人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG及其应用

摘要

人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素‑9的抗体IgG及其应用，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。该人源抗体能够与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素‑9特异性结合；体外细胞实验结果证实，人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素‑9抗体能够有效诱导唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素‑9阳性细胞的凋亡，抑制细胞因子的分泌，因此本发明的单克隆抗体可应用于重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肿瘤等相关疾病的临床治疗及预防。

权利要求

1.人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG在制备抑制中性粒细胞药物中的应用，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

说明书

人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG及其

应用

技术领域

[0001] 本发明属于单克隆抗体药物技术领域，涉及一种抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9(the surface molecule sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9，Siglec-9)的全分子人源单克隆抗体及其被编码的DNA分子，以及该全分子人源单克隆抗体在制备治疗重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病药物中的应用。

背景技术

[0002] 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(the surface molecule sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)是免疫球蛋白超家族的重要成员，可通过识别含有唾液酸的糖链结构介导细胞与细胞或病原体间的相互作用。最近几年研究显示，siglec家族在细胞活化、增殖以及细胞凋亡发挥重要作用，同时，在固有免疫和适应性免疫中也发挥重要的调控作用，此外也可以参与免疫耐受的调控。

[0003] Siglecs是免疫球蛋白超家族成员，其分子结构共同特点是具有结合涎酸的能力。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素，表达于免疫细胞表面，介导抑制性信号。与其他抑制性免疫受体家族相似，如杀伤细胞免疫球蛋白样受体和白细胞免疫蛋白样受体，siglecs是跨膜分子，在胞质尾区包含免疫受体酪氨酸抑制基序ITIMs(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs，ITIMs)，在胞外存在免疫球蛋白超家族区域。与其他免疫球蛋白超家族相比，siglecs的特性是其高特异性的配体唾液酸化的碳水化合物，不同于大部分其他免疫受体结合蛋白。人类已经发现14种siglec：唾液酸粘附素(siglec1CD169)，CD22(siglec2)，CD33(siglec3)和髓磷脂相关的糖蛋白(MAG siglec4)以及新近的cd33相关的siglec(siglec5-11)。除了siglec4表达于神经细胞，大部分siglecs家族表达于造血细胞。

[0004] 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素9(siglec9)是I型跨膜蛋白，免疫球蛋白超级族的重要成员，主要是由胞外一个N末端的V区和两个C区免疫球蛋白样结构域，跨膜区和胞质内区构成，N-末端免疫球蛋白样结构域V区介导唾液酸(SIA)的识别，胞质内区含有两个免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)。近膜基序ITIM酪氨酸磷酸化，募集抑制性磷酸酶类，如Src同源区2包括酪氨酸磷酸酯酶1(SHP-1)、SHP-2和SH2肌醇磷酸酶(SHIP)，从而介导下游酪氨酸激酶磷酸化，并向胞内传递抑制性或是致死性信号。

[0005] Siglec-9在中性粒细胞和单核细胞高表达，在NK细胞、CD4+和CD8+T细胞的某些亚群低表达。在骨髓造血干细胞分化的中晚期，中幼粒细胞膜表面即可出现Siglec-9的表达，Siglec-9参与中性粒细胞的分化、发育和死亡等多个生理过程，是调节中性粒细胞固有免疫的重要功能受体。肺组织大量嗜酸性粒细胞浸润伴中性粒细胞增多是重症哮喘重要的病理生理特点，抗Siglec-9抗体的替代治疗兼顾两者PCD，可能在重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有潜在的治疗价值。

发明内容

[0006] 解决的技术问题：本发明提供一种人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG及其应用。

[0007] 技术方案：人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG，所述抗体的VL链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

[0008] SEQ ID NO.10所示的VL-CDR1；

[0009] SEQ ID NO.11所示的VL-CDR2；

[0010] SEQ ID NO.12所示的VL-CDR3；

[0011] 并且所述抗体的VH链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

[0012] SEQ ID NO.3所示的VH-CDR1；

[0013] SEQ ID NO.4所示的VH-CDR2；

[0014] SEQ ID NO.5所示的VH-CDR3。

[0015] 人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。以及上述序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

[0016] 人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。以及上述序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

[0017] 编码人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG的核苷酸序列，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.8所示。

[0018] 编码人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG的核苷酸序列，编码重链恒定区的核酸序列为SEQ ID NO.6所示，编码轻链恒定区的核酸序列为SEQ ID NO.13所示。

[0019] 上述人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG在制备预防或治疗重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病和/或肿瘤药物中的应用。

[0020] 一种预防或治疗重症哮喘的药物，有效成分为所述的人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG。

[0021] 一种预防或治疗慢性阻塞性肺病的药物，有效成分为所述的人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG。

[0022] 一种预防或治疗自身免疫性疾病的药物，有效成分为所述的人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG。

[0023] 一种预防或治疗肿瘤的药物，有效成分为所述的人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG。

[0024] 有益效果：本发明提供了一种具有高保护性、高特异性、良好亲和力的抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的人源单克隆抗体。对该全分子人源抗体做功能鉴定，结果显示该人源抗体能够与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9特异性结合；体外细胞实验结果证实，人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体能够有效诱导唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9阳性细胞的凋亡，抑制细胞因子的分泌，因此本发明的单克隆抗体可应用于重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肿瘤等相关疾病的临床治疗及预防。

附图说明

[0025] 图1纯化后抗体IgG的SDS-PAGE检测；

[0026] 图2抗Siglec-9抗体的ELISA检测；

[0027] 图3抗Siglec-9抗体的Western blot检测；

[0028] 图4抗Siglec-9抗体与抗原结合的亲和力检测；

[0029] 图5抗Siglec-9抗体诱导的中性粒细胞凋亡检测；

[0030] 图6 FACS检测抗Siglec-9抗体诱导的中性粒细胞ROS。

具体实施方式

[0031] 需要说明的是，该抗体的重链可变区和轻链可变区均为人源抗体，并将其与人源抗体的恒定区连接，因此称之为全分子人源抗体。

[0032] 本发明以唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9为靶分子，在噬菌体抗体库技术的基础上制备人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0033] 实施例1

[0034] 人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体Fab的筛选

[0035] 1)用纯化的重组人唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔2μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体。

[0036] 2)加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，加入辅助噬菌体VCSM13超感染。

[0037] 3)重复以上筛选步骤，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。

[0038] 4)将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于加入100μg/mL的氨苄青霉素培养板上培养过夜，挑取80个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜。

[0039] 5)过夜后从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养。

[0040] 6)加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。

[0041] 7)离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm～A650nm计算每孔吸光值。当P/N值(Positive/Negative)大于6时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株。

[0042] 8)将阳性克隆进行核酸序列分析，编码重链可变区的核酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1所示，编码轻链可变区的核酸序列为序列表中的SEQ ID NO.8所示，从而得到一种基因序列正确的Fab。

[0043] 人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9的抗体IgG的制备

[0044] 1)根据已获得抗体的可变区序列，设计Infusion PCR的引物

[0045] 根据Infusion PCR原理设计抗体的重、轻链PCR扩增引物，此引物需要包括表达载体上的15bp的碱基以及插入目的片段的至少15bp碱基，插入目的片段处碱基按照普通引物设计的原则设计。

[0046] 重、轻链PCR扩增引物：

[0047] 重链扩增引物：

[0048] HF:5’-GGTGTCCACTCGCTACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3’

[0049] HR:5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGAC-3’

[0050] 轻链扩增引物：

[0051] L5F:5’-ACAGACGCTCGCTGCTCCTATGAGCTGACTCAGCCACCT-3’

[0052] L5R：5’-GTTGGCCTTGGGCTGTAGGACGGTCAGCCT-3’

[0053] 2)扩增人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG重链、轻链[0054] 以上述制备的人源Fab为模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。

[0055] ①PCR

[0056] 反应体系：

[0057]

[0058] 反应条件：

[0059]

[0060] ②2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。

[0061] ③胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。

[0062] 3)双酶切IgG表达质粒

[0063] IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Kappa)恒定区碱基编码序列，编码重链恒定区的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码轻链恒定区的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

[0064] ①pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切

[0065] 反应体系：

[0066]

[0067] 反应条件：37℃酶切过夜。

[0068] ②1％琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。

[0069] ③胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。

[0070] 4)Infusion PCR重组表达质粒

[0071] 反应体系：

[0072]

[0073] 反应条件：50℃孵育15min。

[0074] 取5μL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。

[0075] 5)人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG的表达

[0076] ①取250μL pFUSE-CHIg-hG1-H(即50μg)于1mL的Opti-MEM培养基中，取250μL pFUSE-CLIg-hk-L(即50μg)于1mL的Opti-MEM培养基中，取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种混合液室温静置5min。

[0077] ②然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500μL的Opti-MEM培养基混合均匀后直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F细胞离心后用293F Expression Medium重悬，然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比，吸取100×106个细胞于培养瓶中，用293F Expression Medium定容为94mL。

[0078] ③20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中。

[0079] ④将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8％CO2，120rmp，37℃，6天后收集细胞上清。

[0080] 6)人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG的纯化

[0081] 将收集的细胞上清用0.22μm的滤膜过滤，同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA纯化仪按照Protein A纯化的标准步骤纯化，以1mL/min的速度上样，以1.5mL/min的速度洗脱。结果成功表达并纯化IgG抗体。SDS-PAGE检测结果见图1。

[0082] 人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG的功能活性鉴定

[0083] 1)酶联免疫法

[0084] 用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释重组人唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9至2μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入100μL，4℃过夜；PBST(PBS含0.5％Tween20)5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入100μL PA21抗体(2μg/mL起始浓度，14个浓度梯度稀释)37℃2h；以1：2000稀释的羊抗人二抗100μL/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100μL/孔，室温下10分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/690nm。结果如图2示，人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG能与Siglec9蛋白结合。

[0085] 2)Western blot

[0086] 将中性粒细胞裂解上清进行10％SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与2μg/mL抗体室温孵育1h，1:2000稀释HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司)和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)曝光于凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

[0087] 结果如图3所示：人源抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG与Siglec-9蛋白有特异性结合。

[0088] 3)亲和力检测

[0089] 根据抗原等电点以及按照Biacore-X100 control soft的protocol优化偶联条件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释抗原样品至25μg/mL后偶联到CM5芯片上。预设偶联水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀释抗原样品，稀释一系列浓度至0uM、5nM、10nM 20nM、40nM、80nM。设置进样时间为180s，解离时间10min，再生缓冲液用50mM pH2.2 Gly-HCl。按照BiacoreX100 control soft的protocol进行上机测试。亲和力检测结果见图6，KD值为7.380×10-10M。

[0090] 4)抗体诱导中性粒细胞凋亡的检测

[0091] 用Ficoll分离液分离中性粒细胞，GM-CSF 25ng/mL预处理30分钟，分别加入Siglec-9mAb 10μg/mL(B10101)和阴性对照。作用8小时后，用Annexin-V与PI染色，流式细胞仪检测。结果显示，抗体能够诱导中性粒细胞凋亡，凋亡率达21.15％。

[0092] 5)细胞中ROS检测结果：

[0093] 采取静脉血5mL，Ficoll分离液分离中性粒细胞，分为三组：阴性对照组、GM-CSF组和GM-CSF+siglec-9mAb20μg/mL组，分别作用2小时。培养液中加入100ng/mL的LPS，作用1小时。按照使用说明书，加入Sigma公司ROS探针，37度孵育30分钟，冰PBS洗涤细胞三次后，流式细胞仪检测。结果显示，抗体处理后能够显著增加中性粒细胞中的ROS量。

[0094] 以上动物实验结果提示，抗人源唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9抗体IgG具有良好的免疫学活性，能够诱导中性粒细胞的凋亡增加，表明该抗体可以用于重症哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的治疗。