一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法

摘要

本发明公开了一种制备聚乙二醇‑蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，属于生物医用材料领域。通过光交联聚乙二醇水凝胶包敷鸡蛋膜蛋白质纤维制成复合材料，进一步利用分子交联剂(如戊二醛)交联而制备复合层状人工心脏瓣膜。本发明通过光交联法制得聚乙二醇水凝胶不仅保证了人工瓣膜材料的一体性，而且保护了包敷的蛋白质纤维阻止其体内被酶解降解，且防止人工瓣膜的钙化。该方法所制备的人工心脏瓣膜材料模仿了人体主动脉瓣的层状结构，实现了与其相近的力学性能，同时保证了良好的生物相容性，可满足置换受体对瓣膜耐久性强、组织相容性良好及无需终生抗凝血的需求。

权利要求

1.一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：该方法首先通过光交联方法制备聚乙二醇水凝胶包敷蛋白质纤维的层状复合材料，然后利用分子交联剂进行化学交联，获得所述聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜；该方法具体包括如下步骤：(1)PEGDA的制备：由聚乙二醇与丙烯酰氯经化学反应合成并纯化制备聚乙二醇双丙烯酸酯，即PEGDA；

(2)鸡蛋膜的预处理：将清洁后的鸡蛋膜浸泡在PBS溶液中并置于4℃冰箱中储存，光交联前将鸡蛋膜剪裁成所需形状和尺寸的样品，并置于PEGDA预成胶溶液中浸泡30分钟以上；

(3)制备所需尺寸与厚度的PDMS模板，在PDMS模板中央挖空一个与鸡蛋膜样品相同形状和尺寸的空白区域，将该PDMS模板放在一片有 涂层的载玻片上，然后在PDMS模板上的空白区域内放置预处理后的鸡蛋膜样品，样品上再补充PEGDA预成胶溶液将PDMS模板中央空白区域填满，再在PDMS模板上面盖上另一片有 涂层的载玻片密封；

(4)利用冷白光或紫外光交联直至形成聚乙二醇水凝胶包敷鸡蛋膜的复合层状材料；

(5)将步骤(4)所得复合层状材料浸泡在分子交联剂溶液中，化学交联后即获得聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜。

2.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：步骤(2)中，鸡蛋膜的清洁过程为：去除生鸡蛋中的蛋黄和蛋清，从鸡蛋气室处将鸡蛋膜与蛋壳剥离后，使用去离子水清洗；然后使用酸液浸泡方法去除鸡蛋膜上残留的碳酸钙颗粒，再用去离子水清洗干净。

3.根据权利要求2所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：使用酸液浸泡方法去除鸡蛋膜上的CaCO3颗粒时，所采用的酸液为浓度1-8mol/L的醋酸溶液，处理时间为2-12小时，处理温度为4℃。

4.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述PEGDA预成胶溶液中，用于冷白光交联的PEGDA预成胶溶液是含质量百分比10-30％PEGDA、体积百分比1-2％三乙醇胺、10μmol/L曙红和体积百分比0.375％N-乙烯基吡咯烷酮的PBS溶液；用于紫外光交联的PEGDA预成胶溶液是含3g/L Irgacure2959的PBS溶液。

5.根据权利要求1或4所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：步骤(4)中，若采用冷白光交联，交联时间为1-2分钟；若采用紫外光交联，交联时间为10-30分钟。

6.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：步骤(3)中，PDMS模板厚度0.3-1mm，PDMS模板的厚度由所采用鸡蛋膜的层数决定。

7.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述分子交联剂溶液为戊二醛溶液，戊二醛溶液质量百分比浓度为0.25-

2％，利用1mol/L的NaHCO3溶液调节溶液pH＝8；化学交联时间为2-12小时。

8.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：所制备复合人工心脏瓣膜的厚度由所用鸡蛋膜的层数和PEGDA水凝胶的体积决定，根据需求制成厚度为0.3-1mm；所制备复合人工心脏瓣膜的力学强度由所用鸡蛋膜的层数、PEGDA水凝胶的体积和浓度决定。

9.根据权利要求1所述的制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，其特征在于：所制备复合人工心脏瓣膜的弹性模量≥3.3MPa，延伸率大于35％。

说明书

一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法。

背景技术

[0002] 心脏瓣膜疾病是危及人类健康的一种重要疾病，心脏瓣膜的钙化及纤维化导致左心室流出道梗塞和主动脉瓣重度狭窄，至今未有任何外科手术及药物可治愈钙化瓣膜病变等疾病，唯一可行的办法是瓣膜置换，现在应用于临床的人工瓣膜包括机械瓣膜和生物瓣膜。然而机械瓣膜置换术后需终生服用抗凝血药物，否则会出现血栓等并发症。考虑到机械瓣膜植入体内会引起不良反应，生物瓣膜于20世纪70年代产生并逐渐发展起来。现在，可行的生物心脏瓣膜有以下几种类型：猪异种瓣膜、牛心包瓣膜、同种异体瓣膜(也叫同种移植，来源于捐赠人)和自身移植物(源于自体患者的组织)。同种异体移植和异种移植能够诱发纤维组织的生长，可以将阻塞性血栓的发病率控制在0.2-1.8％之间，将瓣膜功能性障碍疾病发病率控制在2～4％之间。但随着移植时间的增加，生物瓣膜极易发生衰败和钙化，平均寿命仅为7-20年，特别是对于青少年移植受体人群而言，将面临着多次手术的痛苦。因此，需要研制具有更好的结构和生物性能的人工瓣膜，以满足置换受体对瓣膜耐久性强、组织相容性良好及无需终生抗凝血的需求。

发明内容

[0003] 本发明的目的是针对当前临床上常用的人工机械瓣膜需终生服用抗凝药及生物瓣膜的钙化和免疫排斥等问题，提供一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，利用力学性能优良的鸡蛋膜蛋白质纤维和生物相容性良好的聚乙二醇为原材料制备复合层状人工心脏瓣膜，并可通过调节蛋膜的层数、聚乙二醇溶液的体积和浓度来控制复合层状人工心脏瓣膜的厚度和强度，具有重要的临床应用价值。

[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

[0005] 一种制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜的方法，该方法是以鸡蛋膜和聚乙二醇为原材料，首先通过光交联方法制备聚乙二醇水凝胶包敷蛋白质纤维的层状复合材料，然后利用分子交联剂进行化学交联，获得所述聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜。该方法具体包括如下步骤：

[0006] (1)PEGDA的制备：由聚乙二醇(poly(ethylene glycol)，简写PEG)与丙烯酰氯经化学反应合成并纯化制备可光交联的聚乙二醇双丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)diacrylate，简写PEGDA)；

[0007] (2)鸡蛋膜的预处理：将清洁后的鸡蛋膜浸泡在PBS溶液中并置于4℃冰箱中储存，光交联前将鸡蛋膜剪裁成所需形状和尺寸的样品，并置于PEGDA预成胶溶液中浸泡30分钟以上；

[0008] (3)制备所需尺寸与厚度的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板，在PDMS模板中央挖空一个与鸡蛋膜样品相同形状和尺寸的空白区域，将该PDMS模板放在一片有 涂层的载玻片上，然后在PDMS模板上的空白区域放置预处理后的鸡蛋膜样品，样品上再补充PEGDA预成胶溶液将PDMS模板中央空白区域填满，在PDMS模板上面盖上另一片有涂层的载玻片密封；

[0009] (4)利用冷白光或紫外光交联，鸡蛋膜表面的PEGDA预成胶溶液交联形成PEG水凝胶，最终形成PEG水凝胶包敷鸡蛋膜的复合层状材料；若采用的冷白光交联，交联时间为1-2分钟；若采用紫外光交联，交联时间为10-30分钟。

[0010] (5)将步骤(4)所得复合层状材料浸泡在分子交联剂(如戊二醛)溶液中，化学交联后即获得聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜。

[0011] 上述步骤(2)中，鸡蛋膜的清洁过程为：去除生鸡蛋中的蛋黄和蛋清，从鸡蛋气室处将鸡蛋膜与蛋壳剥离后，使用去离子水清洗；然后使用酸液浸泡方法去除鸡蛋膜上残留的碳酸钙(CaCO3)颗粒，再用去离子清洗干净。使用酸液浸泡方法去除鸡蛋膜上的CaCO3颗粒时，所采用的酸为浓度1-8mol/L的醋酸溶液，处理时间为2-12小时，处理温度为4℃；采用该工艺保证酸处理后鸡蛋膜蛋白质纤维能够完好保存下来，并且力学性能不受影响。

[0012] 上述步骤(2)中，将步骤(1)得到的PEGDA先制备成PEGDA预成胶溶液，所制备的PEGDA预成胶溶液中，用于冷白光交联的PEGDA预成胶溶液是含质量百分比10-30％PEGDA(分子量1000-3400g/mol)、体积百分比1-2％三乙醇胺(triethanolamine，简写TEOA)、10μmol/L曙红(Eosin Y)和体积百分比0.375％N-乙烯基吡咯烷酮(N-vinylpyrrolidone，简写NVP)的PBS溶液；用于紫外光交联的PEGDA预成胶溶液是含3g/L Irgacure2959(2-hydroxy-40-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophe-none)的PBS溶液。

[0013] 上述步骤(3)中，制作PDMS模板的厚度由所采用鸡蛋膜的层数决定(单层鸡蛋膜的厚度为60-100μm)，PDMS模板厚度0.3-1mm。

[0014] 上述步骤(5)中，所述分子交联剂为戊二醛溶液，戊二醛质量百分比浓度为0.25-2％；化学交联时间为2-12小时。

[0015] 本发明设计原理如下：

[0016] 本发明通过光交联聚乙二醇水凝胶包敷鸡蛋膜蛋白质纤维制成复合材料，进一步利用分子交联剂(如戊二醛)交联而制备复合层状人工心脏瓣膜。本发明以鸡蛋膜和聚乙二醇为原料，其中鸡蛋膜来源丰富，由蛋白质纤维组成；而聚乙二醇是较为常用的具有良好生物相容性和生物惰性的高分子材料，另外通过光交联法制得聚乙二醇水凝胶不仅保证了人工瓣膜材料的一体性，而且保护了包敷的蛋白质纤维阻止其体内被酶解降解，且防止人工瓣膜的钙化。此外，可通过改变包覆的鸡蛋膜数量以及聚乙二醇水凝胶的浓度和体积来控制瓣膜材料的厚度和强度，以满足不同患者的个体需求。该种方法所制备的人工心脏瓣膜材料模仿了人体主动脉瓣的层状结构，实现了与其相近的力学性能，同时保证了良好的生物相容性，可满足置换受体对瓣膜耐久性强、组织相容性良好及无需终生抗凝血的需求。

[0017] 与现有心脏瓣膜制备技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0018] 1、本发明以鸡蛋膜作为内层材料实现与人体瓣膜相似的机械性能；外层包敷PEGDA水凝胶提供良好的生物相容性和生物惰性，且保护内层的蛋白质纤维不被酶降解。

[0019] 2、本发明提出的聚乙二醇-蛋白质纤维复合人工心脏瓣膜，可以克服现有机械瓣需要终生使用抗凝药以及生物瓣膜体内降解和钙化等问题。

[0020] 3、本发明可以实现依据所加蛋膜层数和聚乙二醇溶液体积来制备不同厚度和强度的复合层状人工心脏瓣膜。所制备瓣膜材料的厚度可以根据需求制成厚度为0.3-1mm。所制备瓣膜材料的力学强度由所加入的鸡蛋膜的层数、PEGDA水凝胶的体积和浓度决定。所制备瓣膜材料的弹性模量≥3.3MPa，延伸率大于35％。

附图说明

[0021] 图1为原始鸡蛋膜的蛋白质纤维的扫描电镜照片；其中：(a)为鸡蛋膜外层；(b)为鸡蛋膜内层。

[0022] 图2为PDMS模版法制备聚乙二醇-蛋白质纤维复合层状结构示意图。

[0023] 图3为采用4层鸡蛋膜与质量百分比浓度为20％PEGDA溶液制备600μm厚的聚乙二醇-蛋白质纤维复合层状材料(分子交联剂处理前)。

[0024] 图4为采用4层鸡蛋膜与质量百分比浓度为20％PEGDA溶液制备600μm厚的人工心脏瓣膜(分子交联剂处理后)。

[0025] 图5为4层鸡蛋膜与质量百分比浓度为20％PEGDA溶液制备600μm厚的人工心脏瓣膜经戊二醛交联后在小鼠皮下包埋2周后周围组织切片的HE染色照片；其中：(a)为4倍放大图；(b)为10倍放大图。

[0026] 图6为4层鸡蛋膜与质量百分比浓度为20％PEGDA溶液制备400μm厚的人工心脏瓣膜经戊二醛交联后及在I型胶原酶中浸泡2周之后的弹性模量。

具体实施方式

[0027] 下面结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步说明。

[0028] 本发明是以鸡蛋膜和聚乙二醇为原材料，蛋膜是由富含胶原蛋白和角蛋白的纤维组成的网状膜结构。通过将蛋膜的蛋白质纤维与聚乙二醇水凝胶复合制备人工心脏瓣膜。本发明主要工艺流程为：蛋膜原材料→去除CaCO3颗粒→PDMS模版制作→鸡蛋膜纤维与PEGDA水凝胶光交联→分子交联剂化学交联→人工心脏瓣膜。具体过程如下：由聚乙二醇(PEG，平均分子量3350g/mol)与丙烯酰氯反应制备聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)[Zhang X,Xu B,Puperi DS,Yonezawa AL,Wu Y,Tseng H,Cuchiara ML,West JL,Grande-Allen KJ.Integrating Valve-Inspired Design Features Into Poly(ethylene glycol)Hydrogel Scaffolds for Heart Valve Tissue Engineering.Acta Biomaterialia 
2015；14:11-21.]。去除生鸡蛋中的蛋黄和蛋清，从鸡蛋气室处将鸡蛋膜小心剥离，去离子水清洗3次，将蛋膜浸泡在醋酸溶液去除蛋膜上的CaCO3颗粒(保存了鸡蛋膜原始蛋白质纤维结构，图1)，4℃下储存于PBS溶液中。光交联前将上述鸡蛋膜浸泡于PEGDA溶液中30分钟以上。采用常规方法制备不同厚度(0.3-1mm)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板[Mata A,Fleischman AJ,Roy S.Characterization of Polydimethylsiloxane(PDMS)Properties for Biomedical Micro/Nanosystems.Biomedical Microdevices 2005；7:281-293.]，在PDMS模板中央挖空一个半圆形区域，将PDMS模板放在一片有 涂层的玻璃载玻片上，在中空区域内放入已经处理好的鸡蛋膜，并滴加PEGDA预成胶溶液，然后在上面加盖另一个 涂层[Diaz ME,Cerro RL.Transition fromsplit streamlines to dip-coating during Langmuir-Blodgett film deposition.Thin Solid Films 2004；460:
274-278.]的载薄片并密封(图2)，用冷白光源或紫外光源照射交联得到聚乙二醇－蛋白质纤维复合层状材料(图3)，最后将得到的复合层状材料在4℃下用戊二醛溶液中化学交联，去PBS溶液清洗3次，得到人工心脏瓣膜(图4)。

[0029] 实施例1

[0030] 原材料及要求：新鲜鸡蛋膜、聚乙二醇、丙烯酰氯、三乙醇胺(TEOA)、曙红(Eosin Y)、PBS溶液、乙醇、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、40％亚硫酸氢钠溶液、超纯水(化学试剂均为分析纯)。

[0031] PEGDA合成：由聚乙二醇(PEG)与丙烯酰氯反应制备聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)；

[0032] 蛋膜处理：去除生鸡蛋中的蛋黄和蛋清，从鸡蛋气室处将鸡蛋膜小心剥离，去离子水清洗3次，将蛋膜浸泡在浓度为8mol/L的醋酸中，4℃处理12小时，去离子水清洗3次。之后剪取直径12mm半圆形样品，常温浸泡于质量百分比浓度为20％的PEGDA白光预成胶溶液中30分钟；

[0033] PDMS模板制作：常规方法制备0.6mm厚的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板，在PDMS模板中央挖空一个直径12mm的半圆状模型；

[0034] 光交联反应：将PDMS模板放在一有 涂层的玻璃载玻片上，在中空区域内放入已经处理好的8层鸡蛋膜，滴入少量PEGDA白光预成胶溶液至模板中空区域全部充满，上面加盖另一片有 涂层的载玻片密封，用冷白光源照射90秒；

[0035] 分离清洗：小心从模板上分离复合层状人工心脏瓣膜材料，去PBS溶液浸泡清洗3次；

[0036] 分子交联剂化学交联：将复合层状人工心脏瓣膜材料在4℃、质量百分比浓度为0.5％的戊二醛溶液(利用1mol/L的NaHCO3溶液调节溶液pH＝8)中交联6小时，利用质量百分比40％的亚硫酸氢钠溶液清洗3次，再用PBS溶液清洗3次去除过剩的分子交联剂，得到人工心脏瓣膜。

[0037] 实施例2

[0038] 本例将在PDMS模板中制备尺寸为12mm(直径)×0.6mm(厚度)的半圆状模型的，选取6层处理好的鸡蛋膜填充PDMS模板，其余同实施例1。静态拉伸试验测得人工心脏瓣膜的弹性模量3.43MPa，延伸率达到43％。

[0039] 实施例3

[0040] 本例将在PDMS模板中制备尺寸为12mm(直径)×0.6mm(厚度)的半圆状模型的，选取4层处理好的鸡蛋膜填充PDMS模板，其余同实施例1。静态拉伸试验测得人工心脏瓣膜的弹性模量3.30MPa，延伸率达到35％。

[0041] 实施例4

[0042] 本例将选取4层处理好的鸡蛋膜填充PDMS模板，其余同实施例1。将上述制备的样品切成5mm x 5mm x 0.6mm样品后植入到小鼠背部皮下，并未观察到排异现象，2周后对植入部分组织切片HE染色(图5)也未观察到炎性细胞，这些结果说明上述人工心脏瓣膜材料具有良好的生物相容性。

[0043] 实施例5

[0044] 本例将在PDMS模板中制备尺寸为12mm(直径)×0.4mm(厚度)的半圆状模型的，选取4层处理好的鸡蛋膜填充PDMS模板，其余同实施例1。通过将上述人工心脏瓣膜在1mg/mL的I型胶原酶(活力201u/mg)溶液中浸泡2周，实验结果(图6)显示酶解前后样品弹性模量并无显著性差异(酶解前弹性模量3.71MPa，酶解后弹性模量3.56MPa)，证明所制备的人工瓣膜具有抵抗酶降解的能力。所得人工心脏瓣膜延伸率达到45％。

[0045] 实施例6

[0046] 本例使用的PEGDA预成胶溶液质量百分比浓度为30％，其余同实施例1。

[0047] 实施例7

[0048] 本例使用的PEGDA预成胶溶液质量百分比浓度为30％，其余同实施例3。