与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记及其获得方法

摘要

本发明公开了一种与结球甘蓝耐抽薹基因连锁的分子标记及其获得方法。该方法先将易抽薹材料和耐抽薹材料杂交得到F1群体并自交构建F2群体；利用SSR分子标记技术和改良BSA法对结球甘蓝F2群体进行耐抽薹分子标记的筛选，获得与结球甘蓝耐抽薹基因紧密连锁的分子标记BolSSR00207。该SSR分子标记与控制耐抽薹性状基因的遗传距离为10.69cM，为(CT)n二核苷酸重复类型，在易抽薹植株中是(CT)8，在耐抽薹植株中是(CT)10。对随机选取的34个抽薹性各异的结球甘蓝品种进行验证，符合率达到82.35％。研究结果提供了一种结球甘蓝耐抽薹分子标记辅助选择的方法，并为分离新的结球甘蓝耐抽薹基因奠定了研究基础，同时，本发明对芸薹属作物的抗寒种质创新和耐抽薹理论研究均有重要意义。

权利要求

1.一种与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

说明书

与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记及其获得方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)耐抽薹基因连锁的分子标记BolSSR00207及其获得方法。

背景技术

[0002] 甘蓝为芸薹属“U三角”作物含CC二倍体基因组的基本种，包括结球甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝、皱叶甘蓝和芥蓝等8个栽培变种。各变种间天然杂交率很高。甘蓝类蔬菜目前在世界各地广泛栽培，以结球甘蓝栽培面积最大，结球甘蓝、花椰菜、青花菜和球茎甘蓝在中国普遍栽培，芥蓝主要在我国华南地区等地栽培。据报道，2 2
2013年我国结球甘蓝年种植面积大约为90万hm ；青花菜种植面积约8万hm ；花椰菜种植面积45万hm2。

[0003] 结球甘蓝是我国重要的蔬菜作物之一，在各地普遍栽培，现已实现周年生产与周年供应。据统计，其栽培面积约占我国蔬菜播种面积的10％以上，在我国城乡蔬菜供应中具有举足轻重的地位。在春甘蓝栽培中，往往因气候及栽培管理不当等原因造成春甘蓝发生先期抽薹现象，从而严重影响结球甘蓝的品质和产量，给生产带来巨大损失。因此，为有效减少这些损失，需要在理论上加强结球甘蓝耐抽薹性分子遗传机制的研究，同时，在生产上培育具有耐抽薹性的甘蓝品种。

[0004] 为解决上述影响我国十字花科作物可持续发展的重大问题，挖掘新的耐抽薹种质资源，以往育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些优良的耐抽薹自交系，但在耐抽薹性转育过程中应用传统的方法筛选耐抽薹植株时存在选育时间较长、操作程序繁琐等缺点；另一方面耐抽薹性的表现易受环境条件的影响，难以适应育种实践的需要。近年来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助技术开展十字花科蔬菜耐抽薹性育种显出巨大的潜力。一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于十字花科蔬菜抗逆及抗病研究。应用分子标记技术，不但可以免除传统育种中繁重的选择过程，以及跟踪、检测外源基因，还能把多个抗病及抗逆基因聚合到同一优良品种中，使其获得持久、广泛的抗性。

[0005] 提高耐抽薹性是当前结球甘蓝乃至整个十字花科蔬菜重要的育种目标之一。同时，通过杂交与回交技术，可以将结球甘蓝中的耐抽薹基因转移到同为甘蓝种的青花菜、花椰菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝和芥蓝等变种中，从而为耐抽薹的甘蓝类蔬菜新品种选育提供基因资源。因此，获得与耐抽薹基因紧密连锁的分子标记不仅可应用到分子辅助育种中，提高甘蓝种作物耐抽薹育种效率，在品种选育上有重要的应用价值，还可以为进一步图位克隆耐抽薹基因并分析其生物学功能奠定研究基础。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于针对现有在育种实践中可用的耐抽薹分子标记不足，提供一种与结球甘蓝耐抽薹基因连锁的分子标记BolSSR00207及其获得方法。

[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记，其上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

[0008] 一种与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记的获得方法，包括以下步骤：

[0009] (1)利用经过多代自交选育出的耐抽薹材料‘Y9805’和易抽薹材料‘Y5-3-14’，将耐抽薹亲本和易抽薹亲本进行杂交得到F1群体，F1自交后获得F2群体；

[0010] (2)针对F2群体，采用改良的BSA法分别构建耐抽薹基因池和易抽薹基因池；

[0011] (3)利用SSR分子标记技术，对易抽薹基因池和耐抽薹基因池进行与结球甘蓝耐抽薹性分子标记的筛选；筛选出与目标性状(耐抽薹性)存在连锁关系分子标记BolSSR00207，经单株验证分析，该分子标记BolSSR00207与结球甘蓝耐抽薹基因的遗传距离为10.69cM。

[0012] 进一步地，所述步骤2具体为：

[0013] (2.1)通过冬性鉴定确定F2群体中每一个单株的耐抽薹性，以抽薹情况将F2代群体单株分为1级～9级。其中，1级为：短缩茎伸长(＜1cm)；9级为：花薹大于20cm；

[0014] (2.2)取F2代群体中的1级单株15株，采用CTAB法提取基因组DNA，混样后构建F2代易抽薹基因池；取9级单株15株，采用CTAB法提取基因组DNA，混样后构建F2代耐抽薹基因池。

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0016] 先期抽薹严重影响结球甘蓝乃至十字花科蔬菜的品质与产量，给生产带来巨大的损失。本发明利用SSR分子标记方法，结合改良的BSA法得到一个与结球甘蓝耐抽薹基因连锁的SSR分子标记，可直接用于甘蓝类蔬菜的耐抽薹性分子标记的辅助选择育种。利用该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，还可以有目的地聚合多个抗性基因，培育出具有稳定的多抗性的甘蓝类蔬菜新品种。同时也可利用这个新的与耐抽薹基因连锁的分子标记克隆结球甘蓝耐抽薹基因，并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解结球甘蓝耐抽薹的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在甘蓝类蔬菜育种实践及耐抽薹理论研究上均具有重要意义。

附图说明

[0017] 图1为双亲及F1代田间植株。其中，A：母本，B：F1代，C：父本。

[0018] 图2为BolSSR00207引物对耐/易抽薹基因池的扩增结果。1～3：耐抽薹基因池；4～6：易抽薹基因池。M为100bp DNA marker。

[0019] 图3为BolSSR00207引物对两个亲本的验证结果。P1为父本，P2为母本，M为100bp DNA marker。

[0020] 图4为BolSSR00207引物的F2代单株验证结果。M为100bp DNA marker。

具体实施方式

[0021] 本发明与结球甘蓝耐抽薹分子标记BolSSR00207的获得方法主要包括以下步骤:

[0022] 1.利用经多代自交选育出的耐抽薹材料‘Y9805’和易抽薹材料‘Y5-3-14’，将所述耐/易抽薹亲本杂交得到F1群体，F1自交获得F2群体。

[0023] 2.应用SSR分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝耐抽薹性分子标记的筛选。

[0024] (1)叶片总DNA的提取：

[0025] 具体做法为：通过冬性鉴定确定每一个单株的耐抽薹性，以抽薹情况将F2代群体单株分为1级～9级分别取样。其具体标准为：1级：短缩茎伸长(＜1cm)；3级：短缩茎伸长明显(1～2cm)，无花薹；5级：短缩茎伸长，有花薹(＜5cm)；7级：节间伸长，花薹大于5cm；9级：节间伸长，花薹高度大于20cm。采用CTAB法提取基因组DNA。同时还提取了亲本P1和P2的基因组DNA。

[0026] (2)耐/易抽薹结球甘蓝基因池的构建

[0027] 具体做法为：本发明采用改良的BSA法分别构建耐抽薹基因池和易抽薹基因池。从F2代群体中1级单株和9级单株各取15株基因组DNA分别进行混样，构建F2代易抽薹基因池及F2代耐抽薹基因池。

[0028] (3)与结球甘蓝耐抽薹基因连锁的SSR标记的筛选

[0029] 利用336对SSR引物(序列见表1)对2个基因池(F2代耐抽薹池和F2代易抽薹池)进行PCR扩增，每一PCR重复一次。PCR检测的反应体系(20μL)：75ng基因组DNA模板，0.5U Taq DNA聚合酶(FermentasTM)、0.4μL(10μmol·L-1)dNTPs、1μL(10μmol·L-1)上下游引物、2μL 10×PCR Buffer(200mmol·L-1Tris pH 8.0，200mmol·L-1KCl，100mmol·L-1(NH4)2SO4和-1
20mmol·L MgSO4)，加ddH2O至20μL。PCR检测的扩增程序：94℃预变性3min，进入35个循环(94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s)，最后再72℃延伸7min。PCR反应过程在BIO-RAD S1000TM Thermal Cycler仪器上进行，样品在4℃条件下保存。

[0030] 表1用于筛选SSR标记的引物序列

[0031]

[0032]

[0033]

[0034]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038]

[0039]

[0040] PCR产物用12％质量百分数的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。PAGE电泳及染色所用试剂和仪器如下：

[0041] (3.1)0.3g/mL的丙烯酰胺混合液(100mL)(即30％质量百分比的胶原液)，配制方法为：29g丙烯酰胺(Acrylamide)，1g N,N’-甲双丙烯酰胺(Bisacrylamide)，加ddH2O至100mL，37℃搅拌溶解，4℃避光保存。

[0042] (3.2)0.1g/mL的过硫酸胺(10mL)，配制方法为：1g过硫酸胺(Ammonium persulfate,APS)溶于10mL ddH2O中，4℃保存。

[0043] (3.3)5×TBE缓冲液(pH 8.3，500mL)，配制方法为：27g Tris碱，13.75g硼酸，1.86g Na2EDTA·H2O，加ddH2O定容到500mL，4℃保存。

[0044] (3.4)TEMED(N’，N’，N’，N’-四甲基乙二胺)。

[0045] (3.5)上样缓冲液：其中含有0.25％溴酚蓝(W/V)，40％蔗糖水溶液(W/V)，4℃贮存。

[0046] (3.6)封底胶：1％琼脂糖溶液，用1×TBE配置。

[0047] (3.7)染色液：无水乙醇50ml，硝酸银0.5g，溶于dd H2O并定容至500ml。贮存于棕色瓶中，室温保存。

[0048] (3.8)显色液：氢氧化钠10g，溶于dd H2O并定容至500ml，室温保存。实验室再加入2ml质量百分数为37％的甲醛。

[0049] (3.9)仪器：DYY-6C型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，DYCZ-30C型双夹板垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，Tanon 2500全自动数码凝胶图像分析系统等。

[0050] PAGE电泳的主要步骤：

[0051] 1)将准备灌胶的玻璃板，梳子，胶套，电泳槽等，用去污剂洗涤自来水冲洗，晾干，酒精擦拭。

[0052] 2)将两块玻璃板插入橡胶套后，放入电泳槽中，使较低的玻璃板朝向负极(黑色电极)。保持电泳槽水平，拧紧电泳槽上的螺杆使玻璃板和橡胶套稳固且密封。

[0053] 3)在微波炉中将封底胶煮沸，将玻璃板和橡胶套三面的外侧接缝封好，并将其中一块玻璃板底部的空隙封上。

[0054] 4)制胶(12％质量百分比的聚丙烯酰胺凝胶)50mL：19.65mL ddH2O+20mL 30％胶原液+10mL 5×TBE+35μL TEMED+350μL APS。

[0055] 5)灌胶：用100ml注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液，几乎注满空隙。

[0056] 6)立即将合适的梳子轻轻插到凝胶中，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。

[0057] 7)丙烯酰胺于室温聚合30～60min，冬天则放入30℃烘箱中。若凝胶回缩明显，应补加溶液。凝胶完全聚合时可见梳齿下两条折光线。

[0058] 8)拔梳子：用1×TBE浸润凝胶的顶端2～4分钟，小心拔出梳子，立即用1×TBE冲洗一下加样孔，以防止梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液在加样孔聚合，产生不平整的表面。

[0059] 9)将胶膜夹在电泳槽上，每20μL体系中加2μL上样缓冲液，混匀，点样1μL。

[0060] 10)电泳：120V，60mA，距到2/3处停下(约3h)。

[0061] PAGE胶的银染步骤采用快速染色法，具体步骤如下：

[0062] 1)染色：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，卸下玻璃板，将凝胶转移至染色液中，室温下于摇床上以40～80rpm振荡8～10min。

[0063] 2)清洗：倒尽染色液，用ddH2O清洗凝胶2次，20～30s,第二次清洗20～30s后，加入微量显色液，稍振荡后倒掉变黑的显色液。

[0064] 3)显色：倒尽上述清洗液，再加入适量显色液，以40rpm振荡至清晰带纹出现(约5min)，倒尽显色液，并用ddH2O冲洗2～3次。

[0065] 4)洗胶：用ddH2O清洗，将PAGE胶小心的转移到白色底板上，用凝胶成像系统拍照。

[0066] 分析PCR扩增产物电泳结果，发现BolSSR00207在耐/易抽薹池和两个亲本之间都存在差异(图2和图3)，认为其有可能与目标性状(耐抽薹性)存在连锁关系。

[0067] 3.筛选出一个SSR分子标记BolSSR00207，其上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2；经单株验证分析，该分子标记BolSSR00207与结球甘蓝耐抽薹基因的遗传距离为10.69cM。

[0068] 具体做法为：对筛选得到的BolSSR00207分子标记进行F2分离群体的单株验证，统计耐/易抽薹单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Kosambi函数计算标记与控制耐抽薹性状基因之间的遗传距离。结果显示(图4)，23个耐抽薹单株中有20株存在特异带，3株没有特异带；15株易抽薹单株中有1株没有特异带。结果表明，BolSSR00207分子标记与结球甘蓝耐抽薹性有较紧密的连锁性，但在耐抽薹和易抽薹单株中有一定的交换，交换率为10.53％，经Kosambi函数换算SSR标记BolSSR00207与抗病基因的遗传距离为10.69cM。

[0069] 4.为了验证分子标记BolSSR00207的在育种实践中的适用性，我们随机选取了34个抽薹性各异的结球甘蓝品种进行验证，结果显示，28个品种验证结果均与实际情况一致，符合率达到82.35％(表2)。上述结果表明，BolSSR00207在结球甘蓝耐抽薹分子标记辅助选择中具有较好的适用性。

[0070] 表2BolSSR00207对34个品种进行耐易抽薹性的验证结果表

[0071]品种编号 实际基因型 验证结果 品种编号 实际基因型 验证结果
27 易 耐 70 易 易
28 易 易 71 易 易
32 耐 耐 79 易 易
33 耐 耐 80 易 易
35 易 易 81 易 易
40 耐 耐 88 易 易
44 耐 耐 93 耐 易
50 易 耐 95 易 易
51 耐 耐 96 易 耐
53 耐 易 103 易 易
54 耐 耐 110 易 耐
55 耐 耐 128 易 易
56 耐 耐 129 易 易
57 耐 耐 131 易 易

[0072]59 耐 耐 133 易 易
62 易 易 134 易 易
65 易 易 135 耐 耐

[0073] 5.对筛选获得的分子标记BolSSR00207进行回收和测序，结果显示，BolSSR00207的序列长度为166bp(如SEQ ID NO.3所示)。序列分析结果显示，该标记为(CT)n二核苷酸重复类型，在易抽薹植株中是(CT)8，在耐抽薹植株中是(CT)10。

[0074] 具体做法为：

[0075] (5.1)胶条切取：用无菌手术刀切取含有目标DNA片段的非变性PAGE胶，胶条宽约2mm，再用干净的镊子将胶条转入1.5mL离心管。用液氮将胶条磨碎。

[0076] (5.2)样品浸泡：加入200μL分散缓冲液(0.5M CH3COONH4，0.01M Mg(CH3COO)2，1mM EDTA，0.1％SDS，pH8.0)，用无菌枪头将碎胶和缓冲液混匀；60℃温浴60min，期间每15min振荡1次，确保缓冲液和碎胶充分接触，提高目的片段的释放量。

[0077] (5.3)氯仿抽提：加入200μL氯仿萃取液(氯仿:异戊醇:无水乙醇为19:1:5)混匀，以13000rpm离心3min，吸上清液150μL，转到新的1.5mL无菌离心管中。

[0078] (5.4)酒精沉淀：加入300μL预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min；以13000rpm离心4min；弃上清液，倒置干燥15～20min。

[0079] (5.5)DNA溶解：加入10μL ddH2O溶解，-20℃保存。

[0080] (5.6)PCR扩增：PCR的反应体系(20μL)：75ng回收的DNA模板，0.5U Taq DNA聚合酶(FermentasTM)、0.4μL(10μmol·L-1)dNTPs、1μL(10μmol·L-1)上下游引物、2μL 10×PCR Buffer(200mmol·L-1Tris pH 8.0，200mmol·L-1KCl，100mmol·L-1(NH4)2SO4和20mmol·L-1MgSO4)，加ddH2O至20μL。PCR检测的扩增程序：94℃预变性3min，进入35个循环(94℃变性TM
30s，53℃退火30s，72℃延伸30s)，最后再72℃延伸7min。PCR反应过程在BIO-RAD S1000  Thermal Cycler仪器上进行，样品在4℃条件下保存。

[0081] (5.7)PCR产物回收：PCR产物的回收操作步骤参照AxyenTM凝胶回收试剂盒说明书进行。

[0082] (5.8)回收产物的载体连接：连接体系(10μL)：5μL 2×Rapid Ligation Buffer，4μL回收产物，0.5μL T-easy载体(50ng·μL-1)，1.5U T4 DNA连接酶(PromegaTM)，加ddH2O至10μL。4℃连接10～12h。

[0083] (5.9)连接载体的转化：拿出在-75℃保存的大肠杆菌感受态细胞100μL，稍解冻，加入10μL的连接产物。涡旋混匀后，放入冰中，冰浴30min,然后放入42℃水浴锅中热击100s，再冰浴5min。在超净工作台上每管加入1mL的液体LB培养基。在恒温摇床上37℃，
200rpm振摇约90min。将LB固体培养基放入微波炉中，加热融化。待融化的LB培养基略微冷却后，每30mL加入7.5μL的氨苄青霉素钠(Amp，200mg·mL-1)，混匀后，倒成两个平板，冷却凝固。将摇床中的菌液取出后，12000rpm，离心1min，弃上清。用移液枪将残留上清和沉淀混匀，滴到已凝固成平板的LB培养基上，用涂抹棒涂抹均匀。平板正面朝上30min，待菌液干后，倒置平板于37℃的培养基中10～12h。

[0084] (5.10)挑菌斑测序：在30mL液体LB培养基中加入7.5μL Amp(200mg·mL-1)，混匀后吸取1mL培养基分装至1.5mL离心管中，用移液枪枪头挑取平板上的白色菌斑，在离心管中的LB培养基中吸打几下，确保挑取的菌落已经接种到该离心管的培养基中。将上述带有目标菌落的LB培养基置于37℃恒温摇床，200rpm水平振摇约12h。以上述摇好的菌液为模板，以SP6/T7引物对菌液进行检测。菌液PCR的反应体系以及扩增程序同(6)。根据菌液PCR琼脂糖凝胶电泳的检测结果，选阳性菌液，吸取500μL，并送往上海英骏生物技术有限公司进行测序。

[0085] 上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。