与小麦千粒重相关的Indel分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种与小麦千粒重相关的Indel分子标记。本发明在前人研究的基础上，以NCBI公布的小麦TaGSK1基因序列为模板设计引物，根据不同千粒重小麦品种豫麦8679以及和尚麦之间的序列差异开发了与小麦千粒重相关的Indel分子标记，该标记不同的等位变异能够解释千粒重表型变异的7.9％‑11.8％，其中，扩增产物大小为624bp的条带对千粒重的增加具有增效作用，扩增产物大小为609bp的条带对千粒重的降低具有增效作用。该分子标记的开发为高产小麦分子辅助育种提供了一条可行的途径。

权利要求

1.与小麦千粒重相关的Indel分子标记，其特征在于，所述Indel分子标记与小麦TaGSK1基因共分离，用于扩增所述Indel分子标记的引物对为：上游引物F：5’-CGCAAATCAAAGCTCACC-3’下游引物R：5’-CCATCCTACAAAGGCACA-3’所述引物对扩增的与小麦较高千粒重相关的Indel分子标记特征条带为624bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述引物对扩增的与小麦较低千粒重相关的Indel分子标记特征条带为609bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

2.权利要求1所述Indel分子标记在筛选较高千粒重的小麦种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如Seq ID No.3所示核苷酸序列的特征条带，则待测植株为具有较高千粒重的小麦资源。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以10μl计为：模板DNA 100ng，10μM引物F和R各0.2μl，2.5mM dNTP 0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶

0.12μl，含25mM Mg2+的10×PCR反应缓冲液1.0μl，ddH2O补足至10μl。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为：94℃

5分钟；94℃50秒，54℃50秒，72℃3分钟，36个循环；72℃10分钟。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色。

6.用于鉴定较高千粒重小麦种质资源的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含用于扩增权利要求1所述Indel分子标记的引物F和R，引物F和R的定义同权利要求1所述。

7.权利要求1所述Indel分子标记在小麦分子标记辅助育种中的应用。

说明书

与小麦千粒重相关的Indel分子标记及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与小麦千粒重相关的Indel分子标记及应用。

背景技术

[0002] 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，随着人口的增长，耕地面积的减少以及粮食生产成本的不断提高，高产、超高产育种成为我国小麦育种中迫切解决的问题。穗数、穗粒数和千粒重是小麦产量构成的三要素，粒重是主基因和微效基因共同调控的数量性状，因而弄清参与调控粒重各种过程的基因对高产小麦品种的育成具有重要意义。

[0003] 糖原合成酶激酶(GSKs)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，GSKs家族在植物中扮演着重要的角色，现有证据表明，植物GSKs可能参与植物的非生物胁迫应答、伤害应答以及油菜素内酯信号转导，调节花的发育等一系列生命活动进程。将小麦糖原合成酶激酶TaGSK1转入大肠杆菌菌株进行耐盐性分析，结果表明，转化子的耐盐能力比宿主菌高。此外，以敏盐的小麦成熟胚愈伤组织为材料，使用构建成功的TaGSK1双元载体pBI12-gskl分别采用农杆菌介导和基因枪轰击两种方法成功进行了TaGSK1基因的小麦遗传转化。从筛选结果可以看出，对照愈伤组织在0.5％NaCl中大多褐化甚至死亡，而转基因愈伤组织则生长旺盛(徐涛等,2003,小麦耐盐突变体TaGSK1基因的分离和鉴定,河北师范学院硕士毕业论文)。因此，该基因家族成员可能具有影响小麦千粒重，提高小麦产量的潜在价值。目前，尚未有关于该基因影响小麦千粒重的研究报道。

[0004] 随着现代分子生物学技术的迅速发展，分子标记辅助选择(MAS)被广泛应用于分子育种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早代选择和预测，大大缩短了小麦育种年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性。因此功能标记的开发为小麦分子辅助标记育种提供了依据。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供与小麦千粒重相关的Indel分子标记及应用。

[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦千粒重相关的Indel分子标记，所述Indel分子标记与小麦TaGSK1基因共分离，用于扩增所述Indel分子标记的引物对为：

[0007] 上游引物F：5’-CGCAAATCAAAGCTCACC-3’(Seq ID No.1)

[0008] 下游引物R：5’-CCATCCTACAAAGGCACA-3’(Seq ID No.2)

[0009] 所述引物对扩增的与小麦较高千粒重相关的Indel分子标记特征条带为624bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述引物对扩增的与小麦较低千粒重相关的Indel分子标记特征条带为609bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

[0010] 根据NCBI上公布的小麦TaGSK1基因的序列(Genbank：AF525086)，利用Primer Premier 5.0软件设计了一对在豫麦8679及和尚麦两个品种间具有多态性的Indel引物，并在千粒重差异显著的小麦品种间进行筛选，进一步在重组自交系群体(RILs)和自然群体中分析其对表型的作用，获得了一对有特异性差异的引物。

[0011] 本发明还提供所述Indel分子标记在筛选较高千粒重的小麦种质资源中的应用，包括如下步骤：

[0012] 1)提取待测植株的基因组DNA；

[0013] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；

[0014] 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如Seq ID No.3所示核苷酸序列的特征条带，则待测植株为具有较高千粒重的小麦资源。

[0015] PCR扩增体系以10μl计为：模板DNA 100ng，10μM引物F和R各0.2μl，2.5mM dNTP 0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.12μl，含25mM Mg2+的10×PCR反应缓冲液1.0μl，ddH2O补足至10μl。

[0016] PCR扩增程序为：94℃5分钟；94℃50秒，54℃50秒，72℃3分钟，36个循环；72℃10分钟。

[0017] 优选地，步骤3)中采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色。

[0018] 本发明还提供用于鉴定较高千粒重小麦种质资源的PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含用于扩增所述与小麦千粒重相关的Indel分子标记的引物F和R。

[0019] 本发明进一步提供与小麦千粒重相关的Indel分子标记在小麦分子标记辅助育种中的应用。

[0020] 本发明在前人研究的基础上，以NCBI上公布的小麦TaGSK1基因序列为模板设计引物，根据不同千粒重小麦品种豫麦8679及和尚麦之间的序列差异开发了与小麦千粒重相关的Indel分子标记，该标记不同的等位变异能够解释千粒重表型变异的7.9％-11.8％，其中，扩增产物大小为624bp的条带对千粒重的增加具有增效作用，扩增产物大小为609bp的条带对千粒重的降低具有增效作用。该分子标记的开发为高产小麦分子辅助育种提供了一条可行的途径。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例2中Indel分子标记在不同小麦品种中的等位类型分析；其中，泳道1-23分别为和尚麦、白火麦、小玉花、藁优9415、横优18、宝麦8、郑麦366、西农979、豫麦8679、众麦1号、新19、晋麦41、京冬10、御国、河农638、白芒红、郑麦98、M013、M016、白皮224、石新618、万县白麦子、邯5030。

具体实施方式

[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0023] 以下实施例中测序由生工生物工程上海(股份)有限公司完成。

[0024] 实施例1 小麦TaGSK1基因功能标记的开发

[0025] 根据NCBI上公布的小麦TaGSK1基因的序列(Genbank：AF525086)，利用Primer Premier 5.0软件设计了一对在豫麦8679及和尚麦两个品种间具有多态性的Indel引物，并在千粒重差异显著的小麦品种间进行筛选，进一步在重组自交系群体(RILs)和自然群体中分析其对表型的作用，获得了一对有特异性差异的引物，引物序列如下：

[0026] 上游引物F：5’-CGCAAATCAAAGCTCACC-3’(Seq ID No.1)

[0027] 下游引物R：5’-CCATCCTACAAAGGCACA-3’(Seq ID No.2)

[0028] 实施例2 小麦TaGSK1基因不同的基因型与粒重的相关性

[0029] 1、小麦籽粒千粒重的测定

[0030] 随机选取1000粒完整小麦籽粒，两次重复，用千分之一的天平称重，两次平均值记为最终的千粒重值。

[0031] 2、SDS-Tris饱和酚法抽提小麦叶片基因组DNA

[0032] (1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后置于2ml灭菌离心管中。

[0033] (2)加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl，pH8.0，250mMNaCl，25mM EDTA，pH8.0，0.5％SDS，2％β-ME混合均匀，β-ME临用前新鲜加入)。

[0034] (3)55℃水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。

[0035] (4)室温下12000rpm离心10min。

[0036] (5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25:24:1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

[0037] (6)室温下12000rpm离心10min。

[0038] (7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分除去蛋白。

[0039] (8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇(300μl)和0.1倍体积的pH为5.2的5M NaAC溶液50μl，充分混合混匀后冰上静置17min。

[0040] (9)出现白色絮状DNA沉淀，4℃，10000rpm离心10min。

[0041] (10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解，10倍稀释备用。

[0042] (11)用1％琼脂糖检测提取的小麦基因组DNA的质量及浓度。

[0043] 3、目标产物的扩增

[0044] PCR扩增体系以10μl计为：模板DNA 100ng，10μM引物F和R各0.2μl，2.5mM dNTP 0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.12μl，含25mM Mg2+的10×PCR反应缓冲液1.0μl，ddH2O补足至10μl。

[0045] PCR扩增程序为：94℃5分钟；94℃50秒，54℃50秒，72℃3分钟，36个循环；72℃10分钟。4℃保存。

[0046] PCR完成后，加变性双指示剂(DNA上样缓冲液)在PCR仪上95℃变性10min，然后立即置于冰上，待降至室温后，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后银染显色。具有较高千粒重的小麦品种扩增出624bp(Seq ID No.3)的目标条带，而具有较低千粒重的品种扩增出609bp(Seq ID No.4)的目标条带(图1)。

[0047] 4、不同千粒重品种中的基因型分析及与千粒重的相关性

[0048] 在豫麦8679/和尚麦重组自交系群体(豫麦8679千粒重57.6g；和尚麦千粒重19.6g，共146个家系)和125份小麦种质资源(表1)组成的自然群体中分别对两种基因型的千粒重进行方差分析和TaGSK1基因的等位变异与千粒重的相关性分析，结果见表2。

[0049] 表1 125份小麦种质资源的基因型及千粒重分析

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[0054] 注：A基因型为642bp带型，B基因型为609bp带型。

[0055] 表2结果表明，A基因型(624bp)的千粒重显著高于B基因型(609bp)的千粒重。不同基因型在两个群体中与千粒重的相关性均达到了极显著水平。

[0056] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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