一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用

摘要

本发明涉及一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用，包括如下试剂：酶切底物、裂解液以及酶切液。检测方法包括：通过电泳法或细菌克隆形成法测定核酸内切酶MUS81的活性。本发明检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊断、治疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故针对性强，有较好的临床应用前景。

权利要求

1.一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：酶切底物、裂解液以及酶切液；其中，所述酶切底物为质粒DNA，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，其特征在于：所述裂解液的组成为：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS、4-6％CHAPS和0.1-0.2U/μl RNase抑制剂；其中，磷酸盐溶液的pH值为7.4。

3.根据权利要求1所述的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，其特征在于：所述酶切液的组成为：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS、4-6％CHAPS、0.1-0.2U/μl RNase抑制剂、1-2mmol/L MgCl2和0.1-0.2mmol/L DTT；其中，磷酸盐溶液的pH值为7.4。

说明书

一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于恶性肿瘤检测领域，特别涉及一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

[0002] 近年，由于环境及生活方式的改变，我国恶性肿瘤的发病率显著升高，其中特别是肺癌、肠癌、卵巢癌等。研究证实，基因组不稳定性对肿瘤的发生发展具有重要作用；核酸内切酶是在维持基因组完整性中起关键作用的酶，因而其活性的变化与肿瘤的发生、发展密切有关。

[0003] 通常将能降解DNA分子的酶，称为核酶，其中分又为两种：能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；而从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶(endonuclease，EN)。在核酸水解酶中，EN为水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶。值得一提的是，人们在研究特异性的限制-修饰现象时，发现了核酸内切酶，该酶可抵御外源物入侵。一个细胞具有多种不同功能的、有较好活性的核酸内切酶将会保护细胞不被破环。核酸内切酶是一类广泛存在于细胞内的核酸水解酶，在体内参与宿主防御机制、肿瘤细胞的形成与发展等有关。

[0004] MUS81(methyl methanesulfonate,UV sensitive,gene clone 81,对MMS及UV敏感的81号基因)基因是Interthal等利用酵母双杂交技术发现[Interthal H,Heyer WD.MUS81 encodes a novel helix-hairpin-helix protein involved in the response to UV-and methylation-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.[J]Mol Gen Genet,2000,263(5):812-827]；其在DNA损伤修复以及染色体稳定性维持起作用。敲除Mus8l基因的酵母菌较正常酵母菌对甲磺酸盐(MMS)和紫外线(UV)更敏感，故命名为MUS81。人MUS81，为XPF-ERCC1家族的核酸内切酶，与EME1/EME2(无催化活性、参与维持复合物的稳定性)相结合形成一种DNA结构特异的限制性内切酶，可以结合DNA、参与DNA损伤修复及基因组不稳定的调控[Castor D,Nair N,Déclais AC,et al.Cooperative Control of Holliday Junction Resolution and DNA Repair by the SLX1 and MUS81-EME1 Nucleases.Mol Cell.2013,24；52(2):221-33]。MUS81可修复DNA正常代谢过程中产生的断裂双链以及暴露于某种化学试剂和放射线产生的断裂双链，是HR修复的关键组分。MUS81可影响基因组不稳定和HR过程，在体细胞中MUS81突变、缺失或减少增加了基因组不稳定性。
最近研究揭示，MUS81可与其他分子相互作用，例如在DNA损伤的位点，与RMI/FANCM形成复合物，共同发挥修复作用。MUS81复合物也可与DNA修复分子如RAD52/RAD54等结合，这些中间产物可显著促进核酸内切酶活性。MUS81在S期及M期均参与细胞周期的调控，从而保证基因组的完整性和稳定性。

[0005] 研究发现，MUS81与HR异常密切相关，MUS81表达水平下调后，HR活性显著下降。由于人正常细胞内端粒酶活性被抑制，端粒会随着细胞分裂增加而逐渐缩短，当端粒缩短到临界长度时，此时的端粒结构易被识别为DNA损伤，从而激活DNA损伤应激通路，细胞衰老或凋亡。Zeng等发现，MUS81可被招募到端粒延长替代机制(Alternative lengthening of telomere,ALT)细胞的核心结构，作用于ALT细胞端粒重组的D-loop结构，从而促进ALT细胞端粒的同源重组。端粒重复结合因子2(TRF2)可结合于MUS81，从而抑制其核酸内切酶活性。而且，HR修复核心酶MUS81在恶性肿瘤发生、进展中表达异常，会增加HR活性和持续影响基因表达谱。

[0006] 对于核酸内切酶活性测定，通过酶切消化DNA，来分析样本中的酶活性，然后电泳染色呈现大小不一的片段，对这些片段的迁移率及数量进行分析。核酸内切酶的酶切效率与底物的性质有很大的关系，底物的单双链结构、分子构型、DNA链中酶识别位点的数目以及位点附近的序列等都影响着酶的催化反应。共价闭合环(超螺旋构型)DNA比其相应的线性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋构型DNA彻底降解，需要的酶量相对就大。对于DNA双链的酶切，反应液中盐的浓度至关重要，要确定合适的盐浓度，核酸内切酶对镁离子等的要求并不严格，5-30mmol/L均可作用。酶切效果主要与酶的活性密切相关，与反应时间也相关，时间一般不宜超过1.5h，酶切的温度一般控制在37℃。酶切反应可用热(65℃)10min、过量EDTA或用酚提取来终止。

[0007] 恶性肿瘤易复发、转移，进展快，预后差。核酸内切酶如MUS81在DNA损伤后参与修复途径(HR途径)，如果其表达异常，会引起肿瘤基因组不稳定加剧、基因重排增加。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用，该试剂盒检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊断、治疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故针对性强，有较好的临床应用前景。

[0009] 本发明的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，包括如下试剂：酶切底物、裂解液以及酶切液。

[0010] 所述酶切底物为质粒DNA，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 所述裂解液的组成为：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS、4-6％CHAPS和0.1-0.2U/μl RNase inhibitor；其中，磷酸盐溶液的pH值为7.4。

[0012] 所述酶切液的组成为：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS、4-6％CHAPS、0.1-0.2U/μl RNase inhibitor、1-2mmol/L MgCl2和0.1-0.2mmol/L DTT；其中，磷酸盐溶液的pH值为7.4。

[0013] 本发明的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

[0014] (1)将收集到的恶性肿瘤细胞加入裂解液，裂解细胞60～90min；然后反复吸取混匀，离心吸取上清，-90℃～-70℃冻存；根据裂解的细胞数或者直接测定总蛋白浓度，配制成混合液；

[0015] (2)向混合液中加入溶解于酶切液的质粒DNA，在振荡器上温和振荡，然后离心数秒，37～38℃恒温水浴中孵育30～40min，随后80～90℃水浴作用10～20分钟或用EDTA终止反应；

[0016] (3)最后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切底物被切割的程度判断核酸内切酶MUS81的活性或者进行转化细菌，根据菌落形成能力的强弱判断核酸内切酶MUS81的活性。

[0017] 所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶电泳检测的条件为：20ul混合溶液；1％的琼脂糖凝胶；电泳时间1h；稳定电压130V。

[0018] 本发明的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒的应用，应用于检测恶性淋巴瘤、肺癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌或卵巢癌单个核细胞的核酸内切酶MUS81活性升高。

[0019] 核酸内切酶MUS81有以下几种基本功能：

[0020] (1)在肿瘤发生或进展时，该酶的活性可显著升高；

[0021] (2)恶性肿瘤患者外周血液中该蛋白其可以与恶性肿瘤患者辅助诊断及预后判断中发生淋巴结或远处转移的机体状态密切相关，该酶的活性异常升高；

[0022] (3)核酸内切酶活性主要涉及MUS81的核酸酶。

[0023] 本发明的特点在于：(A)特异性强，专一反映核酸内切酶的活性；(B)结果观察直观，条带切割后或菌落生长易于计算及比较分析。

[0024] 有益效果

[0025] 本发明检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊断、治疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故针对性强，有较好的临床应用前景。

附图说明

[0026] 图1为环状双螺旋质粒DNA经切割后的条带；其中，A为共价闭合DNA；B为线性DNA；C为开环DNA；

[0027] 图2为实施例2的凝胶电泳图谱；

[0028] 图3为待测样品核酸内切酶的最终酶切效率图；

[0029] 图4为实施例3的菌落形成情况；其中，1为0(阴性对照)；2为5×103；3为2×104；4为8×104；5为2×105；

[0030] 图5为实施例3的凝胶电泳图谱；其中，1’为0(阴性对照)，2’为2.5×103，3’为5×103，4’为1×104，5’为2×104，6’为4×104，7’为8×104，8’为1×105，9’为2×105；

[0031] 图6为菌落形成法计算核酸内切酶活性的比较图；

[0032] 图7为核酸内切酶MUS81活性的电泳图谱对比(A)以及R值对比(B)。

具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0034] 实施例1

[0035] 本实施例提供了一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，包括如下试剂：

[0036] 酶切底物：质粒DNA。

[0037] 裂解液：为肿瘤细胞裂解的体系，包括：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS(pH值为7.4)，4％CHAPS，RNase inhibitor(0.2U/μl)。

[0038] 酶切液：为核酸内切酶MUS81活性测定的媒介，包括：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS(pH值为7.4)，4％CHAPS，RNase inhibitor(0.2U/μl)，1mmol/L MgCl2，0.1mmol/L DTT。

[0039] 实施例2

[0040] (一)样本准备：

[0041] 1、收集细胞：(1)肿瘤组织标本：组织置于1ml 1×PBS溶液中，用高速匀浆机打碎组织，用高压灭菌的铜丝网过滤后，经PBS洗涤，获得细胞悬液；(2)外周血标本：去除血浆，血细胞沉淀中按体积比加1:1生理盐水(NS)，混匀后，将其轻轻加至ficoll分离液(体积比1：1)上，1500rpm离心20min，收集白细胞层，按体积比(1:4)加NS，混匀，1800rpm离心10min；
取下层，再按体积比(1:4)加NS,混匀，1800rpm离心10min，收集单个核细胞。然后，用红细胞裂解液(8.29g NH4CL+1g KHCO3+200ul 0.5M EDTA溶于1L蒸馏水)将收集细胞中的红细胞去除。(3)分离纯培养的肿瘤元代细胞标本：用0.25％胰酶消化后，从培养皿上移出，PBS清洗二次。

[0042] 2、裂解细胞：加入4％CHAPS细胞裂解液裂解细胞，冰浴60min；反复吸取混匀，5000rpm离心10min，吸取上清，-80℃冻存。根据裂解的细胞数或者直接测定总蛋白浓度，配制成混合液。

[0043] (二)酶切反应：向混合液中等体积加入200ng质粒DNA(溶解于2×酶切液：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS pH7.4、4％CHAPS、0.2U/μL RNase inhibitor，加有1mmol/L MgCl2，0.1mmol/L DTT)，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3000rpm)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育30min，80℃水浴作用10分钟，或用EDTA终止反应。

[0044] (三)凝胶电泳：

[0045] 选择0.8％的琼脂糖凝胶作为支持物进行电泳，同时加入标准DNA作分子量参照物，经溴乙锭(EB)染色，在相应的光源下观察结果并拍摄记录电泳图谱。根据质粒被切割的程度来比较酶切能力的差异即核酸内切酶的活性。

[0046] 在核酸内切酶的作用下，环状双螺旋质粒DNA经切割后，在0.8％的琼脂糖电泳中，其电场作用(电泳缓冲液主要成分，TAE buffer即40mol/L Tris-乙酸，1mol/L EDTA)下各部分迁移速度由快至慢的条带分别是切割出来的线性片段(Linearized fragment by enzyme cut)、共价闭环超螺旋DNA(Supercoiled DNA)、线性DNA(Linear DNA)，开环螺旋DNA(Nicked DNA)，如图1所示。其中，A空间位阻最小，所以跑得最快；C空间位阻最大，所以跑得最慢。

[0047] (四)、活性计算：

[0048] (1)使用专用软件扫描待检标本的电泳条带亮度，记录Marker条带的亮度(M)、上方条带的亮度(A)和下方条带的亮度(B)；计算S值、C值。S值＝Sum(A+B)、C＝Neg(A+B)。如图2所示。

[0049] (2)通过与空质粒的条带亮度(C)相比较，消除批内差异：计算待测样品核酸内切酶的初步酶切效率，计算公式：(D)＝(C－S)/S；(3)选取不同批次标本，通过与Marker的条带亮度(M)相比较，消除批间差异：以M为基准，该批次的校准系数，得出待测样品核酸内切酶的最终酶切效率(RS)，RS＝D/M。如图3所示。

[0050] (3)确定最佳的孵育时间：上述样本的细胞所得裂解液，总蛋白量均取2ug，均加入200ng质粒DNA，孵育时间分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、
45min、50min、60min，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒切割的程度，确定最佳的孵育时间为
30min。

[0051] 确定最佳的混合液配比：经多次实验，确定标本的最佳总体积：20uL；裂解液：15ul；质粒：200ng；37℃孵育30min。

[0052] 确定最佳的电泳条件：20ul混合溶液；1％的琼脂糖凝胶；电泳时间1h；稳定电压130V。

[0053] 实施例3

[0054] (一)、试剂准备：

[0055] 含Amp的LB固体培养基:胰蛋白胨10g+酵母提取物(酵母膏)5g+氯化钠10g,加蒸馏水至1L。用1M的NaOH调节PH至7.0，最后高压蒸汽灭菌。取上述制备好的LB培液加入琼脂(15g/L)，高压灭菌后冷却至60℃左右，加入氨苄青霉素(100mg/L)，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板；即可制备含有氨苄青霉素的LB平板。

[0056] (二)、样本准备：

[0057] 1、收集细胞：(1)肿瘤组织标本：组织置于1ml 1×PBS溶液中，用高速匀浆机打碎组织，用高压灭菌的铜丝网过滤后，经PBS洗涤，获得细胞悬液；(2)外周血标本：去除血浆，血细胞沉淀中按体积比加1:1生理盐水(NS)混匀后，将其轻轻加至ficoll分离液(体积比1：1)上，1500rpm离心20min，收集白细胞层，按体积比(1:4)加NS混匀，1800rpm离心10min；取下层，再按体积比(1:4)加NS，混匀，1800rpm离心10min，收集单个核细胞。然后，用红细胞裂解液(8.29g NH4CL+1g KHCO3+200ul 0.5M EDTA溶于1L蒸馏水)将收集细胞中的红细胞去除。(3)分离纯培养的肿瘤元代细胞标本：用0.25％胰酶消化后，从培养皿上移出，PBS清洗二次。

[0058] 2、裂解细胞：加入4％CHAPS细胞裂解液裂解细胞，冰浴60min；反复吸取混匀，5000rpm离心10min，吸取上清，-80℃冻存。根据裂解的细胞数或者直接测定总蛋白浓度，配制成混合液。

[0059] (三)、酶切过程：

[0060] 向混合液中等体积加入200ng质粒DNA(溶解于2×酶切液：0.01mol/L磷酸盐溶液PBS pH7.4、4％CHAPS、0.2U/μL RNase inhibitor，加有1mmol/L MgCl2，0.1mmol/L DTT)，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3000rpm)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育30min，80℃水浴作用10分钟，或用EDTA终止反应。

[0061] (四)、转化过程：

[0062] 同时做阴阳性两个对照，从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞(氯化钙处理后的E.coli DH5α细菌)悬液，室温下解冻，解冻后立即置冰上。加入质粒DNA溶液(含量200ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。42℃热激90秒，然后迅速置于冰上冷却2分钟。向管中加入300uL LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养。

[0063] (五)、活性计算：

[0064] 37℃培养16-24小时后，计数菌落数量；核酸内切酶的活性与菌落形成数量成反比，如图4-6所示。

[0065] 实施例4

[0066] 将实施例1提供的核酸内切酶MUS81检测试剂盒用于检测恶性淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌患者、乳腺癌、卵巢癌。

[0067] 实施例2、3两种方法计算癌组织与对照组织之间的核酸内切酶活性均有明显差异，癌组织的核酸内切酶活性明显高于对照组织(P<0.01)。同一患者的癌组织的核酸内切酶活性均高于对照组织。恶性淋巴瘤、胃肠道癌、肺癌患者的单个核细胞的核酸内切酶活性明显高于健康及良性疾病对照者(P<0.01)。而且,恶性肿瘤转移组的核酸内切酶活性高于无转移对照组，如图7所示。

[0068] 本发明提示核酸内切酶活性可能成为肿瘤标志物和预后因子。对于是否能通过检测核酸内切酶活性来区分不同种类肿瘤，则需要进一步探索不同恶性肿瘤之间，所含不同种类的核酸内切酶含量差异。