一种高效联产α-氨基丁酸及二羟基丙酮的策略

摘要

本发明是一种串联甘油脱氢酶及L‑氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α‑氨基丁酸和二羟基丙酮的方法。本发明在于：将甘油脱氢酶基因与L‑氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。同时构建好表达L‑苏氨酸脱氨酶的重组大肠杆菌。高效共表达甘油脱氢酶及L‑氨基酸脱氢酶于大肠杆菌中可以促进辅因子在菌体胞内的循环，不需要添加任何外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用廉价底物L‑苏氨酸及甘油联产高附加值的α‑氨基丁酸和二羟基丙酮，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中该方法所得的α‑氨基丁酸和二羟基丙酮产量分别可达41.2g/L及38.2g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

权利要求

1.一种串联甘油脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮的方法，其特征包括以下内容：

1)将甘油脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a-glydh+Bcldh、pET-28a-glydh+Rjpdh及pET-duet-glydh+Bsadh、pET-duet-glydh+Scvdh，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-glydh+Bcldh/BL21、pET-28a-glydh+Rjpdh/BL21、pET-duet-glydh+Bsadh/BL21、pET-duet-glydh+Scvdh/BL21；

同时将L-苏氨酸脱氨酶ltd基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Seltd/BL21；

2)使用重组大肠杆菌在LB培养基进行诱导培养，然后进行全细胞转化；利用pH7.0的

50mMPB缓冲液洗涤细胞然后将细胞重新悬浮于pH6.0-8.0的50mMPB缓冲液中，在不加入任何辅因子的情况下，加入0.4ML-苏氨酸、0.4M甘油及0.1-1％的增加细胞通透性的表面活性剂，利用添加化学试剂调节使转化的pH保持在6.0-8.0之间，并控制转化的温度在30℃，制备得到α-氨基丁酸和二羟基丙酮。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘油脱氢酶选自：大肠杆菌来源的甘油脱氢酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氢酶选自：芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氨酶选自：大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门氏菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增加细胞通透性的表面活性剂为：

吐温80、甲苯、曲拉通X100、十六烷基三甲基溴化铵即CTAB。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学试剂为碳酸钙、NaOH、或氨水。

说明书

一种高效联产α-氨基丁酸及二羟基丙酮的策略

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种构建甘油脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中共表达，利用该重组大肠杆菌进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸和二羟基丙酮的方法。

背景技术

[0002] α-氨基丁酸是一种重要的化工原料和医药中间体，可以用来合成抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦，备受人们关注。现阶段α-氨基丁酸主要通过化学合成法、酶拆分法及酶转化法来制备，相比于其他两种方法，微生物酶转化法具有可得到较纯手性的产物，条件温和，对环境友好等优点。微生物酶转化法制备α-氨基丁酸主要是通过利用L-氨基酸脱氢酶对酮丁酸进行转氨催化作用完成，研究一直采用L-天冬氨酸提供氨基，但是在转化过程中容易产生其他与α-氨基丁酸性质接近不易分离的副产物如丙氨酸，很难达到要求，可以通过补充铵根离子来解决这个问题。但同时L-氨基酸脱氢酶在对酮丁酸的转化过程中需要辅因子NADH的参与，而辅因子NADH价格昂贵，显然不适用于工业生产中。Degussa公司首次利用基因工程手段将甲酸脱氢酶引入到L-亮氨酸脱氢酶反应体系里，提供辅因子NADH的再生并且将其应用到L-叔亮氨酸的制备中，大大提高了产物的转化率。

[0003] 二羟基丙酮(简称DHA)是一种天然存在的分子式最简单的酮糖，具有良好的生物降解性、可食用性及对人体及环境无害等优点。二羟基丙酮含有几个活泼的基团，可以参与多种反应，因此是一种重要的药物中间体、化工原料及功能添加剂特别是它的防紫外线功能，得到广泛的实际应用。二轻基丙酮的工业化生产主要是利用含有甘油脱氢酶微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的能产甘油脱氢酶的微生物为葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属(Acetobacter)。

[0004] 甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，缩写GlyDH)是一种常见的依赖辅酶的氧化还原酶，在辅因子NAD(P)+等存在时能够快速地催化甘油转化为二羟基丙酮同时生成辅因子NAD(P)H。制备α-氨基丁酸过程所需的NADH可通过甘油脱氢酶催化甘油生成二羟基丙酮来获取，α-氨基丁酸与二羟基丙酮的制备过程构建了一个NAD+与NADH的辅因子循环过程，可以达到高效联产α-氨基丁酸与二羟基丙酮的目的。

发明内容

[0005] 本发明的主要研究内容：本发明在于将不同来源的甘油脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a-glydh+Bcldh、pET-28a-glydh+Rjpdh及pET-duet-glydh+Bsadh、pET-duet-glydh+Scvdh，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-glydh+Bcldh/BL21、pET-28a-glydh+Rjpdh/BL21、pET-duet-glydh+Bsadh/BL21、pET-duet-glydh+Scvdh/BL21。同时将L-苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸及甘油进行转化高效联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮，为α-氨基丁酸及二羟基丙酮的应用提供了一种有效的策略。

[0006] 本发明的技术方案：

[0007] 1.引物的设计

[0008] 根据不同来源的苏氨酸脱氨酶的基因序列设计引物。

[0009] PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamH I)

[0010] PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(Hind III)

[0011] PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamH I)

[0012] PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(Hind III)

[0013] 根据大肠杆菌的甘油脱氢酶的基因序列设计引物。

[0014] PglydhF：5’-CGGGATCCATGGACCGCATTATTCAATC-3’(BamH I)

[0015] PglydhR：5’-CGAGCTCTTATTCCCACTCTTGCAG-3’(Sac I)

[0016] P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)

[0017] PglydhRBglII：5’-GAAGATCTTTATTCCCACTCTTGCAG-3’(Bgl II)

[0018] 根据不同来源的氨基酸脱氢酶的基因序列设计引物。

[0019] PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)

[0020] PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sac I)

[0021] PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)

[0022] PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)

[0023] PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(Kpn I)

[0024] PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Xho I)

[0025] PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(Nde I)

[0026] PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Xho I)

[0027] 2.重组菌的构建

[0028] 以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pET-Duet和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。

[0029] 之后以连上pET-28a的甘油脱氢酶质粒为模板，根据预先设计好的带启动子的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上L-氨基酸脱氢酶的载体pET-28a-ldh和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。

[0030] 以pET-Duet为甘油脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时。先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-氨基酸脱氢酶的基因PCR，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的甘油脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。

[0031] 3.重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮

[0032] 将获得的菌体用pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤两次，再加入pH 6.0-8.0的50mM PB缓冲液重悬，然后于30-42℃不同温度下加入底物L-苏氨酸及二羟基丙酮，以添加一定的化学试剂来控制pH在6.0-8.0之间，以HPLC检测底物α-氨基丁酸的产率，以显色法检测二羟基丙酮的产率。

[0033] 本发明中，所用的甘油脱氢酶选自：但不限于，肠杆菌属的甘油脱氢酶。但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌属来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。所述L-苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。

[0034] 本发明的有益效果：

[0035] α-氨基丁酸和二羟基丙酮是一种重要的化工原料和医药中间体，具有巨大的市场需求。本发明将甘油脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶串联在质粒上于E.coli BL21中的表达，构建了共表达甘油脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的工程菌株，同时结合构建单表达L-苏氨酸脱氢酶的重组E.coli BL21。利用这些重组菌对L-苏氨酸及甘油进行全细胞转化为α-氨基丁酸和二羟基丙酮，转化过程快速高效，且不需要添加任何辅因子，具有重要的工业应用价值。

附图说明

[0036] 无

具体实施方式

[0037] 下面结合实施例对本发明做详细的说明，以下实施例不对本发明产生限制。

[0038] 实施例1：重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh的构建及转化

[0039] [1]以蜡样芽孢杆菌、红球菌的基因组DNA作为模板。

[0040] [2]根据枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶及红球菌的L-苯丙氨酸脱氢酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ldh基因引物。

[0041] PBcldhF：5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)

[0042] PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sac I)

[0043] PRjpdhF：5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)

[0044] PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)

[0045] [3]利用蜡样芽孢杆菌及红球菌的DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[0046] [4]构建重组质粒pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Bcldh/pMD18-T-Rjpdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[0047] [5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0048] 实施例2：重组质粒pET-28a-glydh+Bcldh/pET-28a-glydh+Rjpdh的构建及转化[0049] [1]以大肠杆菌基因组DNA作为模板。

[0050] [2]根据不同来源的甘油脱氢酶基因序列以及pET-28a及pET-duet质粒上的酶切位点设计glydh基因引物。

[0051] PglydhF：5’-CGGGATCCATGGACCGCATTATTCAATC-3’(BamH I)

[0052] PglydhR：5’-CGAGCTCTTATTCCCACTCTTGCAG-3’(Sac I)

[0053] P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)

[0054] PglydhRBglII：5’-GAAGATCTTTATTCCCACTCTTGCAG-3’(Bgl II)

[0055] [3]利用染色体DNA作为模板，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[0056] [4]构建重组质粒pMD18-T-glydh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-glydh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[0057] [5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-glydh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0058] [6]利用[5]提出的质粒pET-28a-glydh作为模板，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min 30s，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[0059] [7]构建重组质粒pMD18-T-promoter+glydh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，转化方法参照实施例[5]，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-pglydh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-
70℃冰箱保藏。

[0060] [8]将[7]中提取的质粒和已经连上L-氨基酸脱氢酶的表达载体pET-28a-Bcldh/pET-28a-Rjpdh分别进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-glydh+Bcldh/pET-28a-glydh+Rjpdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0061] 实施例3：重组质粒pET-duet-glydh+Bsadh/pET-duet-glydh+Scvdh的构建及转化[0062] [1]以枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板。

[0063] [2]根据枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因序列、天蓝色链霉菌的缬氨酸脱氢酶基因序列以及pET-duet质粒上的酶切位点设计基因引物。

[0064] PBsadhF：5’-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3’(Kpn I)

[0065] PBsadhR：5’-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Xho I)

[0066] PScvdhF：5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(Nde I)

[0067] PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Xho I)

[0068] [3]利用枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，
56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[0069] [4]构建重组质粒pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[0070] [5]将实施例[2]中提取的质粒pMD18-T-glydh和表达载体pET-duet分别用BamH I和Sac I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-glydh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0071] [6]将[4]中提取的质粒pMD18-T-Bsadh和表达载体pET-duet-glydh分别用Kpn I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将[4]中提取的质粒pMD18-T-Scvdh和表达载体pET-duet-glydh分别用Nde I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-glydh+Bsadh/pET-duet-glydh+Scvdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0072] 实施例4：重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd的构建及转化

[0073] [1]以大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的基因组DNA作为模板。

[0074] [2]根据大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的L-苏氨酸脱氨酶基因序列以及pET-28a质粒上的酶切位点设计ltd基因引物。

[0075] PEcltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3’(BamH I)

[0076] PEcltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(Hind III)

[0077] PSeltdF：5’-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3’(BamH I)

[0078] PSeltdR：5’-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3’(Hind III)

[0079] [3]利用大肠杆菌及鼠伤寒沙门(氏)菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌ddH2O 37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，
56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[0080] [4]构建重组质粒pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5μL，基因4.8μL，pMD18-T 0.2μL，16℃过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[0081] [5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

[0082] 实施例5：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化

[0083] [1]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD600 0.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2 400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl2 80μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。

[0084] [2]质粒的转化。取[1]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。

[0085] 实施例6：串联甘油脱氢酶及L-亮氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮

[0086] [1]将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-亮氨酸脱氢酶的pET-28a-glydh+Bcldh/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-glydh+Bcldh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入0.4M L-苏氨酸和0.4M甘油及0.1％(v/v)tween-80，于30℃、300r/min进行转化，转化过程中补充碳酸钙以保持反应液pH为6.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析及显色法分析。α-氨基丁酸的产率为36.8g/L，二羟基丙酮的产率为34.3g/L。

[0087] [2]氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.lM硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。

[0088] [3]二羟基丙酮的显色分析方法：磷钼酸试剂的配制，将钼酸7g溶解于40mL的2.5M氢氧化钠溶液中，再加入40mL的水然后置于水浴锅中沸煮20min，冷却后加入浓磷酸25mL，混匀，定容至100mL。DHA的检测，取0.2mL稀释1000倍的转化液与0.2mL磷钼酸试剂混匀，放置于水浴锅中沸煮15min，冷却后加水4.6mL，混匀，测定660nm下的吸光值并与标准样品的标准曲线对照计算DHA的产量。

[0089] 实施例7：串联甘油脱氢酶及L-苯丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮

[0090] 将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-苯丙氨酸脱氢酶的pET-28a-glydh+Rjpdh/BL21利用LB培养基养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Ecltd/BL21和pET-28a-glydh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入0.4M L-苏氨酸和0.4M甘油及1％(v/v)甲苯，于30℃、300r/min进行转化，以1M NaOH溶液以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例7中的HPLC方法)。测得α-氨基丁酸的产率为39.6g/L，二羟基丙酮的产率为35.2g/L。

[0091] 实施例8：串联甘油脱氢酶及L-丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮

[0092] 将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-丙氨酸脱氢酶的pET-duet-glydh+Bsadh/BL21利用LB培养养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Seltd/BL21和pET-duet-glydh+Bsadh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入0.4M L-苏氨酸和0.4M甘油及0.2％(v/v)曲拉通X100，于30℃、300r/min进行转化，以5M氨水以保持反应液pH为8.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例7中的HPLC方法)。测得α-氨基丁酸的产率为32.1g/L，二羟基丙酮的产率为28.9g/L。

[0093] 实施例9：串联甘油脱氢酶及L-缬氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和二羟基丙酮

[0094] 将重组菌pET-28a-Seltd/BL21和串联有L-缬氨酸脱氢酶pET-duet-glydh+Scvdh/BL21利用LB培养养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a-Seltd/BL21和pET-duet-glydh+Scvdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入0.4M L-苏氨酸和0.4M甘油及0.5％(v/v)CTAB，于30℃、300r/min进行转化，以5M氨水以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例7中的HPLC方法)。
测得α-氨基丁酸的产率为41.2g/L，二羟基丙酮的产率为38.2g/L。