钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法

摘要

本发明公开了一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括：步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83～12.5μg/μl，之后向其中加入磷酸化抗体，磷酸化抗体与含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750～2500，然后将二者于4℃下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；以及，步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测步骤一中得到的磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。本发明通过蛋白质免疫沉淀和免疫印迹技术可以在宰后肌肉中检测出磷酸化的钙蛋白酶，所需的肌肉样品量少，操作过程简单，重复性好，检测所得条带清晰，试验方法对人体的潜在伤害小。

权利要求

1.一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括：

步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83 12.5 μg/μl，之后向其中加~入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750 2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育，以~形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；

步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平；

在所述步骤一之前还包括提取所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的方法：

采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4℃下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且除将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成匀浆液的步骤外，其他所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；

其中，所述组织裂解液包含浓度为25 mM的N-二甘氨酸和150 mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6；

所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；

所述匀浆过程在冰上进行30 s，且每次匀浆时间为10 s，每两次匀浆之间间隔20 s。

2.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括：

1.1）取Protein A/G琼脂糖树脂浆液并使其吸附在离心柱上，其中，所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的体积比为2 3:40 60，且每个离心柱内~ ~加入的所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30 μl；

1.2）将所述免疫复合物加入经过步骤1.1）处理后的吸附有所述Protein A/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4℃恒温震荡孵育1h，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和Protein A/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，

1.3）向步骤1.2）中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100℃下孵育5min，冷却后在室温下10000×g离心1min，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。

3.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ-calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2 μg/ml。

4.如权利要求3所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用anti-mouse IgG，所述第二抗体的浓度为0.1-0.3 μg/ml。

5.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600 μl，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000 μg。

6.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3 μg/μl，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。

7.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育2- 14 h，以形成所述免疫复合物。

8.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述动物肌肉样品取自羊。

说明书

钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，该技术可直接应用于羊及其他动物肌肉的生物化学研究。

背景技术

[0002] 医学等生命科学研究领域通常是通过同位素标记法检测生物体内钙蛋白酶的磷酸化水平，但同位素标记检测的方法繁琐，且对人体的潜在伤害很大。但是，对于磷酸化钙蛋白酶的生化变化进行研究分析，以及对其他动物肌肉生理生化的研究来说，钙蛋白酶的磷酸化是科学研究中必不可少的。虽然现有技术中也有针对蛋白酶磷酸化水平测定的较为安全的方式，但是由于钙蛋白酶较为敏感，极易受外界环境影响，导致活性降低甚至失活等特性。故此，目前还没有专门针对钙蛋白酶磷酸化水平检测的方法。因此，一种对人体安全、检测快速准确地测定钙蛋白酶的磷酸化的方法是亟需的。

发明内容

[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

[0004] 本发明还有一个目的是提供一种钙蛋白酶粗样品的提取方法，通过本发明的组织裂解液提取的蛋白样品中钙蛋白酶的含量较高、活性较高，解决了在磷酸化水平测定过程中钙蛋白酶容易部分失活或全部失活的问题。

[0005] 本发明再有一个目的是提供一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，本发明通过利用蛋白免疫沉淀和蛋白免疫技术实现了对钙蛋白酶磷酸化水平的测定，解决了现有方法中测定磷酸化水平时对人体危害较大和操作过程繁琐等问题。

[0006] 本发明提供的技术方案为：

[0007] 一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括：

[0008] 步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83～12.5μg/μl，之后向其中加入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750～2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；以及，

[0009] 步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。

[0010] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括：

[0011] 1.1)取Protein A/G琼脂糖树脂浆液并使其吸附在离心柱上，其中，所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液与所述钙蛋白样品的体积比为2～3:40～60，且每个离心柱内加入的所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30μl；

[0012] 1.2)将所述免疫复合物加入经过步骤1.1)处理后的吸附有所述Protein A/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4℃恒温震荡孵育1h，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和Protein A/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，

[0013] 1.3)向步骤1.2)中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100℃下孵育5min，冷却后在室温下10000×g离心1min，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。

[0014] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ-calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2μg/ml。

[0015] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用anti-mouse IgG，所述第二抗体的浓度为0.1-0.3μg/ml。

[0016] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，在所述步骤一之前还包括提取所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的方法：

[0017] 采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液或者肌浆抽提液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4℃下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；

[0018] 其中，所述组织裂解液包含浓度为25mM的N-二甘氨酸和150mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6；

[0019] 所述肌浆抽提液包含浓度为100mM的Tris base、10mM的EDTA和0.05％的巯基乙醇，所述肌浆抽提液的pH为8.3。

[0020] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；

[0021] 所述匀浆过程在冰上共进行30s，且每次匀浆时间为10s，每两次匀浆之间间隔20s。

[0022] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有该蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600μl，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000μg。

[0023] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3μg/μl，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。

[0024] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育2-14h，以形成所述免疫复合物。

[0025] 优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述动物肌肉样品取自羊。

[0026] 本发明至少包括以下有益效果：

[0027] 本发明的方法通过蛋白质免疫沉淀和免疫印迹技术同样可以在宰后肌肉中检测出磷酸化的钙蛋白酶，所需的肌肉样品量少，操作过程较为简单，重复性好，检测所得条带清晰，试验方法对人体的潜在伤害小，是一种高效测定宰后肌肉中μ-calpain磷酸化水平的方法。利用该方法可对羊骨骼肌中磷酸化钙蛋白酶的生化变化进行研究分析，也可延伸至其他动物肌肉生理生化的研究。

[0028] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1中4-氯-1-萘酚显色法后的成像图；

[0030] 图2为本发明实施例2中ECL显色法后的曝光成像图；

[0031] 图3为本发明实施例2中的ECL显色法后的PVDF膜成像图；

[0032] 图4为本发明实施例3中的ECL显色法后的曝光成像图；

[0033] 图5为本发明实施例4中的ECL显色法后的曝光成像图；

[0034] 图6为本发明实施例5中的ECL显色法后的曝光成像图；

[0035] 图7为本发明实施例5中曝光成像图的Quantity One软件分析图。

具体实施方式

[0036] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0037] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

[0038] 本发明中用到的试剂和试剂盒：

[0039] 组织裂解液：25mM N-二甘氨酸，150mM氯化钠，添加磷酸酶抑制剂(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制剂(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6；

[0040] 肌浆抽提液：100mM Tris base，10mM EDTA，0.05％巯基乙醇，pH8.3[0041] 磷酸化抗体：phospho-Ser/Thr/Tyr antibody，Abcam ab15556：

[0042] 2×还原性上样缓冲液：10％SDS 4mL，甘油2mL，0.5M Tris-HCl pH6.82mL，1M DTT 2.0mL，溴酚蓝0.01g：

[0043] 8％的分离胶:双蒸水4.68ml，1.5M Tris-Hcl pH8.82.5ml，10％SDS 100μl，30％Acr-Bis(37.5:1)2.67ml，TEMED 5μl，10％过硫酸铵50μl；

[0044] 4％的浓缩胶：双蒸水3.05ml，0.5M Tris-HCl(pH6.8)1.25ml，10％SDS 50μl，30％Acr-Bis(37.5:1)0.65ml，TEMED 5μl，10％过硫酸铵25μl；

[0045] TBS缓冲液：Tris 1.211g，NaCl 8.76g，1mol/L的HCl调pH至7.5；

[0046] 封闭液中包含：TBS 50ml/L，Tween2025μl/L，BSA 1.5g/L：

[0047] TBST1：每500mLTBS加0.5mL Tween20；

[0048] TBST2：Tris 3.0275g，NaCl 4.38g，Tween200.5mL，HCl调pH至7.5，定容至500mL[0049] ECL显色法中使用的试剂盒为：Bio-Rad#1705061；

[0050] BCA法测定提取样品的蛋白浓度使用的试剂盒为Thermo#23225；

[0051] 蛋白质免疫沉淀试验中使用的试剂盒：Thermo#26146。

[0052] 本发明提供一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括：

[0053] 步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83～12.5μg/μl，之后向其中加入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750～2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；以及，

[0054] 步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。

[0055] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括：

[0056] 1.1)取Protein A/G琼脂糖树脂浆液并使其吸附在离心柱上，其中，所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液与所述钙蛋白样品的体积比为2～3:40～60，且每个离心柱内加入的所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30μl；

[0057] 1.2)将所述免疫复合物加入经过步骤1.1)处理后的吸附有所述Protein A/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4℃恒温震荡孵育1h，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和Protein A/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，

[0058] 1.3)向步骤1.2)中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100℃下孵育5min，冷却后在室温下10000×g离心1min，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。

[0059] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ-calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2μg/ml。

[0060] 在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用anti-mouse IgG，所述第二抗体的浓度为0.1-0.3μg/ml。

[0061] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，在所述步骤一之前还包括提取所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的方法：

[0062] 采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液或者肌浆抽提液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4℃下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；

[0063] 其中，所述组织裂解液包含浓度为25mM的N-二甘氨酸和150mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6；

[0064] 所述肌浆抽提液包含浓度为100mM的Tris base、10mM的EDTA和0.05％的巯基乙醇，所述肌浆抽提液的pH为8.3。

[0065] 在上述方案中，作为优选，所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；

[0066] 所述匀浆过程在冰上共进行30s，且每次匀浆时间为10s，每两次匀浆之间间隔20s。

[0067] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有该蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600μl，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000μg。

[0068] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3μg/μl，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。

[0069] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育2-14h，以形成所述免疫复合物。

[0070] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述动物肌肉样品取自羊。

[0071] 下述实施例均采用Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机、Bio-Rad单向电泳系统和Bio-Rad湿法转膜仪。

[0072] 实施例1

[0073] a)取部分-80℃保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；

[0074] b)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶(Acr：Bis＝37.5：1)，凝胶的每孔均加入50μg蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迁移至胶底边缘后结束电泳；

[0075] c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴100min，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0076] 将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭1h；

[0077] 第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，浓度为1.4μg/ml；更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

[0078] 第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μl/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育1h；

[0079] 用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用4-氯-1-萘酚显色法显色。

[0080] 实施例2

[0081] a)取部分-80℃保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；

[0082] b)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶(Acr：Bis＝37.5：1)，凝胶的每孔均加入50μg蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迁移至胶底边缘后结束电泳；

[0083] c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴100min，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0084] 将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭1h；

[0085] 一抗孵育：在5ml封闭液中加入Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，浓度为1.4μg/ml；更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

[0086] 二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μl/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育1h；

[0087] 用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，ECL显色法曝光显色。

[0088] 实施例3

[0089] a)取出-80℃下保存的肌肉样品，冷冻状态下称取0.5g，切成小块状后装至离心管中；

[0090] b)加入6倍体积的肌浆抽提液(100mM Tris base，10mM EDTA，0.05％巯基乙醇，pH8.3)，冰上匀浆30s(每匀浆10s间隔20s)；

[0091] c)匀浆液在低温4℃离心机中10,000×g离心35min；

[0092] d)撇去上层脂肪层后取上清液分装；

[0093] e)蛋白质定量：BCA法，测定浓度后于-80℃保存备用；

[0094] f)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶(Acr：Bis＝37.5：1)，凝胶的每孔均加入50μg蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迁移至胶底边缘后结束电泳；

[0095] g)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴100min，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0096] 将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭1h；

[0097] 一抗孵育：在5ml封闭液中加入Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，浓度为1.4μg/ml；更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

[0098] 二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μl/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育1h；

[0099] 用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，ECL显色法曝光显色。

[0100] 实施例4

[0101] a)取部分-80℃保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；

[0102] b)蛋白质免疫沉淀(IP)：抗原抗体在4℃恒温金属浴中震荡孵育2h，以形成免疫复合物；

[0103] 其他免疫沉淀、SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹实验步骤与本发明所述方法一致，ECL显色法曝光显色。

[0104] 实施例5

[0105] a)取部分-80℃保存的羊背最长肌样品制备组织裂解物，BCA法测定蛋白浓度；

[0106] b)蛋白质免疫沉淀(IP)：调整样品蛋白的浓度至10μg/μl，取500μl调配好的样品，加入2μg磷酸化抗体(phospho-Ser/Thr/Tyr antibody，Abcam ab15556)，使得抗原抗体反应体系中蛋白的总反应量约为5000μg，磷酸化抗体的浓度为0.2μg/μl；抗原抗体在4℃恒温金属浴中震荡孵育14h，以形成免疫复合物；

[0107] 以截短枪头取Protein A/G琼脂糖树脂浆液20μl加入离心柱中，1000×g、4℃离心1min，弃掉穿流液体；用100μl预冷的IP洗涤缓冲液洗涤树脂两次，每次均以1000×g、4℃条件离心后弃掉流穿液体；将500μl的抗原抗体复合物加入含有琼脂糖树脂的离心柱中，4℃恒温金属浴中震荡孵育1h；1000×g、4℃下离心1min，保留流穿液体(理论上不含有磷酸化蛋白，用于后续的检测验证)；用200μl IP洗涤缓冲液洗涤树脂三次，每次洗涤后都在1000×g、4℃条件下进行离心，弃掉流穿液体；100μl条件缓冲液洗涤树脂一次，1000×g、4℃条件下离心，弃掉流穿液体，离心柱上截留的即为抗原抗体和琼脂糖树脂的三元复合物；

[0108] 向三元复合物中添加50μl SDS 2×还原性上样缓冲液，100℃下孵育5min，冷却后在室温下10000×g离心1min，所得的流穿液体即为富集的磷酸化蛋白样品；

[0109] c)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶(Acr：Bis＝37.5：1)，凝胶的每孔均加入20μl富集的磷酸化蛋白样品；电泳初始参数设置为70V，当蛋白条带完全进入分离胶后将电压设置为110V继续进行电泳，直至溴酚蓝染料迁移至胶底边缘后结束电泳；

[0110] d)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF膜裁剪至凝胶大小后用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以湿法转膜技术，在100V下冰浴100min，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0111] 将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭1h；

[0112] 一抗孵育：在5ml封闭液中加入Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，添加量为1.4μg/ml；更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

[0113] 二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μl/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育1h；

[0114] 用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，ECL显色法曝光显色。

[0115] 如图1所示，蛋白质免疫印迹实验以4-氯-1-萘酚法进行显色后，PVDF膜上除了蛋白Marker条带外并没有观察到任何蛋白条带出现。而相同条件下，以ECL显色法进行曝光显色后，如图2所示，可检测到非常清晰明显的钙蛋白酶三种分子量的蛋白条带，且曝光后的PVDF膜对应荧光位置有暗黄色条带出现，条带信号显著强于图1。说明在检测钙蛋白酶条带信号时应选择ECL显色法进行实验，鉴于磷酸化钙蛋白酶条带信号更弱，所以本发明选择ECL显色法作为磷酸化钙蛋白酶的成像方法。

[0116] 图2和图4分别为实施例2、3所得实验结果，图3示出了实施例2中的ECL显色法后的PVDF膜成像图。在其他实验条件相同的情况下，实施例2使用组织裂解液制备实验样品，而实施例3使用肌浆抽提液制备样品。对比两图可以发现，图4中钙蛋白酶的条带发生形变，并不具备后续数据分析处理的条件。这可能是因为抽提液中的巯基乙醇干扰了正常SDS-PAGE电泳的顺利进行，导致蛋白条带迁移异常，故本发明选择了组织裂解法作为样品的制备方法。

[0117] 当抗原抗体震荡孵育的时间较短时，如实施例4，图5所示，在ECL曝光成像后，所得的图像背景较高，1-4泳道目的的磷酸化钙蛋白酶条带较为模糊，会对实验数据分析产生较大干扰。当抗原抗体震荡孵育时间延长至14h时，如实施例5，图6所示，图像背景明显低于图5，且3-4泳道磷酸化钙蛋白酶条带清晰明显，利于后续的分析处理。

[0118] 通过Quantity One(Bio-Rad)软件对图6所示的试验结果进行半定量分析的结果如图7所示，3、4泳道磷酸化的钙蛋白酶条带的灰度值分别为781.018和339.986。说明3、4泳道所用的样品中μ-calpain的磷酸化水平存在明显差异，3泳道样品μ-calpain磷酸化水平约为4泳道样品的2.3倍。而钙蛋白磷酸化的水平的肉的嫩度是相关的，由钙蛋白磷酸化的水平还可评估样品来源的肉质嫩度。

[0119] 实施例6

[0120] 一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，按以下步骤进行：

[0121] 1)采集猪肌肉样品，用液氮速冻后，于-80℃以下保存备用；

[0122] 2)取部分样品加入6倍体积的组织裂解液(25mM N-二甘氨酸，150mM氯化钠，添加磷酸酶抑制剂(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制剂(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6；磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂需现用现加)，冰上匀浆30s(每匀浆10s间隔20s)，；

[0123] 3)匀浆液在4℃、10,000g条件下离心15min；

[0124] 4)离心后漂去上层脂质，吸取上清液分装，于-80℃储存备用；蛋白样品提取阶段需要全程冰上操作或适当进行冰浴。

[0125] 5)蛋白质定量：采用BCA法(Thermo#23225)测定提取样品的蛋白浓度；

[0126] 6)蛋白质免疫沉淀试验(试剂盒：Thermo#26146)：磷酸化抗体(phospho-Ser/Thr/Tyr antibody，Abcam ab15556)的IP浓度为0.3μg/μl，600μl抗原抗体反应体系中蛋白的总反应量约3500μg，此时蛋白浓度为5.83μg/μl，磷酸化抗体的浓度为3μg；抗原抗体在4℃下震荡孵育8h，以形成免疫复合物；

[0127] 以截短枪头取Protein A/G琼脂糖树脂浆液30μl加入离心柱中，1000×g离心1min，弃掉穿流液体；用100μl预冷的IP洗涤缓冲液洗涤树脂两次，均弃掉流穿液体；将抗原抗体复合物加入含有琼脂糖树脂的离心柱中，4℃下震荡孵育1h；1000×g离心1min，保留流穿液体；用200μl IP洗涤缓冲液洗涤树脂三次，每次洗涤后都进行离心；100μl条件缓冲液洗涤树脂一次；

[0128] 在所得的三元复合物中添加50μl 2×还原性上样缓冲液，100℃下孵育5min，10000×g离心1min，所得的流穿液即为富集的磷酸化蛋白样品。

[0129] 7)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶；

[0130] 8)蛋白质免疫印迹试验：SDS-PAGE凝胶采用湿法转膜，100V下冰浴100min，将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0131] 在装有PVDF膜的杂交袋中加入5ml封闭液，室温震荡封闭1h；一抗为Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，浓度为2μg/ml，4℃过夜孵育；

[0132] TBST1洗涤三次，每次10min；二抗为Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.3μl/ml，室温震荡孵育1h；

[0133] TBST2洗涤三次，每次10min，ECL(Bio-Rad#1705061)显色法曝光显色。

[0134] 其中，整个过程的溶液配制需用超纯水。

[0135] 实施例7

[0136] 一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，按以下步骤进行：

[0137] 1)采集牛肌肉样品，用液氮速冻后，于-80℃以下保存备用；

[0138] 2)取部分样品加入6倍体积的组织裂解液(25mM N-二甘氨酸，150mM氯化钠，添加磷酸酶抑制剂(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制剂(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6；磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂需现用现加)，冰上匀浆30s(每匀浆10s间隔20s)，；

[0139] 3)匀浆液在4℃、10,000g条件下离心15min；

[0140] 4)离心后漂去上层脂质，吸取上清液分装，于-80℃储存备用；蛋白样品提取阶段需要全程冰上操作或适当进行冰浴。

[0141] 5)蛋白质定量：采用BCA法(Thermo#23225)测定提取样品的蛋白浓度；

[0142] 6)蛋白质免疫沉淀试验(试剂盒：Thermo#26146)：磷酸化抗体(phospho-Ser/Thr/Tyr antibody，Abcam ab15556)的IP浓度为0.3μg/μl，400μl抗原抗体反应体系中蛋白的总反应量约5000μg，蛋白浓度为12.5μg/μl，磷酸化抗体的浓度为3μg；抗原抗体在4℃下震荡孵育8h，以形成免疫复合物；

[0143] 以截短枪头取Protein A/G琼脂糖树脂浆液20μl加入离心柱中，1000×g离心1min，弃掉穿流液体；用100μl预冷的IP洗涤缓冲液洗涤树脂两次，均弃掉流穿液体；将抗原抗体复合物加入含有琼脂糖树脂的离心柱中，4℃下震荡孵育1h；1000×g离心1min，保留流穿液体；用200μl IP洗涤缓冲液洗涤树脂三次，每次洗涤后都进行离心；100μl条件缓冲液洗涤树脂一次；

[0144] 在所得的三元复合物中添加50μl 2×还原性上样缓冲液，100℃下孵育5min，10000×g离心1min，所得的流穿液即为富集的磷酸化蛋白样品。

[0145] 7)SDS-PAGE电泳：采用8％的分离胶和4％的浓缩胶；

[0146] 8)蛋白质免疫印迹试验：SDS-PAGE凝胶采用湿法转膜，100V下冰浴100min，将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；TBS缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次1min；

[0147] 在装有PVDF膜的杂交袋中加入5ml封闭液，室温震荡封闭1h；一抗为Abcam公司的μ-calpain单克隆抗体(货号：ab49652)，浓度为2μg/ml，4℃过夜孵育；

[0148] TBST1洗涤三次，每次10min；二抗为Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为03μl/ml，室温震荡孵育1h；

[0149] TBST2洗涤三次，每次10min，ECL(Bio-Rad#1705061)显色法曝光显色。

[0150] 其中，整个过程的溶液配制需用超纯水。

[0151] 这里说明的处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的蛋白质提取、磷酸化方法和蛋白质免疫沉淀及免疫印迹等方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

[0152] 如上所述，根据本发明，检测羊背最长肌中磷酸化的钙蛋白酶取得了成功，且，经反复实验，本发明方法实验重复性好，结果可靠，可为羊等动物骨骼肌中磷酸化钙蛋白酶检测研究提供技术范例。

[0153] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。