在4小时内稳定，本方法稳定性良好。
[0047] （4）重现性试验：取本品5份，按本发明方法测定，结果见表5。
[0048] 表5 山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷重现性试验结果
[0049]
[0050] 表6 芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷重现性试验结果
[0051]
[0052] 以上结果表明，本方法重现性良好。
[0053] （5）回收率试验：精密量取本品2ml，精密加入对照品母液适量，按本发明方法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量，按下式计算回收率，结果见表7。
[0054] 回收率=（测得量-已知量）/加入量*100
[0055] 表7 山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷回收率试验结果
[0056]
[0057] 表8芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果
[0058]
[0059] 以上结果表明，本方法回收率良好。
[0060] （6）阴性干扰试验：取不含扶芳藤和白背叶药材制成的阴性对照品，按本发明方法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积，结果表明无干扰。
[0061] （7）样品测定：取本品5批，按本发明方法，测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量，结果见表
[0062] 表9 5批清浊祛毒丸中有效成分含量测定结果
[0063]
[0064] 本发明有益效果是： 使用薄层鉴别方法鉴别白背叶和扶芳藤两种有效成分，使用紫外-分光光度测定总黄酮含量，以无水芦丁含量计；使用高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量，方法简便、结果准确，重现性好。现有文献中标准中只是对白背叶进行了定性鉴别，而没有对其进行定量检测，局限性大，难于控制经血宁胶囊的质量，本发明建立了从定性、定量两方面对经血宁胶囊中的主要成分白背叶和扶芳藤进行质量控制，大大提高了质量控制的准确性。通过以上检测项目对药品质量进行了有效的控制，具有稳定、快速、灵敏、可靠的特点，进一步确保产品内在质量，对促进产品销售，保证患者用药安全意义重大。
具体实施方式
[0065] 实施例1
[0066] 采用以下质量检测方法对经血宁胶囊进行质量控制。
[0067] （1）采用薄层色谱法鉴别扶芳藤、白背叶：
[0068] a供试品溶液制备：
[0069] 取经血宁胶囊内容物2g，置50ml圆底烧瓶中，加水4ml，搅拌，制成流动膏状物，加乙酸乙酯20ml，70℃水浴回流2小时，放冷，将滤液移至分液漏斗，吸取上层乙酸乙酯层，浓缩至4ml，备用。
[0070] b对照溶液制备：
[0071] 取扶芳藤对照药材2g，加70%乙醇30ml，置水浴上加热回流1小时，滤过，药渣用70%乙醇洗3次，每次10ml，合并乙醇溶液，蒸干，残渣加30ml水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇1ml使之溶解，制成扶芳藤对照药材溶液，备用。
[0072] 取白背叶对照药材1g，按“扶芳藤对照药材溶液的制备方法”制成白背叶对照药材溶液，备用。
[0073] 取山奈酚-3，7-二鼠李糖苷、山奈酚-3, 7-(4′-乙酰基)-O-α-L-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液，备用。
[0074] 薄层色谱法试验：按（中国药典2010版 附录VI B）试验，吸取供试品溶液10μl、上述两种对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-乙酸（40∶10∶0.1）为展开剂展开，取出晾干；在紫外灯（254nm）下观察。
[0075] 结果如下：在供试品经血宁胶囊色谱中，与对照品及对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；无干扰，无拖尾现象。
[0076] （2）紫外-分光光度法测定总黄酮（以芦丁计）含量：
[0077] a对照品溶液的制备
[0078] 取干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，制成每1ml含0.3mg的芦丁标准品溶液；精密量取10ml溶液，置50ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含无水芦丁60μg）。
[0079] b标准曲线绘制
[0080] 分别精密吸取芦丁对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟；
以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部，附录VA），在
420nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0081] c供试品溶液制备
[0082] 取经血宁胶囊，批号2014010130批抽样检测，取内容物0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇7ml，置水浴上微热，并时时振摇30分钟，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀；精密量取溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/L三氯化铝溶液2ml、1mol/L醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30分钟，离心取上清液作供试品溶液，备用；另取本品内容
0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，作为空白溶液，依法测定吸光度，从标准曲线上读出样品总黄酮的含量。
结果如下：
[0083] 该批经血宁胶囊含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，为75.0mg；
[0084] （3）高效液相色谱法测定山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量：
[0085] a色谱条件
[0086] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇=10：2 (V/V) 为流动相A；水-磷酸=100：0.05 (V/V) 为流动相B，按如下方式进行梯度洗脱：
[0087] 0min： A-B为16：84；
[0088] 25min： A-B为20：80；
[0089] 50min：A-B为40:60；
[0090] 80min：A-B为80:20；
[0091] 检测波长为340 nm，理论塔板数按山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷计算应不低于3000。
[0092] b对照品溶液的制备
[0093] 分别精密称取对照品山奈酚-3, 7-二鼠李糖苷8.8mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷2.5mg，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，分别制成每1ml中含0.88mg和0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
[0094] c供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇25ml，称定重量，水浴回流30分钟，放冷，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。
[0095] d测定法
[0096] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0097] 每粒经血宁胶囊（0.35g）含扶芳藤以山奈酚-3，7-二鼠李糖苷计，不少于0.30mg;，每粒经血宁胶囊（0.35g）含白背叶以芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷计，不少于4.5mg。发明人按照以上方法还对从2012年-2014年生产的经血宁胶囊进行了抽检，结果如下：
[0098] 2012-2014年经血宁胶囊不同批次抽检含量测定结果
[0099]
[0100] 可以看出，通过对2012-2014年不同批次生产的经血宁胶囊进行含量检测，可以有效保证产品质量，经反复试验，该质量检测方法专属性、重复性好，因此做为经血宁胶囊的质量控制定性检测方法，对经血宁胶囊进行质量控制。
