在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法

摘要

本发明提供一种在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，包括：对软枣猕猴桃新生枝进行机械损伤形成伤口、对伤口进行CPPU处理后脱分化形成愈伤组织、对愈伤组织进行TDZ处理形成胚性愈伤或不定芽的步骤。本发明提供的诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，通过在非离体条件下采用适当方法使细胞脱分化形成愈伤组织，进而通过TDZ溶液将愈伤组织再分化形成胚性愈伤和不定芽，就可以在非离体的条件下建立软枣猕猴桃的再生体系。

权利要求

1.一种在非离体条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，其特征在于，包括：在非离体条件下，对软枣猕猴桃新生枝进行机械损伤形成伤口、对伤口进行CPPU处理后脱分化形成愈伤组织、对愈伤组织进行TDZ处理形成胚性愈伤或不定芽的步骤。

2.根据权利要求1所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，其特征在于，在非离体条件下，对伤口进行CPPU处理后脱分化形成愈伤组织、对愈伤组织进行TDZ处理形成胚性愈伤或不定芽的步骤中，须进行保温保湿的措施，其中，温度控制在25℃-

30℃，湿度控制在90％。

3.根据权利要求1所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，其特征在于，所述对伤口进行CPPU处理包括：对机械损伤形成的伤口利用脱脂棉覆盖，然后将

10mg/L的CPPU药液滴在脱脂棉上，以脱脂棉湿润为标准。

4.根据权利要求1所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，其特征在于，所述对愈伤组织进行TDZ处理包括：将新的脱脂棉覆盖在愈伤组织上，然后滴上浓度为4.5mg/L的TDZ溶液在脱脂棉上，以脱脂棉湿润为标准。

5.根据权利要求2所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，其特征在于，所述保湿措施包括：用宽2.5cm、长5cm的小塑料袋包住伤口或套在截面上，用嫁接塑料条将下部扎严，以保证塑料袋内一定的湿度。

说明书

在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物无性繁殖领域，尤其涉及一种在非离体条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法。

背景技术

[0002] 软枣猕猴桃为多年生落叶木质藤本果树，主产于我国东北地区，是珍贵的抗寒果树资源，其果实富含多种营养成分，Vc含量最高可达430mg/100g，品质风味独特，除鲜食外还适于加工果酒、果汁、果酱等，深受人们的喜爱，已成为当前栽培价值高、发展前景广的新兴果树。软枣猕猴桃果实与中华猕猴桃相比，最大的特点是风味独特、果皮光滑无毛，成熟后不用剥皮即可食用。软枣猕猴桃的育种方向之一是选育果形较大、口感较好的品种，目前栽培品种多是实生选育而来，但随着野生资源的逐年减少，已经很难收集到大果型资源，同时，由于软枣猕猴桃为雌雄异株，通过杂交手段很难选育出优良株系。前人研究显示，将软枣猕猴桃与中华猕猴桃远缘杂交后，F2代往往出现胚败育，因此通过远缘杂交也很难选育出果实较大、品质较好的优良株系。因此育种方法和育种效率是制约软枣猕猴桃产业发展的瓶颈之一。

[0003] 多倍体育种是果树育种的重要途径，多倍体果树常在果实大小、品质和抗性等方面具有一定优势。在软枣猕猴桃种质资源中，已发现的一些四倍体和六倍体资源表现出大果、抗逆、丰产等特性。因此，软枣猕猴桃多倍体诱导前景十分广阔。常规多倍体育种的技术主要将营养器官接种到培养基上后，通过脱分化形成愈伤组织，再通过调整激素种类和浓度，再分化形成胚性愈伤或不定芽，经过继代处理后，植株再生培养，最后通过生根培养基培养，形成完整试管苗，再经过炼苗、移栽，田间成苗后，才能进一步观察植株及果实性状。此外，也可采用秋水仙素在田间对茎尖材料进行多倍体诱导，进而形成多倍体植株。组织培养诱导的缺陷是需要在离体条件下进行，技术复杂，而茎尖诱导技术则容易产生嵌合体，分离纯化周期长。通过在非离体条件下诱导软枣猕猴桃再生体系的建立，为进一步开展软枣猕猴桃倍性育种提供了更加简洁有效的新途径。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种非离体条件下诱导软枣猕猴桃建立再生体系形成新稍的方法。

[0005] 一种在非离体条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，包括：在非离体条件下，对软枣猕猴桃新生枝进行机械损伤形成伤口、对伤口进行CPPU处理后脱分化形成愈伤组织、对愈伤组织进行TDZ处理形成胚性愈伤或不定芽的步骤。

[0006] 进一步地，如上所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，在非离体条件下，对伤口进行CPPU处理后脱分化形成愈伤组织、对愈伤组织进行TDZ处理形成胚性愈伤或不定芽的步骤中，须进行保温保湿的措施，其中，温度控制在25℃-30℃，湿度控制在90％左右。

[0007] 进一步地，如上所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，所述对伤口进行CPPU处理包括：对机械损伤形成的伤口利用脱脂棉覆盖，然后将10mg/L的CPPU药液滴在脱脂棉上，以脱脂棉湿润为标准。

[0008] 进一步地，如上所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，所述对愈伤组织进行TDZ处理包括：将新的脱脂棉覆盖在愈伤组织上，然后滴上浓度为4.5mg/L的TDZ溶液在脱脂棉上，以脱脂棉湿润为标准。

[0009] 进一步地，如上所述的在非离体的条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，所述保湿措施包括：用宽2.5cm、长5cm的小塑料袋包住伤口或套在截面上，用嫁接塑料条将下部扎严，以保证塑料袋内一定的湿度。

[0010] 本发明提供的诱导软枣猕猴桃形成再生新稍的方法，通过在非离体条件下采用适当方法使细胞脱分化形成愈伤组织，进而通过TDZ溶液将愈伤组织再分化形成胚性愈伤和不定芽，就可以在非离体的条件下建立软枣猕猴桃的再生体系。

具体实施方式

[0011] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0012] 所述TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性(CTK)，它的CTK活性要比一般CTK高几十倍至几百倍，它可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等。

[0013] 实施例：

[0014] 在田间，以二倍体或四倍体软枣猕猴桃优系为试材，6月份在新生枝条上进行刻伤或截断，迅速用脱脂棉覆盖伤口，然后将5-6滴10mg/L的CPPU(N1-(2-氯-4-吡啶)-N3-苯基脲)药液滴在脱脂棉上，以脱脂棉湿润为标准。然后，用宽2.5cm、长5cm的小塑料袋包住伤口或套在截面上，用嫁接专用塑料条将下部扎严，以保证口袋内一定的湿度。待截面或伤口处长出愈伤后，将塑料口袋连同脱脂棉去除，换上新的脱脂棉，滴上浓度为4.5mg/L的TDZ溶液5-6滴，促进愈伤组织分化。3-4周后，愈伤组织分化出胚性愈伤或不定芽，去除塑料口袋及脱脂棉，不定芽或胚性愈伤进一步发育成新稍。

[0015] 对比例：

[0016] 取软枣猕猴桃新鲜、幼嫩茎尖，洗净；用0.1％的升汞灭菌10min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超净台上将叶片切成0.5cm×1.0cm大小，1/2MS固体培养基上(附加生长素)脱分化培养，于光照条件下培养30～60d，产生愈伤组织。之后转移到成苗培养基上(附加6-BA及生长素)，在22℃～25℃光照下经过30d～50d培养，产生不定芽或胚性愈伤。

[0017] 本发明采用10mg/L的CPPU可以使脱分化形成愈伤组织的效果最佳；采用4.5mg/L的TDZ溶液可以使诱导枝条愈伤组织再分化形成胚性愈伤和不定芽的效果最佳。

[0018] 所述10mg/L CPPU溶液其溶质是氯吡脲，溶液是水。溶质为色谱纯氯吡脲组成，纯度99％。所述4.5mg/L的TDZ溶液其溶质是N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲，溶液是水。溶质为色谱纯N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲组成，纯度99％。

[0019] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。