抗凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株

摘要

本发明涉及分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明通过用牛血清白蛋白BSA与人凝血因子IX偶联后的偶联物作为抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养，利用有限稀释法通过多次克隆化，最后筛选获得稳定分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株。根据本发明制备的一株杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015197。

权利要求

1.一种分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是命名为F9-M-01，于2015年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015197的杂交瘤细胞株，其中所述杂交瘤细胞株F9-M-01分泌的单克隆抗体亚型为IgM。

说明书

抗凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株

技术领域

[0001] 本发明涉及杂交瘤细胞株及其制备方法，具体地，涉及抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。

背景技术

[0002] 凝血因子是参与凝血过程的一种重要蛋白质成分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。在血友病患者中，有一部分病人是血友病B，即乙型血友病，乙型血友病(hemophilia B)又名血浆凝血活酶成分(PTC)缺乏症或第IX因子缺乏症。此型临床表现酷似甲型，遗传方式亦为X连锁隐性遗传，由于杂合子IX因子活性仅为正常1/3，某些杂合子可出现症状，故女性病人较甲型多见。该类病人主要缺少正常人所拥有的凝血因子IX，目前仍没有根治的方法，只能通过输注人凝血因子IX替代产品进行治疗。

[0003] 人凝血因子IX分子结构复杂，分子量为60-80kDa。其在血浆中的含量仅为0.1-0.2μg/mL。由于其提取技术非常困难，而我国在大规模亲和层析技术上比较落后，目前尚没有亲和层析法制备的高纯凝血因子类产品问世。因此，造成了目前国内市场上凝血因子IX产品严重不足，不能充分供给国内乙型血友病患者使用，经常会出现断药的情况，危害国内患者的健康和生命安全。

[0004] 血浆蛋白的层析分离技术的难点在于血浆的高粘度和一次处理的巨大体积。对于凝血因子类微量血浆蛋白的分离，亲和层析是最佳的纯化方式。目前，国际上多数企业，包括最大的血液制品企业CSL也采用低温乙醇联合层析的方法来分离血浆蛋白。在上世纪90年代，百特已采用抗体亲和层析法来制备超纯VIII因子和VII因子，比活性可达3000IU/mg,总体活性回收率超过30％。而我国目前制备凝血因子IX则仍采用冷沉淀粗制获得，比活性多低于100IU/mg，活性回收率约在6％左右。

[0005] 因此，为了利用亲和层析大幅度提高凝血因子的分离效率，其关键技术瓶颈是制备有效的亲和层析用抗体。因而，本领域中存在着对特异性凝血因子IX单克隆抗体的需求。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。

[0007] 在第一个方面，本发明提供了一种制备分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法(在本文中有时也简称为“本发明的方法”)，所述方法包括以下步骤：

[0008] 1)制备免疫抗原：通过同型双功能蛋白交联剂将人凝血因子IX与牛血清白蛋白偶联，得到人凝血因子IX-牛血清白蛋白偶联物；

[0009] 2)免疫小鼠：采用小剂量长周期免疫方案，利用步骤1)中得到的人凝血因子IX-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原，对Balb/c小鼠进行免疫；

[0010] 3)细胞融合：将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养；

[0011] 4)杂交瘤细胞的选择性培养：在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性培养后，选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞；以及

[0012] 5)单克隆化：将步骤4)中获得的经检测为阳性的杂交瘤细胞经有限稀释法进行多次单克隆获得稳定分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0013] 在第二个方面，本发明提供了分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株(下文中有时称为“本发明的杂交瘤细胞株”)，所述杂交瘤细胞株是通过本发明的方法制备的。

[0014] 在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法制备的一株杂交瘤细胞株于2015年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015197，培养物名称为：杂交瘤细胞株F9-M-01。

具体实施方式

[0015] 定义：

[0016] “蛋白交联剂”是一类小分子化合物，其分子两端各有一个或者更多个针对特殊基团(-NH2、-COOH、-HS等)的反应性末端，可以和生物分子上的活性基团分别偶联，从而使这些分子结合在一起。蛋白交联剂可分为同型双功能交联剂(也称为“同源交联剂”)、异型双功能交联剂(也称为“异源交联剂”)和光活化交联剂(也称为“光反应性交联剂”)三类。

[0017] 同型双功能蛋白交联剂的分子两端具有相同的反应性末端或活化反应基团。常用的同型双功能交联剂在本领域中是公知的，其非限制实例包括但不限于，NHS酯类交联剂诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、琥珀酸辛二酸二亚胺(DSS)和丁二烯-苯乙烯共聚物(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)和Sulfo-DST、双(2-[琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)和sulfo-BSOCOES、乙二醇双[琥珀酰亚胺基丁二酸](EGS)和sulfo-EGS、琥珀酸辛二酸戊二酸盐(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)；碳二亚胺类诸如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)；亚氨酯类交联剂诸如二甲基二亚胺酯(DMA)、二甲基亚胺酯(DMP)、二甲基苯二酸亚胺酯(DMS)、二叔丁基过氧化物(DTBP)；巯基反应类交联剂诸如1,4-二(3`-[2`-二硫基吡啶]丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)；二氟苯衍生物的1,5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)、双(4-氟-3-硝基苯基)亚砜(DFDNPS)等；光反应性交联剂类交联剂诸如双-[β-(叠氮基水杨酰基氨基)乙基]二硫化物(BASED)等；醛类交联剂诸如甲醛、戊二醛等；双环氧化物类的1,4-丁二醇缩水甘油醛等；酰肼类交联剂诸如己二酸二酰肼、碳酰肼等；双重衍生物类交联剂诸如被重氮的o-联甲苯胺、双重氮联苯胺等；以及双烷基卤化物等。

[0018] 光反应性交联剂是具有光反应性基团的交联剂。同型双功能交联剂的活化反应基团也可以是光反应性基团。

[0019] 表1中列出了部分同型双功能蛋白交联剂的类型、反应基团、蛋白结合基团、光活化性等性质。

[0020] 表1

[0021]

[0022] “抗体”(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

[0023] 本发明提供了一种分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法。

[0024] 在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：

[0025] 1)制备免疫抗原：通过同型双功能蛋白交联剂将人凝血因子IX与牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到人凝血因子IX-BSA偶联物；

[0026] 2)免疫小鼠：采用小剂量长周期免疫方案，利用步骤1)中得到的人凝血因子IX-BSA偶联物作用免疫抗原，对Balb/c小鼠进行免疫；

[0027] 3)细胞融合：将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞融合，在含有HAT的1640培养基中进行选择性培养；

[0028] 4)杂交瘤细胞的选择性培养：在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性培养后，选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞；以及

[0029] 5)单克隆化：将步骤4)中获得的经检测为阳性的杂交瘤细胞经有限稀释法进行多次单克隆化获得稳定分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0030] 在本发明的方法中，可以采用本领域中公知的任意同型双功能蛋白交联剂，优选碳二亚胺类蛋白交联剂，更优选EDC。

[0031] 在本发明中，动物免疫采用小剂量多次免疫方案，以小鼠为例，常规以100～200μg/只的剂量免疫，免疫3～4次。一个具体的免疫方案实例是：使用免疫抗原对7周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫，按100μg/只的免疫剂量，与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，乳化达到油包水状，将乳化的完全抗原，颈背部多点皮下注射免疫小鼠，2周后，以相同抗原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化，100μg/只进行加强免疫，2周后行第三次免疫，剂量与方法同第二次免疫，在细胞融合前对小鼠进行最后一次冲击免疫，100μg/只的免疫剂量腹腔注射。

[0032] 在本发明的方法中，细胞融合的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法和流程。

[0033] 在本发明的方法中，抗体检测的方法不受限制，可以采用本领域中公知的检测方法，例如，可以采用ELISA法。

[0034] 通过本发明的方法，可以筛选出分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0035] 作为实例，下面提供了本发明的分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株的一个示例性制备流程：

[0036] 1)免疫抗原的制备：

[0037] 取1mg人凝血因子IX溶解于0.25mLDMSO溶液中，加入EDC，室温下避光剧烈摇动2小时，4℃反应过夜，将上述溶液缓慢滴加于BSA溶液，室温下避光震荡2小时，反应产物于0.05molL-1PBS缓冲液中避光透析72小时，得到人凝血因子IX与载体蛋白BSA的偶联物。

[0038] 2)小鼠免疫：

[0039] 使用人凝血因子IX-BSA偶联物作为免疫抗原，对7周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫，按100μg/只的免疫剂量，与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，乳化达到油包水状，将乳化的完全抗原，颈背部多点皮下注射免疫Balb/c小鼠，2周后，以相同抗原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化，100μg/只进行加强免疫，2周后行第三次免疫，方法同第二次免疫，在细胞融合前对小鼠进行最后一次冲击免疫，100μg/只的免疫剂量腹腔注射。

[0040] 3)细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养：

[0041] 取SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:5-1:10的比例混合均匀，1300rpm离心7分钟，置40℃金属浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的1mL50％PEG4000，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10分钟，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入20mL含20％胎牛血清和HAT的1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的培养板上，于5％二氧化碳培养箱培养，7天后，观察细胞的生长状况，用含有20％胎牛血清和HT的1640培养基换出1/2培养基，14天后，改用20％胎牛血清和HT1640培养基培养。

[0042] 4)筛选分泌抗人凝血因子IX抗体的杂交瘤细胞：

[0043] 用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为2ug/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加含5％的脱脂奶粉(BD公司)PBS 300μl，置37℃孵育2小时，然后洗涤。加一定稀释的待检样品50μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。于各反应孔中，加入用稀释液稀释的的酶标抗体(按说明书进行稀释)50μl，37℃孵育1小时，然后洗涤。
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液50μl，在37℃显色15分钟。于各反应孔中加入2M硫酸50μl终止反应。于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。作为一种备选的判定方式，也可在ELISA检测仪上测OD值，于450nm和630双波长进行检测，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

[0044] 5)单克隆化：

[0045] 将阳性的杂交瘤细胞经有限稀释法进行多次单克隆化获得稳定分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0046] 在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法制备的一株杂交瘤细胞株命名为F9-M-01，并于2015年11月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015197。

[0047] 杂交瘤株F9-M-01的制备方法包括以下步骤：

[0048] 配制人凝血因子IX(DMSO)溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)进行活化。将上述溶液缓慢滴加于牛血清白蛋白(BSA)溶液进行人凝血因子IX与BSA的偶联，反应产物用磷酸盐缓冲液(PBS)透析，得到人凝血因子IX与载体蛋白BSA的偶联物。经四次免疫后用酶联免疫吸附试验检测被免疫小鼠尾静脉血，取血清效价大于1:10000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合；用含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)选择性培养液(HAT，购于SIGMA公司)以及20％胎牛血清的RPMI-1640(购于HYCLONE公司)培养液培养，融合后七天细胞开始形成集落；以人凝血因子IX抗原进行包被，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选；通过四次克隆化，最后获得一株稳定分泌抗人凝血因子IX单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为F9-M-01。应用此株杂交瘤细胞以1×106个/只的量腹腔注射预先用液体石蜡致敏的8-10周龄的Balb/c雌性小鼠，10-14天后采集腹水，通过酶联免疫吸附试验检测腹水为阳性，并通过蛋白质印迹法证明其能识别人凝血因子IX。经鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒测定杂交瘤细胞株F9-M-01分泌的单克隆抗体亚型为IgM。

[0049] 实施例

[0050] 1、材料和仪器

[0051] 1.1细胞株、组织标本和动物

[0052] a.骨髓瘤细胞(SP2/0)：来源于ATCC(美国模式培养物集存库)。

[0053] b.Balb/c小鼠：购自清华大学动物平台。

[0054] 1.2主要试剂

[0055] a.福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT、TMB、PEG(分子量4000)，EDC：购自Sigma公司；

[0056] b.HRP标记羊抗鼠IgG：购自Gibco公司；

[0057] c.RPMI1640培养基：购自HyClone公司；

[0058] d.醋酸纤维膜(NC)：购自Hybond公司；

[0059] e.胎牛血清：购自PAN公司；

[0060] f.鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒：购自Thermo分司；

[0061] g.包被缓冲液：每500ml去离子水中加入0.795g的碳酸钠和1.465g的碳酸氢钠组成，pH值为9.6。

[0062] h.底物缓冲液：每500ml去离子水中加入9.2g的十二水磷酸氢二钠和2.55g的柠檬酸组成，pH值为5.0。

[0063] i.TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(pH5.5)10ml 30％H2O20.01μl；

[0064] j.不完全1640培养液：每500ml的1640培养液原液中加入7.5％的碳酸氢钠15ml组成。

[0065] k.完全1640培养液：每80ml不完全1640培养液中加入20ml的胎牛血清组成。

[0066] l.抗体稀释液：每100ml的PBS加入0.1g的BSA组成。

[0067] m.洗涤缓冲液：每100ml的PBS加入0.5ml的Tween-20组成。

[0068] n.PEG配制液：每8.9ml不完全1640培养液中加入1ml的DMSO和0.1ml的7.5％碳酸氢钠组成。

[0069] 1.3主要仪器

[0070] a.二氧化碳培养箱：Heraeus公司；

[0071] b.超净工作台：苏州净化设备仪器厂；

[0072] c.倒置显微镜：Leica公司；

[0073] d.37℃恒温水育箱：余姚市东方电工仪器厂；

[0074] e.聚苯乙烯塑料板(酶标板)96孔、细胞培养板(96孔及24孔)：NEST公司；

[0075] f.离心机：Eppendorf公司

[0076] g.纯水仪：Milipore公司

[0077] h.微型垂直平板电泳槽：Bio-Rad公司

[0078] i.酶标仪：TECAN公司

[0079] 2、方法

[0080] 2.1细胞培养：骨髓瘤细胞SP2/0培养于完全1640培养液中，置于37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱，隔天换液1次，3-4天传代1次。

[0081] 2.2抗原制备：取1mg人凝血因子IX溶解于0.25mL DMSO溶液中，量取2mmol EDC加入上述溶液中，室温下避光剧烈摇动2h，之后4℃反应过夜。人凝血因子IX的偶联：将上述溶液缓慢滴加于BSA溶液(2mg蛋白溶于1mL 0.1mol L-1碳酸氢钠溶液中)，加入磁力转子，置于磁力振荡器上，室温下避光振荡2h；反应产物于0.05mol L-1PBS缓冲液中4℃下避光透析72h，每5h更换透析液一次，得到人凝血因子IX与载体蛋白BSA的偶联物。

[0082] 2.3.1小鼠免疫

[0083] 偶联后的抗原免疫Balb/c小鼠(4-8周龄，雌性)3只，具体步骤如下：

[0084] a.第一次免疫：人凝血因子IX-BSA100μg/只，加等体积福氏完全佐剂充分混匀后以1ml/只皮下多点注射Balb/c小鼠，0.2ml/点；间隔2周。

[0085] b.第二次免疫：剂量及途径同上，此次加等体积福氏不完全佐剂，间隔2周。

[0086] c.第三次免疫：剂量同上，此次加等体积福氏不完全佐剂，10天后取被免疫小鼠的尾静脉血(采集后即置4℃冰箱过夜，次日以2000转/分离心10分钟后留上清备用)，通过ELISA测定血清效价。

[0087] d.第四次免疫：剂量同上，不加佐剂，直接腹腔注射免疫。

[0088] 2.3.2ELISA法检测被免疫小鼠血清效价流程：

[0089] a.检测前一天，用包被缓冲液稀释抗原人凝血因子IX至15μg/ml，加入酶联免疫吸附板中，每孔100μl，置4℃冰箱过夜；

[0090] b.次日倒出已包被的酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；

[0091] c.分别加入用PBS行梯度稀释的待检血清(血清：PBS分别为1:100；1:1000；1:2000；1:4000；1:8000；1:16000)100μl/孔，以未免疫的Balb/c小鼠的血清为阴性对照，置37℃恒温水浴箱1小时；

[0092] d.倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；

[0093] e.每孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(用抗体稀释液行1:5000的稀释)100μl，置37℃恒温水浴箱1小时；

[0094] f.倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；

[0095] g.显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液50μl，37℃15分钟。

[0096] h.结果判定：酶标仪检测。

[0097] 通过ELISA检测结果判定三只免疫小鼠均产生针对人凝血因子IX的抗体，取其中OD值最高(效价大于10000)的小鼠进行后续步骤。

[0098] 2.3.3饲养细胞的制备(融合前一天取小鼠腹腔巨噬细胞)：

[0099] 采用7周龄的Balb/c雌性小鼠；拉颈处死，浸泡于75％酒精中消毒5分钟，用无菌剪刀剪开腹部皮肤以暴露腹膜，用无菌注射器每次注射8ml不完全1640培养液，反复冲洗，吸出冲洗液放入50ml离心管中(共用约40ml)，以1300转/分离心5分钟；弃上清后以完全1640培养液重悬沉淀，调整细胞数为4×105个/ml，加入24孔细胞培养板，500μl/孔，放入37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱培养。

[0100] 2.3.4细胞融合

[0101] a.观察骨髓瘤细胞SP2/0状态(要求在对数生长期最佳)，将配制好的50％PEG及20ml不完全1640培养液放入37℃细胞培养箱预热；(50％PEG的配制：于融合前一天配制好
50％的PEG置4℃冰箱备用，1g的PEG放入青霉素小瓶后置高压锅内高压灭菌后约得液体
1ml，于其内加入1ml的PEG配制液即得50％的PEG)；

[0102] b.将SP2/0收集于50ml无菌离心管并计数(要求细胞总数为1×106个)，离心1300转/分，共7分钟；

[0103] c.准备好无菌平皿、筛网、青霉素小瓶，拉颈处死已被四次免疫的BLAB/c小鼠，置75％酒精中浸泡5分钟；

[0104] d.取SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:5-1:10的比例混合均匀，1300rpm离心7分钟，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀；

[0105] e.置40℃金属浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的1mL50％PEG4000，边加边轻轻振荡；

[0106] f.然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10分钟；

[0107] g.1000rpm离心5分钟，弃上清，加入20mL含20％胎牛血清和HAT的1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的培养板上，于5％二氧化碳培养箱培养。

[0108] 2.3.5杂交瘤的选择性培养

[0109] 融合24小时后开始加入选择培养液，具体过程如下：

[0110] a.融合24小时后，以HAT 1.6ml及HT 0.4ml加入20ml完全1640培养液中混匀，加入24孔板内，500μl/孔；

[0111] b.隔5天后换液，将24孔板内每孔吸出1500μl后，加入拟换的完全1640培养液(每60ml完全1640培养液中加入0.6ml的HAT和0.6ml的HT组成)；

[0112] c.再隔7天后换液，将24孔板内每孔吸出1500μl后，加入拟换的完全1640培养液(每60ml的完全1640培养液中加入1.2ml的HT组成。)。

[0113] 在进行c步骤3至7天后，收集24孔板中长出细胞集落的培养孔中的细胞，进行后续步骤。

[0114] 2.3.6杂交瘤的筛选

[0115] 将2.3.5中获得的杂交瘤细胞单克隆化(单克隆化方法参考下面的2.3.7)，取其培养上清进行下述步骤：

[0116] a.包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为2μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。

[0117] b.封闭：在每个聚苯乙烯板的反应孔中加含5％的脱脂奶粉(BD公司)PBS300μl，置37℃孵育2小时，然后洗涤。

[0118] c.加样：加一定稀释的待检样品50μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

[0119] d.加酶标抗体：于各反应孔中，加入用稀释液稀释的的酶标抗体(按说明书进行稀释)50μl。37℃孵育1小时，洗涤。

[0120] e.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液50μl，37℃15分钟。

[0121] f.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl。

[0122] g.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在ELISA检测仪上于450nm和630双波长检测OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

[0123] h.标记阳性孔，选用阳性孔内的细胞进行单克隆化。

[0124] i.结果：第一次通过酶标仪检测上清共获得15株阳性杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤通过有限稀释法进行单克隆化(见2.3.7)。

[0125] 2.3.7杂交瘤的单克隆化、扩大培养及冻存

[0126] 杂交瘤的克隆化采用有限稀释法进行，具体方法如下：

[0127] a.取融合后杂交瘤细胞于无菌离心管中，加入完全1640培养液至80ml后再加入3.2ml的HT混匀，将此混匀的悬液分别加入96孔细胞培板内，100μl/孔，每块板的右下角的最后三孔(H10、H11、H12)不加饲养细胞悬液以备稀释用，将加好的板放入37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱；

[0128] b.将要单克隆化的孔里的细胞悬浮(以200μl枪轻吹即可)并计数，将此细胞悬液移于有饲养细胞的板中的稀释孔H10中，从H10孔中取出20μl细胞悬液放入H11孔中用完全1640培养液做10倍稀释，再从H11孔中取出20μl放入H12孔中做10倍稀释；

[0129] c.取H12孔中的细胞悬液用完全1640液稀释至理论上为1个细胞/100μl，再将此稀释液分别滴入含有饲养细胞悬液的96孔板中(每孔稀释后分滴为48孔)，每孔100μl；置37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱培养；

[0130] d.1周后标记单克隆孔，以ELISA法(同前2.3.2)对单克隆孔的上清进行检测，选阳性孔内的细胞进行下一次的克隆化，如此反复三次后得到能稳定分泌单抗的杂交瘤8株(进行克隆化的一株细胞下一次克隆化的所有单克隆孔均为阳性)；

[0131] e.结果：将单克隆孔中的细胞转入24孔板中培养(1孔转1孔)，3天后于24孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后将此4孔的细胞一并转入50ml细胞培养瓶扩大培养。其中阳性最强的一株杂交瘤细胞命名为F9-M-01。

[0132] f.杂交瘤细胞的冻存：待50ml培养瓶内细胞铺满瓶底面积约70％时→将培养瓶中的细胞用吸管吹打，使其完全悬浮，将细胞悬液移于50ml无菌离心管内并计数，离心1200转/分，6分钟→弃上清，以细胞冻存液(细胞冻存液成份：50％胎牛血清；40％不完全1640培养液；10％DMSO)重悬沉淀，调节细胞密度为1×107/L→分装于冻存管，1ml/支→置-70℃冰箱过夜→次日将冻存的细胞收藏于液氮内。

[0133] 2.3.8单克隆抗体的大量生产

[0134] 以杂交瘤细胞株F9-M-01为例，取10只8-10周龄的Balb/c雌性小鼠先用液体石蜡0.3ml/只腹腔注射预致敏，1周后收集杂交瘤细胞株F9-M-01以1×106个/只(等量生理盐水稀释成1ml/只)的量腹腔注射上述预致敏的小鼠，10-14天后观察小鼠腹胀明显、行动迟缓、不思饮食且毛发错乱时即收集腹水，拉颈处死小鼠，用干净滴管将腹水吸入离心管中，离心
2000转/分，5分钟。

[0135] 结果：经ELISA法检测腹水均为阳性。

[0136] 2.4单克隆抗体亚类的鉴定

[0137] 采用鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒(Thermo公司)，具体步骤参照其说明书。

[0138] 结果：经试剂盒测定，所得杂交瘤细胞株F9-M-01分泌的单克隆抗体亚型为IgM。

[0139] 2.5蛋白质印迹法(Western blotting)

[0140] 2.5.1十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

[0141] a.按照常规方法制备分离胶和积层胶；

[0142] b.取一定量的蛋白质样品与等体积的2×SDS上样缓冲液(100mmol/l Trisbase、200mmol/l二硫苏糖醇、4％SDS、0.2溴芬兰、20％Glycerol)混合，于100℃变性5分钟；

[0143] c.按照每泳道100μg加载于不连续聚丙烯酰胺凝胶样品孔中；

[0144] d.以恒压50V(积层胶)/100V(分离胶)电泳至溴酚蓝抵达凝胶底边；

[0145] e.取出凝胶用于Western blotting。

[0146] 2.5.2Western blotting

[0147] a.SDS-PAGE凝胶经转移缓冲液(25mmol/l Tris base、192mmpl/l Dlycin、20％甲醛)浸泡10-20分钟；

[0148] b.按照3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置；

[0149] c.于室温条件下，稳流0.8mA/cm2电转移，时间90分钟；

[0150] d.用丽春红染液对NC膜进行染色，用标记笔标记蛋白分子量标准量各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红；

[0151] e.NC膜经10％脱脂奶粉于室温封闭2小时；

[0152] f.与稀释于5％脱脂奶粉抗体(新制备的单克隆抗体1:1000，抗β-actin 1:5000)4℃孵育过夜，TBST(10mmol/l Tris base、150mmol/l NaCl、0.05％Tween20、pH8.0)摇洗4次×15分钟；

[0153] g.与稀释于4％脱脂奶粉的HRP标记的羊抗鼠IgG于室温孵育4小时；

[0154] h.TBST摇洗共4次，15分钟/次；

[0155] i.等量混合ECL显色系统中A+B液，滴加至NC膜；

[0156] j.成像。

[0157] k.结果：用杂交瘤F9-M-01经小鼠腹腔注射产生的腹水经WesternBlot法检测证明该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体能够识别人凝血因子IX。