副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-L3及其应用

摘要

本发明公开了副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL‑L3及其应用。本发明提供了一种蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列6第6‑106位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)或b)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明证明重组EVPL‑L3是副肿瘤性天疱疮主要表位并可辅助诊断。

权利要求

1.一种蛋白质，是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）由序列表中序列6第6-106位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1）-4）中任一种DNA分子：

1）编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；

2）编码区为在序列表中序列5第16-318位所示的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述DNA分子在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。

6.一种诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮的试剂盒，包括抗原，所述抗原为序列2第6-106位所示的蛋白与标签连接后的融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特性在于：所述抗原为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述试剂盒还包括抗所述标签的抗体和二抗；

所述试剂盒为间接酶联免疫试剂盒。

8.权利要求6或7所述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用。

说明书

副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-L3及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-L3及其应用。

背景技术

[0002] 副肿瘤性天疱疮是一种自身免疫性大疱性皮肤病，包斑蛋白和周斑蛋白是患者血清中抗体识别率最高的主要抗原。筛选出其抗原表位有利于临床上建立高敏感度及特异度的诊断方法,同时有利于科研上进一步深入研究其发病机制。副肿瘤性天疱疮伴发多种淋巴系统来源肿瘤，国外报道半数以上为非霍奇金淋巴瘤，而我国与国外伴发的肿瘤谱明显不同,伴有Castleman病的副肿瘤性天疱疮患者占多数,因此筛选并找到副肿瘤性天疱疮中国患者独特的抗原表位对我国患者的诊治和预后具有重大的临床意义。

发明内容

[0003] 本发明的一个目的是提供副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-L3。

[0004] 本发明提供了一种蛋白质，命名为EVPL-L3，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

[0005] a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0006] b)由序列表中序列6第6-106位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] c)将a)或b)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。

[0008] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0009] 编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护范围。

[0010] 上述DNA分子为如下1)-4)中任一种DNA分子：

[0011] 1)编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；

[0012] 2)编码区为在序列表中序列5第16-318位所示的DNA分子；

[0013] 3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述蛋白质的DNA分子；

[0014] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。

[0015] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0016] 上述蛋白质或上述DNA分子在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0017] 上述产品为试剂盒。

[0018] 本发明的另一个目的是提供一种诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮的试剂盒。

[0019] 本发明提供的试剂盒，包括抗原，所述抗原为序列2第6-106位所示的蛋白与标签连接后的融合蛋白。

[0020] 所述抗原为序列2；

[0021] 所述试剂盒还包括抗所述标签的抗体和二抗；

[0022] 上述试剂盒为间接酶联免疫试剂盒。

[0023] 结合所述抗原的抗体为鼠源抗his标签抗体；

[0024] 结合所述抗体的二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG。

[0025] 上述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0026] 本发明的实验证明，采用重组EVPL-L3作为检测抗原，酶联免疫吸附实验对66例副肿瘤性天疱疮患者和50例正常志愿者血清样本进行检测敏感度74.2％(49/66),特异性92％。因此，证明重组EVPL-L3是副肿瘤性天疱疮主要表位并可辅助诊断。

附图说明

[0027] 图1为包斑蛋白模式图及EVPL-L3的位置。

[0028] 图2为纯化后的EVPL-L3重组蛋白与His标签抗体行免疫印迹鉴定结果。

[0029] 图3为EVPL-L3的ROC曲线分析后结果。

具体实施方式

[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0032] pH值为9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液(CBS)：1.59g碳酸钠(北京化工厂S0148)和2.93g碳酸氢钠(北京化工厂S0037)，溶于1L去离子水(millipore水机自制)，0.45um滤器(millipore SLHV033RB)过滤，调节pH值，得到pH值为9.6浓度为0.05M的CBS。

[0033] pH值为7.5浓度为0.02M的PBST：将PBS粉剂(北京中杉金桥生物公司ZLI-9062)和Tween 20(Amresco 0777)溶于2L去离子水，PBS粉剂的浓度0.02M，Tween 20的体积百分含量为0.05％，调节pH值，得到pH值为7.5浓度为0.02M的PBST。

[0034] 封闭液：将脱脂奶粉加入上述pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5％。

[0035] 实施例1、原核表达EVPL-L3

[0036] 一、EVPL-L3的筛选

[0037] 针对包斑蛋白(Envoplakin，EVPL)的连接亚区(aa1543-aa1784)设计了三个相互重叠十多个氨基酸的片段。借助DNAstar软件，综合考虑抗原性(Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、亲水性(Antigenicity)后，将其分为3段，分别是EVPL-L1(aa1543-aa1645),EVPL-L2(aa1610-aa1717),EVPL-L3(aa1684-aa1784)；见图1。

[0038] 其中，EVPL-L1蛋白的氨基酸序列为序列2第6-108位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列1第16-324位核苷酸；

[0039] EVPL-L2蛋白的氨基酸序列为序列4第6-113位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列3第16-339位核苷酸；

[0040] EVPL-L3蛋白的氨基酸序列为序列6第6-106位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列5第16-318位核苷酸。

[0041] 二、原核表达EVPL-L3

[0042] 1、重组载体的构建

[0043] 将序列5第16-318位核苷酸所示的EVPL-L3蛋白编码基因插入pEASY-E2表达载体(全式金生物有限公司CE201-01)进行平端连接，得到的重组载体，命名为pEASY-E2-EVPL-L3，实现EVPL-L3蛋白与载体上的M G I G P和K G Q F L E H H H H H H(H是his的简写)标签共表达，得到重组EVPL-L3。

[0044] 重组EVPL-L3的氨基酸序列为序列6，第1-5位为载体上的氨基酸，第6-106位为EVPL-L3蛋白，第107-118位为his标签；

[0045] 重组EVPL-L3的编码基因的核苷酸序列为序列5，第1-15位为载体上的M G I G P编码核酸，第16-318位为EVPL-L3蛋白编码基因，第319-357位为his标签编码基因。

[0046] 2、重组克隆感受态的构建

[0047] 将重组载体pEASY-E2-EVPL-L3导入大肠杆菌Trans1-T1(全式金生物有限公司CD5010-01)中，得到重组菌Trans1-T1-EVPL-L3。

[0048] 提取重组菌的质粒送去测序，质粒为pEASY-E2-EVPL-L3的为阳性重组质粒。

[0049] 3、重组EVPL-L3蛋白表达

[0050] 将上述的阳性重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)Chemically Competent Cell(全式金生物有限公司CD801-01)，在固态LB上挑取单克隆后摇菌，分装冻存。复苏表达感受态细胞，过夜培养后1:50接种至液态LB，37℃，200rpm/min,摇至OD600＝0.6，加入终浓度0.05mM的诱导剂IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,全式金生物有限公司GF101-01)，37℃，200rpm/min，诱导5小时。4℃，10000rpm离心10min收集菌体，并重悬至含蛋白酶抑制剂(罗氏Complete tablets EDTA-free,EASYpack 04693132001)的结合缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH 8.0)中，得到菌体悬浮液。

[0051] 4、纯化重组EVPL-L3蛋白

[0052] 菌体悬浮液用超声破碎仪裂解(300W功率，超声5s停10s,持续20min)菌体，4℃，14000g，20min离心，取上清0.45um滤器过滤，加入咪唑，使其终浓度为10mM/L，使用镍柱亲和层析技术纯化，将准备好上清加入镍柱(Ni-NTA His Bind Resins默克公司70666-3,流速1ml/min)4℃，100rpm，摇1小时，含20mM咪唑的漂洗缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH 8.0，20mM咪唑)漂洗，250mM咪唑的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，PH8.0，
250mM咪唑)洗脱目的蛋白。

[0053] 收集2倍柱体积的洗脱液即为分子质量为13.6KD的重组EVPL-L3。

[0054] 将重组EVPL-L3进行SDS-PAGE电泳，重组EVPL-L3的分子质量为13.6KD(图2)；结合TM缓冲液100倍EVPL-N1蛋白体积，4℃条件下透析2次除去咪唑，以BSA标准品(Pierce  Bovine Serum Albumin Standard Ampules,23209,2mg/mL)为对照，经过染胶，扫描照片，在Bandscan软件分析重组EVPL-L3的纯度及浓度。同时BCA法检测蛋白浓度。

[0055] 结果重组EVPL-L3的纯度为80％；重组EVPL-L3的浓度为670ug/ml。

[0056] 采用同样的方法将EVPL-L1编码基因和EVPL-L2编码基因进行原核表达，得到重组EVPL-L1蛋白和重组EVPL-L2蛋白。

[0057] 重组EVPL-L1的氨基酸序列为序列2，第1-5位为载体上的M G I G P，第6-108位为EVPL-L1蛋白，第109-120位为his标签；

[0058] 重组EVPL-L1的编码基因的核苷酸序列为序列1，第1-15位为载体上的M G I G P编码核酸，第16-324位为EVPL-L1蛋白编码基因，第325-363位为his标签编码基因。

[0059] 重组EVPL-L2的氨基酸序列为序列2，第1-5位为载体上的M G I G P，第6-113位为EVPL-L1蛋白，第114-125位为his标签；

[0060] 重组EVPL-L2的编码基因的核苷酸序列为序列1，第1-15位为载体上的M G I G P编码核酸，第16-339位为EVPL-L1蛋白编码基因，第340-378位为his标签编码基因。

[0061] 实施例2、重组EVPL-L3用来诊断副肿瘤性天疱疮

[0062] 待测样本为66例副肿瘤性天疱疮患者(已经确诊，患者知情)和50例正常志愿者的血清样品。用间接酶联免疫吸附法检测待测样本，具体如下：

[0063] 1、包被抗体：用pH值为9.6浓度为0.05M的CBS按照体积比为1：100稀释原浓度为1mg/ml的鼠源抗his标签抗体(全式金生物有限公司HT501-01)，得到包被抗体，按照每孔加入50微升包被抗体至96孔板，4℃过夜；

[0064] 次日用300微升pH值为7.5浓度为0.02M的PBST洗板三次，每次1分钟；

[0065] 扣干孔板，加入200微升封闭液封闭，室温，1小时；

[0066] 再次洗板(同上)，扣干孔板，得到包被抗体孔板；

[0067] 2、捕获抗原：用封闭液按照体积比为1：100稀释实施例1制备的纯度为80％、浓度为670ug/ml的重组EVPL-L3，得到稀释抗原，

[0068] 将稀释抗原按照每孔50微升加入上述包被抗体孔板，37℃，1小时；

[0069] 洗板(同上)，扣干孔板，得到捕获抗原孔板；

[0070] 3、加入待测样本：用封闭液按照体积比为1：100稀释待测样本，得到稀释待测样本，

[0071] 将稀释待测样本按照每孔50微升加入上述捕获抗原孔板，37℃，2小时；

[0072] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入待测样本孔板；

[0073] 4、加入二抗：用封闭液按照体积比为1：6000稀释碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG二抗(Life technologies 81-7122)，得到稀释二抗(原浓度为1.0mg/ml)；

[0074] 将稀释二抗按照每孔50微升加入上述捕获抗原孔板，37℃，2小时；

[0075] 洗板4次，每次1分钟，扣干孔板，得到加入二抗孔板；

[0076] 5、显色：避光环境下按照每孔加入100微升显色液(用去离子水按照体积比1：4稀释分析液(生工生物C510014-0500)，将试剂盒中10mg干粉p-NPP溶于10ml稀释过的分析液即配制成显色液)至二抗孔板中，室温30分钟后按照每孔加入50微升终止液(生工生物C510014-0500)。在显色试剂盒推荐的波长405nm下读结果。

[0077] 6、计算：Index＝样本读数OD405-空白对照孔读数OD405。

[0078] 结果如表1所示。

[0079] 表1

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084] 经Medcalc软件分析，cut-off值为0.024。

[0085] 若待测样本的OD值大于0.024，则待测样本为或候选为副肿瘤性天疱疮患者；

[0086] 若待测样本的OD值不大于0.024，则待测样本不为或候选不为副肿瘤性天疱疮患者；

[0087] 灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；

[0088] 特异度＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。

[0089] 上述结果作图见图3所示，表明，采用重组EVPL-L3作为检测抗原，ELISA检测，66例副肿瘤性天疱疮患者中有49例的OD值大于0.024值，检测为副肿瘤性天疱疮患者，本方法的检测敏感度74.24％(49/66)；50例正常志愿者中有46例的OD值不大于0.024值，检测不为副肿瘤性天疱疮患者，特异性92％(46/50)。

[0090] 采用同样的方法以重组EVPL-L1和重组EVPL-L2分别作为抗原检测，[0091] 重组EVPL-L1作为检测抗原，ELISA检测，cut-off值为0.013，66例副肿瘤性天疱疮患者中有24例的OD值大于cut-off值，检测为副肿瘤性天疱疮患者，检测敏感度36.36％(24/66)；50例正常志愿者中有40例的OD值不大于cut-off值，检测不为副肿瘤性天疱疮患者，特异性80％(40/50)。

[0092] 重组EVPL-L2作为检测抗原，ELISA检测，cut-off值为0.0465，66例副肿瘤性天疱疮患者中有34例的OD值大于cut-off值，检测为副肿瘤性天疱疮患者，检测敏感度51.52％(34/66)；50例正常志愿者中有48例的OD值不大于cut-off值，检测不为副肿瘤性天疱疮患者，特异性96％(48/50)。

[0093] 因此，证明重组EVPL-L3可以作为副肿瘤性天疱疮的检测标志物，且灵敏度高，含有其的试剂盒可以用来诊断或辅助诊断副肿瘤性天疱疮。