来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术

摘要

来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术本发明提供了一种嗅粘膜神经元的分离培养、传代、冻存、分化技术。特色步骤包括：1、嗅粘膜神经元基础培养基的配置；2、原代培养技术；3、专用传代培养基的配置：收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元传代培养基；4、重复传代培养技术；5、冻存保护液的配置；收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元细胞冻存液；6、超低温冷冻保存；7、细胞复苏分化技术。本专利选取上鼻甲三分之一嗅区粘膜进行分离培养增殖、冻存、分化，并获得大量高纯度的嗅粘膜神经元细胞，目前大量基础和临床实验结果证明，该细胞具有综合神经修复作用，能有效改善神经系统疾病和损害患者的神经损伤功能和生存质量。

权利要求

1.一种来源于嗅粘膜的神经元细胞的制备方法，其特征在于以下操作步骤：(1)嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配制：用DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA神经营养生长因子配制嗅粘膜嗅神经元基础培养基；

(2)培养瓶包被：用多聚赖氨酸包被培养瓶；

(3)原代培养：将获自上鼻甲三分之一嗅区粘膜的嗅粘膜组织块加入基础培养基混匀，转移至事先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中使其贴壁，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，获取单细胞；

(4)专用传代培养基的配制：收集要传代细胞培养基的上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基并以上清液∶基础培养基＝0.5∶1的比例进行混合，制成专用传代培养基；

(5)重复传代培养：按照1∶3的比例将步骤(3)原代培养获取的单细胞加入步骤(4)配制的传代培养基，制成细胞悬液，然后转移至事先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，重复传代；

(6)冻存保护液的配制：收集要冻存细胞的培养基上清液，将人血白蛋白、细胞培养上清液、DMEM/F12、DMSO混合配制获得细胞专用冻存液；

(7)超低温冷冻保存：收集细胞，按照比例加入步骤(6)配制的冻存保护液，按常规程序冷冻保存；

(8)复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(1)嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配制：A.用DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA按比例配制成基础培养基，B.超级洁净工作台内过滤除菌，C.无菌密封分装，4℃储存备用。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(3)原代培养：在培养箱中放置30min后，加入基础培养基。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(4)专用传代培养基的配制：A.收集每次要传代细胞的培养基上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基配成专用传代培养基并以上清液∶基础培养基＝0.5∶1的比例进行混合，B.用0.22μm滤器过滤传代培养基，用于本次传代细胞培养基。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(5)重复传代培养：A.当细胞生长约90％左右时，用常规方法收集细胞，B.按照收集的细胞∶专用传代培养基＝1∶3的比例将收集的细胞加入专用传代培养基，制成细胞悬液，然后转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，进行重复传代，C.培养2天后，二分之一换液补加基础培养基。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(6)冻存保护液的配制：A.收集要冷冻细胞的培养基上清液，B.以人血白蛋白∶细胞培养上清液∶DMEM/F12∶DMSO＝5∶2∶2∶1的比例混合配制冻存液，C.用0.22μm滤器过滤冻存液，用于本次细胞冻存的保护液。

7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(7)超低温冷冻保存：收集细胞，按照比例加入冻存保护液，按常规程序冷冻保存。

8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(8)复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。

说明书

来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术

[0001] 技术领域：本发明属于细胞培养技术领域，涉及嗅粘膜神经元细胞的分离培养、传代扩增、超低温冻存、分化技术

[0002] 发明背景：嗅神经元（Olfactory neurons）在神经系统中嗅觉系统非常独特，嗅神经元位于鼻中隔上1/3的中分及邻近的两侧上鼻甲为细胞呈梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形.两端分别通向纤毛和集成嗅丝穿过筛孔进入嗅球。嗅神经元细胞在自然更新或者受损后，新的神经元细胞能很快生长代替，维持嗅神经传导通路和功能完整性。嗅神经元是目前所发现神经系统中可以再生的细胞之一，具有终身再生功能。嗅神经元和嗅球嗅鞘细胞由原始外胚层的嗅板(olfactory placode)发育分化而来，其生物学特性包括免疫组织化学染色阳性标记物为S100、P75(L-NGFR)等。嗅神经元能够释放多种神经营养因子、神经粘附分子，是神经系统中再生能力最强的神经元细胞，具有重要的损伤神经修复（包括替代、再生）和功能重建作用，是中枢神经修复治疗的理想候选细胞之一。由于目前很难获得大量纯度较高的嗅神经元，因此现阶段该细胞无法在临床治疗上大范围推广应用。本专利具有以下优点：1、嗅神经元细胞在体内可以终生再生。2、可通过简单的鼻腔粘膜活检获得。3、提取部分嗅粘膜对嗅觉功能无影响。4、可以进行自体移植，无免疫排斥。5、不受伦理道德约束。6、临床实验研究证明，安全有效，能提高患者生存质量。因此有很好的应用前景，可广泛应用于神经疾病和损害的临床神经修复治疗和药品开发研究等领域。

[0003] 发明内容：本发明涉及嗅粘膜神经元细胞的基础培养基、原代细胞培养、重复传代培养基、重复传代培养、冻存保护液、分化。

[0004] 本发明是采用以下步骤进行的技术方案：

[0005] 步骤1：嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配置：用含DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA 神经营养生长因子配置。

[0006] 步骤2：培养瓶包被：用多聚赖氨酸包被培养瓶。

[0007] 步骤3：嗅粘膜取材：选取上鼻甲三分之一嗅区粘膜。

[0008] 步骤4：原代培养：将嗅粘膜置于青链霉素与嗅粘膜嗅神经元基础培养基配比1:1中，反复冲洗血迹，用眼科剪剪成1MM左右的块，加入基础培养基混匀，转移至事先包被的培养瓶中使其贴壁，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，获取单个细胞。

[0009] 步骤5：专用传代培养基的配置：收集处理要传代细胞培养基的上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基配成0.5∶1。

[0010] 步骤6：重复传代培养：按照1∶3进行重复传代，收集原代培养获取的单个嗅神经元细胞，加入传代培养基制成细胞悬液，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0011] 步骤7: 冻存保护液的配置：收集处理要冻存细胞的培养基上清液，用于配置细胞专用冻存液（人血白蛋白、细胞培养上清液、DMEM/F12、DMSO）。

[0012] 步骤8：超低温冷冻保存：收集细胞，按照比例加入冻存保护液，按常规程序冷冻保存。

[0013] 步骤9：复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。

[0014] 所述步骤1嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配置为：A.用含DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA 按比例配制成基础培养基。B.超级洁净工作台内过滤除菌。C.无菌密封分装，4℃储存备用。

[0015] 所述步骤4嗅粘膜嗅神经元原代培养：A.将嗅粘膜组织块置于青链霉素与嗅粘膜嗅神经元基础培养基配比1:1中，在超级洁净工作台内反复冲洗血迹。B. 将嗅粘膜组织块转移至玻璃皿内，放入冰盒上，用眼科剪剪成＜1mm3的块。C.收集剪碎的组织块，转移至事先用多聚赖氨酸包被过培养瓶中，使其贴壁各组织块相互距离为3mm-7mm左右为宜，转移至避光37℃，5％CO2培养箱中。D.在培养箱中放置30min后，加入基础培养基。

[0016] 所述步骤5专用传代培养基的配置：A.收集每次要传代细胞的培养基上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基配成专用传代培养基（上清液∶基础培养基=0.5∶1）。B.用0.22μm滤器过滤传代培养基，用于本次传代细胞培养基。

[0017] 所述步骤6重复传代培养：A.当细胞生长约90%左右时，用常规方法收集细胞。B.加入专用传代培养基制成细胞悬液，按照1∶3进行重复传代，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养。C.培养2天后，二分之一换液补加基础培养基。

[0018] 所述步骤7冻存保护液的配置：A.收集要冷冻细胞的培养基上清液。B.冻存液（人血白蛋白∶细胞培养上清液∶DMEM/F12∶DMSO＝5∶2∶2∶1）。C.用0.22μm滤器过滤冻存液，用于本次细胞冻存的保护液。

附图说明

[0019] 图1嗅黏膜嗅神经元细胞进行镜检(嗅粘膜嗅神经元细胞镜检放大倍数： 10×/0.25)。

[0020] 图2嗅粘膜嗅神经元共聚焦显微镜免疫组化化学染色鉴定镜检(嗅粘膜嗅神经元细胞镜检放大倍数： 40×/0.75)。

具体实施方式

[0021] 1、嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配置：用含DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA 按比例配制成基础培养基。超级洁净工作台内过滤除菌。无菌密封分装，4℃储存备用。

[0022] 2、培养瓶包被：用常规方法多聚赖氨酸液包被培养瓶过夜。

[0023] 3、嗅粘膜取材：常规鼻内窥镜手术选取上鼻甲三分之一嗅区上皮组织。

[0024] 4、嗅粘膜嗅神经元原代培养：将嗅粘膜组织块置于青链霉素与嗅粘膜嗅神经元基础培养基配比1:1中，在超级洁净工作台内反复冲洗血迹。将嗅粘膜组织块转移至玻璃皿3
内，放入冰盒上，用眼科剪剪成＜1mm的块。收集剪碎的组织块，转移至事先用多聚赖氨酸包被过培养瓶中，使其贴壁各组织块相互距离为3mm-7mm为宜，转移至避光37℃，5％CO2培养箱中。在培养箱中放置30min后，加入基础培养基；

[0025] 5、专用传代培养基的配置：收集每次要传代细胞的培养基上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基配成专用传代培养基（上清液∶基础培养基=0.5∶1）。用0.22μm滤器过滤传代培养基，用于本次传代细胞培养基。

[0026] 6、重复传代培养：当细胞生长约90%左右时，用常规方法收集细胞。加入专用传代培养基制成细胞悬液，按照1∶3进行重复传代，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养。培养2天后1/2换液补加基础培养基。

[0027] 7、冻存保护液的配置：收集要冷冻细胞的培养基上清液，冻存液（人血白蛋白∶细胞培养上清液∶DMEM/F12∶DMSO＝5∶2∶2∶1）。用0.22μm滤器过滤冻存液，用于本次细胞冻存的保护液。

[0028] 8、细胞冻存：细胞融合生长至90%左右，常规方法收集细胞，加入冻存保护液调细胞的最终密度为5×10 6/ml2～5×107/ml2；置于4℃20min，-20℃60min，-80℃低温过夜后置于液氮中。

[0029] 9、复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。

[0030] 本发明优点是提供人嗅粘膜嗅细胞的提取和培养方法能快速获得大量嗅粘膜嗅神经元，并且能长时间维持嗅粘膜嗅神经元的增殖能力，在传代至第 10 代后获得的细胞仍然具有嗅神经元的活性，本发明方法简单，可重复性强，操作简便易行，为嗅神经元应用于神经修复学临床治疗研究提供了稳定的技术和可靠的移植细胞来源。

[0031] 实施案例对本发明进行说明

[0032] 实例 1 ：

[0033] 获取嗅黏膜组织块 ( 大小 2×2mm)1块，在超级洁净台内，无菌操作条件下用含 1％青霉素基础培养基反复冲洗，去除残留血迹。在玻璃培养皿中用无菌眼科剪将其剪成直径＜约 1mm3的组织块，收集组织块接种于经Poly-L-lysine包被过的斜口塑料培养瓶中，各组织块相互距离3mm左右为宜，置于避光 37℃，5％ CO2 培养箱中，培养30min后，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基继续培养。培养第4天，微镜下观察到贴壁的组织块周围有梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形的细胞生长时半量换液。培养第 6天，细胞约 90％融合，按 1 ∶3传代，传代前收集收集培养基上清过0.22μm滤器，收集原代细胞制成细胞悬液，经台盼蓝染色后显微镜下计数活细胞，传代细胞的密度为1×104 cm2，之后可达到每 3-4 天传一代，根据细胞生长情况，半量换液补加基础培养基。

[0034] 超低温冻存：细胞融合生长至90%左右，收集培养基上清过0.22μm滤器，收集细胞加入冻存液，调节细胞的最终密度为5×10 6/ml2 ，将细胞吸至超低温冻存管中1ml/支。置于4℃20min，-20℃60min，-80℃超低温冷冻过夜后置于液氮罐中。

[0035] 最终得到充足的嗅神经元细胞。

[0036] 实例 2 ：

[0037] 获取嗅黏膜组织块 ( 大小 2×2mm)2块，在超级洁净台内，无菌操作条件下用含 1％青霉素基础培养基反复冲洗，去除残留血迹。在玻璃培养皿中用无菌眼科剪将其剪成直径＜约 1mm3的组织块，收集组织块接种于经Poly-L-lysine包被过的斜口塑料培养瓶中，各组织块相互距离4mm左右为宜，置于避光 37℃，5％ CO2 培养箱中，培养30min后，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基继续培养。培养第3天，微镜下观察到贴壁的组织块周围有梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形的细胞生长时半量换液。培养第 5天，细胞约 90％融合，按 1 ∶2传代，传代前收集收集培养基上清过0.22μm滤器，收集原代细胞制成细胞悬液，
4
经台盼蓝染色后显微镜下计数活细胞，传代细胞的密度为1×10 cm2，之后可达到每 3-4 天传一代，根据细胞生长情况，半量换液补加基础培养基。

[0038] 超低温冻存：细胞融合生长至90%左右，收集培养基上清过0.22μm滤器，收集细胞加入冻存液，调节细胞的最终密度为5×10 6/ml2，将细胞吸至超低温冻存管中1ml/支。置于4℃20min，-20℃60min，-80℃超低温冷冻过夜后置于液氮罐中。

[0039] 最终得到充足的嗅神经元细胞。

[0040] 实例3：

[0041] 获取嗅黏膜组织块 ( 大小 2×2mm)3 块，在超级洁净台内，无菌操作条件下用含 1％青霉素基础培养基反复冲洗，去除残留血迹。在玻璃培养皿中用无菌眼科剪将其剪成直径＜约 1mm3的组织块，收集组织块接种于经Poly-L-lysine包被过的斜口塑料培养瓶中，各组织块相互距离5mm左右为宜，置于避光 37℃，5％ CO2 培养箱中，培养30min后，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基继续培养。培养第3天，微镜下观察到贴壁的组织块周围有梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形的细胞生长时半量换液。培养第 5天，细胞约 90％融合，按 1 ∶ 3传代，传代前收集收集培养基上清过0.22μm滤器，收集原代细胞制成细胞悬
4
液，经台盼蓝染色后显微镜下计数活细胞，传代细胞的密度为1×10 cm2，之后可达到每 
3-4 天传一代，根据细胞生长情况，半量换液补加基础培养基。

[0042] 超低温冻存：细胞融合生长至90%左右，收集培养基上清过0.22μm滤器，收集细胞加入冻存液，调节细胞的最终密度为5×10 6/ml2，将细胞吸至超低温冻存管中1ml/支。置于4℃20min，-20℃60min，-80℃超低温冷冻过夜后置于液氮罐中。

[0043] 最终得到充足的嗅神经元细胞。

[0044] 将所培养的嗅黏膜嗅神经元细胞进行倒置显微镜镜检和共聚焦显微镜免疫组化化学染色鉴定镜检。结果显示：图1普通倒置微镜下观察到贴壁的细胞呈梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形；共聚焦显微镜检图片2(A)是绿色荧光，S100免疫细胞化学染色。(B)是红色荧光，p75(L-NGFR)免疫细胞化学染色。(C)是蓝色荧光，Hoechst标记细胞核。(D)是全光谱荧光图。放大倍数：40×/0.75。所培养的细胞高表达嗅神经元细胞阳性标记物S100、P75(L-NGFR)。

[0045] 以上对本发明结合实施例做具体说明，但本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。