一种副溶血弧菌噬菌体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种副溶血弧菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品及水产品养殖环境中的杀菌应用。分离的副溶血弧菌噬菌体命名为vB_VpaP_OW（保藏号CCTCC M 2015577），对副溶血弧菌具有高效的裂解活性，其分离培养物及复配制剂能够作为食品添加剂或环境消毒剂防控食品中副溶血弧菌的污染。

权利要求

1.一种副溶血弧菌噬菌体，其特征在于所述的副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_OW（Vibrio Paraheamolyticus phage vB_VpaP_OW），于中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏地址：武汉 武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2015577；保藏日期：2015年9月28日。

2.根据权利要求1所述的一种副溶血弧菌噬菌体，其特征在于以噬菌体分离物或培养物制成杀菌剂。

3.根据权利要求1或2所述的一种副溶血弧菌噬菌体，其特征在于：将噬菌体、噬菌体的分离物或培养物与赋形剂复配，制成杀菌剂。

4.根据权利要求3所述副溶血弧菌噬菌体菌株，其特征在于：所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶、海藻酸盐。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种副溶血弧菌噬菌体在制备副溶血弧菌杀菌剂的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的噬菌体制备对食品、生产环境或生产器具的消毒的杀菌剂的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的食品为由肉类、蛋类，海产品、粮食或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

说明书

一种副溶血弧菌噬菌体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种副溶血弧菌噬菌体菌株及其作为食品添加成分或环境消毒剂在食品和环境中的抗菌应用，尤其是能够特异性裂解食品中污染的多种副溶血菌的噬菌体的应用。属于生物工程领域。

背景技术

[0002] 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于水产养殖区域中, 是水产养殖中的一种重要条件致病菌, 能引起鱼、虾、蟹和贝类等多种养殖型水产品的疾病，给水产养殖业造成严重的经济损失。副溶血弧菌常见于食物中毒事件中，在细菌性食物中毒中占60%-70%，近年因其引发的食物中毒发生率呈上升趋势，且病原的耐药性显著增强，不仅对人类健康造成严重危害。

[0003] 噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体，例如副溶血弧菌噬菌体可以特异性感染并裂解副溶血弧菌，因而具有杀菌作用。而在食品中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发价值。

发明内容

[0004] 发明目的

[0005] 开发对副溶血弧菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种食源性副溶血弧菌，为目前防控食品中副溶血弧菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

[0006] 技术方案

[0007] 一种副溶血弧菌噬菌体，其特征在于所述的副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_OW Vibrio Paraheamolyticus phage vB_VpaP_OW，于中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2015577；保藏日期：2015年9月28日。

[0008] 形态学特性

[0009] 取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min，用滤纸吸去多余的液体，用2 %的磷钨酸染色30 min  ,干燥后电镜观察。头部对称，直径约为65nm，尾长约为13nm。

[0010] 2.噬菌体基因组核酸类型鉴定

[0011] 根据国际病毒分类委员会2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》中对噬菌体的新分类方法，本发明获得的噬菌体的形态学特征应归于短尾噬菌体科，其DNA鉴定结果显示，该噬菌体为dsDNA，将其命名为副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_OW。

[0012] 在本发明中：所述的噬菌体菌株在30 60℃中放置60min，其活性稳定；在70℃以上~孵育60min，则失活；噬菌体菌株在pH5.0～8.0环境下，其活性稳定；

[0013] 所述的副溶血弧菌噬菌体的制备方法，其特征在于：取2 mL新鲜培养的[0014] 副溶血弧菌过夜培养物，离心，0.5mLLB培养基重悬，加0.1 mL噬菌体、0.2%(w/v)麦芽糖、终浓度1.25mM CaCl2，37 ℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mLLB培养基，37℃静置培养6-8h；取上述培养物以13000×g.min-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。加RNase A、DNaseⅠ至1μg/mL，37℃温育30min；加
9.3g PEG 8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min-120min，去上清液；加2mL SM (1L：NaCl5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1MTris-HCl(pH7.4) 50mL)溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g.min-1离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的副溶血弧菌噬菌体。

[0015] 一种副溶血弧菌噬菌体用于抑制副溶血弧菌是指：将纯化的噬菌体用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的副溶血弧菌污染。

[0016] 一种副溶血弧菌噬菌体的应用，用于抑制副溶血弧菌是指：将纯化的噬菌体作为食品添加剂，在配料时加入纯化的噬菌体，用于防止食品加工以及储存过程中副溶血弧菌的生存和繁殖。

[0017] 一种副溶血弧菌噬菌体的应用中：所述的食品是指：由肉类，或蛋类，或水产品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

[0018] 一种副溶血弧菌噬菌体，用于抑制副溶血弧菌是指：将纯化的噬菌体作为杀菌剂用于水产品养殖区对副溶血弧菌的消杀和抑制。

[0019] 一种副溶血弧菌噬菌体，用于抑制副溶血弧菌是指：将纯化的噬菌体与赋形剂复配后，作为食品中添加成分控制副溶血弧菌污染。所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶、海藻酸盐。

[0020] 有益效果

[0021] 由于采用噬菌体特异性裂解副溶血弧菌可以杀死具有耐药性的副溶血弧菌；由于采用噬菌体特异性裂解副溶血弧菌能够防止副溶血弧菌进化和耐药毒株的产生；由于本发明涉及的噬菌体菌株具有亲水相，通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行消杀；由于本发明涉及的噬菌体菌株没有毒副作用，可以作为食品添加剂，特异性裂解副溶血弧菌，防止副溶血弧菌对食品的污染。

附图说明

[0022] 图1 ：噬菌体单层平板抑菌结果：将宿主菌ATCC 17802 点样于LB 平板，其中A，噬菌体点样组；B，LB点样对照组

[0023] 图2 ：噬菌体电镜照片

[0024] 图3 ：噬菌体温度敏感性检测结果

[0025] 图4 ：噬菌体pH敏感性检测结果

[0026] 图5：噬菌体在鱼片中灭菌检测结果（25℃）

[0027] 图6：噬菌体在环境中灭菌作用检测结果（25℃）

具体实施方式

[0028] 本发明试验用噬菌体宿主菌副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，简称Vp保藏号：ATCC 17802）购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

[0029] SM 溶液配制方法：1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl  (pH7.4) 50mL。

[0030] 本发明所述的副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_OW（拉丁名Vibrio Paraheamolyticus phagevB_VpaP_OW），于中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC；保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2015577；保藏日期：2015年9月28日。

[0031] 实施例1、噬菌体分离制备及纯化

[0032] 噬菌体分离

[0033] 本发明样品采自新鲜牡蛎，将牡蛎去壳并将肉加入SM溶液，室温震荡2-4h，取上清经双层滤纸过滤，3000×g.min-1离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取10mL过滤上清，加入1mL副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，简称Vp）过夜培养物，加入20mLLB培养基，室温作用30min，再放置于37℃，待培养至6～8h后，取上述培养物以13000×g.min-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体原液。

[0034] 将LB平板分为2个区域：吸取宿主菌液0.1mL滴于普通营养琼脂平板正中央，将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取噬菌体原液0.01mL点样；待自然晾干后，置于37 ℃温箱培养10h后，观察点样区域的变化。同时设立对照，对照中仅涂噬菌体原液，以鉴定噬菌体中是否含有宿主菌。

[0035] 取噬菌体原液0.1mL，进行10倍稀释，取102、104和106稀释液各0.1mL与过夜培养的宿主菌液0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约5mL 0.7% LB培养基，混匀后迅速倾倒入LB平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37 ℃培养箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

[0036] 噬菌体纯化

[0037] 取2mL新鲜培养的Vp过夜培养物，离心，0.4mLLB培养基重悬，加0.1mL噬菌体（以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例）。加麦芽糖（0.2%），30℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mLLB培养基，30℃静置培养6-8h；取上述培养物以13000×g.min-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。
加RNase A、DNaseⅠ至1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min-120min，去上清液；加2mL SM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡-1
30s；4℃，3000×g.min 离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体（如图1所示）。

[0038] 噬菌体电镜检测

[0039] 取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl 样本滴在铜网上,待其沉淀15 min，用滤纸吸去多余的液体，用2 %的磷钨酸染色30 min ,干燥后电镜观察。

[0040] 如图2所示，噬菌体vB_VpaP_OW属于短尾噬菌体科，头部对称，直径约为65 nm，尾长约为13 nm。

[0041] 温度及pH对噬菌体的影响

[0042] 取0.1 mL 1×108pfu/mL纯化噬菌体于30℃～90℃水浴分别作用1h，将样品冷却后测其效价；分别取pH3.0～10.0的蛋白胨水和2×108pfu/mL纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。

[0043] 结果如图3所示，噬菌体在30～50℃分别作用1h后，其活性无显著变化；70℃～90℃作用1h后，噬菌体低于可检测水平。

[0044] 结果如图4所示，在pH为3和4时，均检测不到噬菌体；pH为5.0～8.0时，其效价与初始效价无显著性差异；当pH为9.0时，其效价降低了3log，而当pH为10时，检测不到噬菌体。

[0045] 实施例2、噬菌体在食品中的杀菌作用

[0046] 生鱼片，将其切成约面积为2cm×2cm的小块（约1g），将肉块过火焰灭菌；制备5×105cfu/mL副溶血弧菌菌液；制备5×109pfu/mL的噬菌体样品。无菌室温环境下，将宿主菌菌
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液以20μl（1×10cfu/mL）滴于肉块表面，约15min后，滴20μl不同浓度的噬菌体，同时设立宿主菌对照；将制备好的样品分别置于25℃，分别于24h、72h、168h检测宿主菌数量。

[0047] 如图5中所示，25℃作用24h后，与对照组相比较，宿主菌数量下降；72h后，宿主菌数量降低；至168h，宿主菌与对照组呈显著性差异。

[0048] 实施例3、噬菌体在加工器械中的杀菌作用

[0049] 挑取副溶血弧菌单克隆，经过夜培养后，调整期浓度为104cfu/mL，喷洒在加工鱼片等刀具表面；然后将纯化噬菌体以107pfu/mL浓度对刀具实施喷洒消杀，并在喷洒后1h，2h，3h，4h，5h，6h及7h后，检测宿主菌的数量。

[0050] 检测结果如图6显示，107pfu/mL浓度噬菌体实施喷洒消杀后，刀具表面宿主菌显著下降，且在作用7h后，检测不到副溶血弧菌，因此以浓度≥107pfu/mL噬菌体能够有效的杀灭器具表面污染的副溶血弧菌。

[0051] 实施例4、噬菌体安全性实验

[0052] 8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服噬菌体 1010pfu/0.1mL/只；对照组口服等体积PBS。连续口服14d，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。

[0053] 结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。