一种细胞膜电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用

摘要

本发明为一种细胞膜电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用，该抑制剂的组成包括氢化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制剂中氢化肉桂酸的浓度为1～20mM；所述的细胞浴液的pH值为7.2～7.4，使用蔗糖调节其渗透压为290～310mOsm/L；利用该混合物孵育表达有Kir2.1的突变体D172N和E299V通道蛋白的细胞，消除或有效抑制其外向电流。本发明通过研究得到的细胞膜电流抑制剂对Kir2.1单点突变体D172N和E299V的外向电流抑制率接近100%，半数有效抑制浓度分别为3.67mM和2.56mM。这为研制短QT3综合症靶向治疗药物打下很好的基础。

权利要求

1.一种抑制内向整流钾离子通道Kir2.1外向电流的抑制剂在制备治疗短QT3综合征药物中的应用，其特征为该抑制剂的组成包括氢化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制剂中氢化肉桂酸的浓度为1～20mM；所述的细胞浴液的pH值为7.2～7.4，使用蔗糖调节其渗透压为290～310mOsm/L；

所述的细胞浴液为细胞浴液a、细胞浴液c、细胞浴液d或者细胞浴液e；其中，所述的细胞浴液a的组成包括：116.88mM的KCl，5mM的MgCl2，2mM的EDTA，2.83mM的KH2PO4，7.17mM的K2HPO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～

310mOsm/L；

所述的细胞浴液c的组成包括:浓度分别为110mM的KCl，10mM的KH2PO4，2mM的EDTA，5mM的HEPES，1.9mM的K2ATP，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～

310mOsm/L；

所述的细胞浴液d的组成包括:浓度分别为123mM的KCl,5mM的K2EDTA,7.2mM的K2HPO4,

8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L；

所述的细胞浴液e的组成包括:浓度分别为120mM的KCl，4mM的K2EDTA，7.2mM的K2HPO4，

2.8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L。

说明书

一种细胞膜电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用

技术领域

[0001] 本发明属于内向整流钾离子通道Kir2.1调节剂的筛选，具体涉及氢化肉桂酸与HEK293T细胞浴液混合物对Kir2.1单点突变体D172N和E299V通道外向电流的抑制。

背景技术

[0002] 细胞膜上的离子通道蛋白具有通透某一种或者某几种离子的功能，其种类繁多。内向整流钾离子通道Kir2.1是一种只能通透钾离子的孔道性蛋白。它只允许钾离子内流而不允许钾离子外流，因此其电流表现为内向整流特性。已经发现Kir2.1单点突变体D172N或者E299V改变了Kir2.1通道的内向整流特性，它们引起了很强的外向电流。研究发现正是这一很强的外向电流引起了短QT3综合征。这种心脏疾病是一种家族病，会引起严重的心脏性猝死，从婴儿至耄耋老人均有发病表现。短QT综合症患者的心电图中表现为QT间期小于
360ms，小于正常值360～440ms。这是因为D172N和E299V引起的外向电流会加速心肌细胞复极化时间，进而缩短QT间期，引起短QT3综合症。

[0003] 迄今为止，治疗短QT3综合症的主要方法是在人体内植入除颤器。但是除颤器会引起非常严重的神经性损伤，对儿童及幼儿，根本无法利用除颤器进行治疗短QT3综合征。婴幼儿患上了这种疾病只有面临死亡。但是药物治疗是解决这一问题的很好途径，可以通过药物来抑制D172N和E299V通道的外向电流来进行治疗这种疾病。迄今为止，Kir2.1外向电流的抑制剂极度缺乏，所以寻找Kir2.1外向电流的抑制剂，就变得相当迫切。

[0004] 氢化肉桂酸是一种化合物单体，其常用于饼干、冰激凌和糖果等的增香剂。此外，氢化肉桂酸作为中间体还常用于医学领域，可见其对人体副作用很小。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对当前Kir2.1内向整流钾离子通道电流抑制试剂缺乏的情况下，提供一种细胞膜电流抑制剂，其组成包括氢化肉桂酸与细胞浴液。该抑制剂能够对表达于HEK293T细胞的Kir2.1通道的突变体D172N或E299V的外向电流起到很强的抑制作用。利用含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液混合物孵育转染D172N或E299V的HEK293T细胞，则膜片钳记录到的Kir2.1的突变体D172N或E299V的外向电流消失。当再灌流无氢化肉桂酸的细胞浴液，则D172N或E299V通道电流得到恢复，这说明氢化肉桂酸与细胞浴液混合物未破坏Kir2.1通道蛋白的结构。这些实验结果证明了氢化肉桂酸与细胞浴液的混合液对Kir2.1通道外向电流起到抑制作用，为Kir2.1突变体D172N和E299V外向电流的抑制剂。

[0006] 本发明的技术方案为：

[0007] 一种细胞膜电流抑制剂，该抑制剂的组成包括氢化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制剂中氢化肉桂酸的浓度为1～20mM；所述的细胞浴液的pH值为7.2～7.4，使用蔗糖调节其渗透压为290～310mOsm/L。

[0008] 所述的细胞电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用，利用该抑制剂孵育表达有 Kir2.1的突变体D172N和E299V通道蛋白的细胞，消除或有效抑制其外向电流。

[0009] 具体包括以下步骤：

[0010] (1)配制细胞浴液；

[0011] (2)将氢化肉桂酸加入到含有细胞浴液的离心管中，20～40摄氏度下超声波振荡至固体全部溶解，得到氢化肉桂酸浓度为1～20mM的细胞浴液；

[0012] (3)利用上面得到的细胞膜电流抑制剂孵育表达有Kir2.1单点突变体D172N或E299V蛋白的HEK293T细胞，最终得到Kir2.1单点突变体D172N或E299V外向电流被抑制或消除的HEK293T细胞。

[0013] 所述的细胞浴液优选为细胞浴液a、细胞浴液b、细胞浴液c、细胞浴液d或者细胞浴液e；其中，

[0014] 所述的细胞浴液a的组成包括：116.88mM的KCl，5mM的MgCl2，2mM的EDTA，2.83mM的KH2PO4，7.17mM的K2HPO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L；

[0015] 所述的细胞浴液b的组成或者包括：浓度分别为140mM的KCl，10mM的K-HEPES，1mM的K-EGTA，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L；

[0016] 所述的细胞浴液c的组成包括:浓度分别为110mM的KCl，10mM的KH2PO4，2mM的EDTA，5mM的HEPES，1.9mM的K2ATP，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～
310mOsm/L；

[0017] 所述的细胞浴液d的组成或者包括:浓度分别为123mM的KCl,5mM的K2EDTA,7.2mM的K2HPO4,8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L；

[0018] 所述的细胞浴液e的组成包括:浓度分别为120mM的KCl，4mM的K2EDTA，7.2mM的K2HPO4，2.8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L。

[0019] 本发明的有益效果是：

[0020] 近十年，Kir2.1通道内向电流的抑制剂相继被发现，比如ML133、他莫西芬、氯乙基可乐定。但Kir2.1突变体D172N和E299V产生外向电流的抑制剂还未见描述。而这些外向电流恰恰是短QT3综合征发病的主要原因所在。所以寻找D172N和E299V外向电流的抑制剂对已研究开发短QT3综合征靶向治疗药物起着非常关键的作用。

[0021] 本发明通过研究得到的细胞膜电流抑制剂对Kir2.1单点突变体D172N和E299V的外向电流抑制率接近100％，半数有效抑制浓度分别为3.67mM和2.56mM。这为研制短QT3综合症的有效治疗药物打开了一扇大门。而且氢化肉桂酸作为一种化合物单体，相对于采用混合物与细胞浴液组成的抑制剂，其对人体副作用小，更加有利于靶向药物进一步的研制。

附图说明

[0022] 图1为实施例1中，通过膜片钳内向外模式记录到的转染Kir2.1突变体D172N的HEK293T细胞上的电流随膜电位的变化，横坐标为电压，纵坐标为电流。其中：

[0023] 图1A，未灌流氢化肉桂酸的Kir2.1突变体D172N电流特征曲线；

[0024] 图1B，20mM氢化肉桂酸和细胞浴液混合液灌流后的Kir2.1突变体D172N的电流变化曲线；

[0025] 图1C，利用细胞浴液冲掉含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液后的Kir2.1突变体D172N的电流变化。

[0026] 图2为实施例1中，含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液对D172N在+30mV时外向电流的影响，其中HA表示氢化肉桂酸；

[0027] 图3为实施例2中，含有不同摩尔浓度氢化肉桂酸的细胞浴液混合液对Kir2.1突变体D172N外向电流抑制百分比与混合物中氢化肉桂酸浓度的变化关系，也就是量效曲线。横坐标为细胞浴液中含有氢化肉桂酸的摩尔浓度，纵坐标为抑制Kir2.1突变体D172N外向电流的百分比。IC50＝3.67mM。

[0028] 图4为实施例3中，通过膜片钳内向外模式记录到的转染Kir2.1突变体E299V的HEK293T细胞上的电流随膜电位的变化，横坐标为细胞膜电压，纵坐标为通道电流。其中：

[0029] 图4A，灌流不含氢化肉桂酸的细胞浴液的Kir2.1突变体E299V电流特征曲线；

[0030] 图4B，灌流含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液混合液的Kir2.1突变体E299V的电流变化曲线；

[0031] 图4C，利用不含有氢化肉桂酸的细胞浴液冲掉氢化肉桂酸后的Kir2.1突变体E299V的电流变化曲线。

[0032] 图5为实施例3中，含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液对E299V在+30mV时外向电流的影响，其中HA表示氢化肉桂酸；

[0033] 图6为实施例4中，含有不同浓度氢化肉桂酸的细胞浴液混合液对Kir2.1突变体E299V外向电流抑制百分比与氢化肉桂酸浓度的变化关系，也就是量效曲线。横坐标为细胞浴液中含有氢化肉桂酸的摩尔浓度，纵坐标为抑制Kir2.1突变体E299V外向电流的百分比。IC50＝2.56mM。

具体实施方式

[0034] 本发明涉及的氢化肉桂酸购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品编号135232，CAS号501-52-0，5克装。

[0035] 实施例1

[0036] 采用膜片钳测试方法记录氢化肉桂酸与细胞浴液混合液对Kir2.1内向电流抑制与恢复的代表性实验结果：

[0037] 氢化肉桂酸与细胞浴液混合液配制方法：量杯量取50mL细胞浴液倒入50mL离心管中。利用天平秤取0.375克氢化肉桂酸，加入离心管中。将离心管置入超声容器中30摄氏度超声波振荡30分钟至固体氢化肉桂酸全部溶解，得到含有50mM氢化肉桂酸的细胞浴液。这里配制的氢化肉桂酸的浓度为常温下氢化肉桂酸溶解度下的摩尔浓度，也就是常温下氢化肉桂酸所能溶解的最高浓度。50mL含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液的配置方法为：取20mL含有50mM氢化肉桂酸的细胞浴液倒入50mL离心管，再取30mL细胞浴液倒入此离心管，旋涡混匀，得到氢化肉桂酸浓度为20mM的细胞浴液；

[0038] 所述的细胞浴液配方如下：KCl 116.88mM，MgCl25mM，EDTA 2mM，KH2PO42.83mM，K2HPO47.17mM，溶剂为超纯水，KOH调节pH为7.3，蔗糖调节细胞浴液渗透压为290～310mOsm/L。玻璃微电极配方同细胞浴液，调节其渗透压为290mOsm/L。

[0039] HEK293T细胞铺板于含有0.13-0.17mm厚度爬片的24孔板，37度5％二氧化碳无菌培养箱培养24小时后，密度达40％，利用脂质体方法进行转染Kir2.1的单点突变质粒D172N。其中脂质体来自美国罗氏公司的X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent。脂质体：Kir2.1单点突变体D172N质粒：减血清培养基(Opti-MEM I，美国生命技术公司)＝1.5微升：0.5钠克：50微升。上述条件继续培养24小时后，得到表达有Kir2.1单点突变体D172N通道的HEK293T细胞。

[0040] 所述的质粒D172N利用定点突变技术获得。本实施例利用美国Agilent Technologies公司的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒。具体包括以下步骤：

[0041] 1，取以下试剂置入250微升离心管并混匀：2.5微升5ps buffer；0.5微升dNTP；2微升引物1；2微升引物2；2微升浓度为12.5纳克每微升的Kir2.1质粒；15.5微升的超纯水；0.5微升的PrimerSTAR。其中，引物1的序列为5'-ccagtcaattgtaggctgcatcattaacgccttcatcat-3'；引物2的序列为5'-atgatgaaggcgttaatgatgcagcctacaattgactgg-3'。引物由上海生工合成，利用高效液相色谱方法进行纯化。小鼠pcDNA3.1-Kir2.1DNA质粒购自广州复能基因公司。其他试剂均来自QuikChange II Site-Directed MutagenesisKit试剂盒。

[0042] 2，按照如下程序在基因扩增分析仪进行质粒扩增：

[0043]

[0044] 3，利用Dpn1酶对步骤2的产物按照如下配方进行消化：取步骤2的产物8.5微升、10T buffer 1微升、Dpn10.5微升置入250微升离心管，37℃水浴5小时。其中，10T buffer、Dpn1来自试剂盒QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit。

[0045] 4，利用常规通用的质粒抽提方法对步骤3得到的产物进行扩增，得到Kir2.1的单点突变D172N质粒。

[0046] Kir2.1通道的电流用膜片钳来记录，其中膜片钳放大器型号为德国HEKA公司的EPC10，记录模式选择内向外模式。首先，将不含氢化肉桂酸的细胞浴液孵育HEK293T细胞时，Kir2.1通道呈现出很强内向整流特性(图1A)。当继续灌流含有20mM氢化肉桂酸的浴液后，D172N的外向电流消失(图1B)。这证明了含有20mM氢化肉桂酸的细胞浴液有效的抑制了Kir2.1突变体D172N的外向电流。最后将细胞浴液再次更换为无氢化肉桂酸的细胞浴液时，膜片钳重新记录到了D172N典型的外向电流(图1C)。这证明了Kir2.1单点突变体D172N仍然具有正常的功能，也就是氢化肉桂酸并没有破坏Kir2.1通道蛋白，而是通过抑制其外向电流而起 作用的。

[0047] 图2记录的是含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液对D172N在+30mV时的外向电流的影响。从图中可以看到，无氢化肉桂酸的细胞浴液孵育时，此电流最大。灌流含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液后，此电流逐渐降低至最小。当再次灌流无氢化肉桂酸的细胞浴液时，此电流又恢复至最大。这说明了含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液能够有效抑制D172N的外向电流。

[0048] 实施例2

[0049] 采用膜片钳测试方法记录含有不同摩尔浓度氢化肉桂酸的细胞浴液对Kir2.1单点突变体D172N外向电流抑制的代表性实验结果：

[0050] Kir2.1单点突变体D172N的定点突变、HEK293T细胞准备及转染、细胞浴液、玻璃微电极内液配方、膜片钳设置模式同实施例1。

[0051] 含不同浓度氢化肉桂酸的细胞浴液(50mL)配置方法如下：

[0052]

[0053] IC50值为某种抑制剂抑制通道最大电流一半所需剂量，它反映出此种试剂抑制通道电流的能力。IC50值由其量效曲线给出，量效曲线为通道外向电流大小随抑制剂浓度的变化曲线。膜片钳对HEK293T细胞的同一封接，记录含有不同摩尔浓度氢化肉桂酸的细胞浴液孵育HEK293T细胞后Kir2.1单点突变体D172N外向电流。取不同氢化肉桂酸浓度下，+30mV的Kir2.1单点突变体D172N外向电流，绘制氢化肉桂酸抑制D172N外向电流的量效曲线(图3，n＝6)。其中IC50为3.67mM，也即利用含有3.67mM氢化肉桂酸的细胞浴液孵育HEK293T细胞时，能够抑制E299V在膜电位为+30mV时最大外向电流的50％。

[0054] 实施例3

[0055] 其他步骤同实施例1，不同之处为把单点突变D172N换为E299V，所用到的引物1为5'-cgcctccaccatgcctaccagtatgacaacaat-3'，引物2为5'-attgttgtcatactggtaggcatggtggaggcg-3'。其测试结果为图4，其测试效果同实施例1。短QT3综合征的另一病因是Kir2.1通道蛋白的E299V单点突变，这一单点突变体有着更强的外向电流。这一很强的外向电流引起了短QT3综合症。无氢化肉桂酸的细胞浴液孵育转染有E299V的HEK293T细胞，膜片钳记录到了很强的外向电流(图4A)。当灌流氢化肉桂酸与细胞浴液的混合物后，E299V产生的外向电流消失(图4B)。这证明了氢化肉桂酸能够抑制E299V的外向电流。当用无氢化肉桂酸的细胞浴液灌流后，E299V的外向电流重新出现(图4C)，这证明了氢化肉桂酸未破坏E299V通道蛋白的结构。

[0056] 图5记录的是含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液对E299V在+30mV时的外向电流的影响。从图中可以看到，无氢化肉桂酸的细胞浴液孵育时，此电流最大。灌流含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液后，此电流逐渐降低至最小。当再次灌流无氢化肉桂酸的细胞浴液时，此电流又恢复 至最大。这说明了含20mM氢化肉桂酸的细胞浴液能够有效抑制E299V的外向电流。

[0057] 实施例4

[0058] 其他步骤同实施例2，不同之处为把单点突变D172N换为E299V。含有不同浓度氢化肉桂酸(1、2、5、10、16和20mM)的细胞浴液对E299V外向电流的抑制效果如图6。其中IC50为2.56mM，此时氢化肉桂酸和细胞浴液混合物能够抑制E299V在膜电位为+30mV时最大外向电流的50％。其他测试效果同实施例2。

[0059] 实施例5－8

[0060] 将实施例1、2、3、4中使用的细胞浴液的组成改为：包含140mM的KCl，10mM的K-HEPES，1mM的K-EGTA，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L，其他步骤同实施例1，2，3，4，得到实施例5，6，7，8。其膜片钳测试效果同对应的实施例1、2、3、4。

[0061] 实施例9－12

[0062] 其他步骤同实施例1、2、3、4，不同之处为细胞浴液的组成改为：包含110mM的KCl，10mM的KH2PO4，2mM的EDTA，5mM的HEPES，1.9mM的K2ATP，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为
7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L。其他步骤同实施例1，2，3，4，得到实施例9，10，11，
12。其膜片钳测试效果同对应的实施例1、2、3、4。

[0063] 实施例13－16

[0064] 其他步骤同实施例1、2、3、4，不同之处为细胞浴液的组成改为：包含123mM的KCl,5mM的K2EDTA,7.2mM的K2HPO4,8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L。其他步骤同实施例1，2，3，4，得到实施例13，14，15，16。其膜片钳测试效果同对应的实施例1、2、3、4。

[0065] 实施例17－20

[0066] 其他步骤同实施例1、2、3、4，不同之处为细胞浴液的组成改为：包含120mM的KCl，4mM的K2EDTA，7.2mM的K2HPO4，2.8mM的KH2PO4，溶剂为超纯水，KOH调节溶液pH为7.3，蔗糖调节渗透压为290～310mOsm/L。其他步骤同实施例1，2，3，4，得到实施例17，18，19，20。其膜片钳测试效果同对应的实施例1、2、3、4。

[0067] 实施例1-20中，利用含有氢化肉桂酸的细胞浴液孵育转染有D172N或者E299V的HEK293T细胞，则膜片钳记录到的D172N或者E299V的外向电流均消失。也就是说含有氢化肉桂酸的细胞浴液能够有效的抑制D172N或E299V的外向电流，但不会破坏Kir2.1通道蛋白的结构。根据本发明的启示，研究人员可以将氢化肉桂酸与细胞浴液作为Kir2.1外向电流的抑制剂，通过对患病细胞的处理，来研制短QT3综合症或其他相关病症的有效治疗药物。

[0068] 本发明未尽事宜为公知技术。