本发明涉及一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于银杂化的二氧化锰纳米片对双氧水有良好的电化学催化能力和电子转移能力，显著提高了生物传感器的灵敏度，对粮食中黄曲霉毒素B1的检测具有重要的意义。
1.一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）银杂化的二氧化锰纳米片的制备
将20 mL含有浓度为0.3 ~ 1.2 mol/L的羟化四甲铵和质量分数为1.5% ~ 6%的双氧水的水溶液迅速加入到10 mL含有浓度为0.15 ~ 0.6 mol/L的四水合氯化锰溶液中，室温条件下搅拌12 h，离心洗涤后干燥，得到二氧化锰纳米片；
取0.1 ~ 0.4 g二氧化锰纳米片加入到10 ~ 40 mL无水乙醇中，随后加入0.1 ~ 0.4 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的二氧化锰纳米片；
向10 ~ 40 mL的银纳米水溶液中加入10 ~ 40 mg的氨基化的二氧化锰纳米片，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到银杂化的二氧化锰纳米片；
1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL的银杂化的二氧化锰纳米片水溶液，干燥；
3）继续将6 µL浓度为5 ~ 20 µg/mL的黄曲霉毒素B1抗体溶液滴加到修饰电极表面，于
4）用3 μL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
5）将6 μL浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器对黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对黄曲霉毒素B1抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替黄曲霉毒素B1抗原标准溶液进行检测。
一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感
器的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明一种银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电化学催化性能的银杂化的二氧化锰纳米片，制备一种检测粮食中黄曲霉毒素B1的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
[0002] 在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。黄曲霉毒素B1的毒性要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍。黄曲霉毒素B1的急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。
[0003] 目前生物传感器已经广泛用于各种真菌毒素的检测，因为生物传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记型传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。
[0004] 本发明将银杂化的二氧化锰纳米片修饰到玻碳电极表面，构建无标记型传感器。第一，银杂化的二氧化锰纳米片中的银具有良好的生物相容性，并且能够有效地固定抗体；
第二，银杂化的二氧化锰纳米片具有良好的电化学催化活性，能够提高传感器的灵敏度；第三，银杂化的二氧化锰纳米片的片状结构具有大的比表面积，能够进一步增加抗体的固定和增加催化过程的接触面积。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于黄曲霉毒素B1的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测黄曲霉毒素B1提供了新途径。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是基于银杂化的二氧化锰纳米片构建无标记型生物传感器。
[0006] 本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于黄曲霉毒素B1的高灵敏、特异性检测。
[0007] 本发明的技术方案如下
[0008] 1. 一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法[0009] （1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
[0010] （2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 2 mg/mL的银杂化的二氧化锰纳米片水溶液，干燥；
[0011] （3）继续将6 µL浓度为5 ~ 20 µg/mL的黄曲霉毒素B1抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0012] （4）用3 μL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0013] （5）将6 μL浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
[0014] 银杂化的二氧化锰纳米片的制备
[0015] 将20 mL含有浓度为0.3 ~ 1.2 mol/L的羟化四甲铵和质量分数为1.5% ~ 6%的双氧水的水溶液迅速加入到10 mL含有浓度为0.15 ~ 0.6 mol/L的四水合氯化锰溶液中，室温条件下搅拌12 h，离心洗涤后干燥，得到二氧化锰纳米片；
[0016] 取0.1 ~ 0.4 g二氧化锰纳米片加入到10 ~ 40 mL无水乙醇中，随后加入0.1 ~ 0.4 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的二氧化锰纳米片；
[0017] 向10 ~ 40 mL的银纳米水溶液中加入10 ~ 40 mg的氨基化的二氧化锰纳米片，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到银杂化的二氧化锰纳米片。
[0018] 黄曲霉毒素B1的检测方法
[0019] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
[0020] （2）选择计时电流法对黄曲霉毒素B1抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；
[0021] （3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
[0022] （4）将待测样品溶液代替黄曲霉毒素B1抗原标准溶液进行检测。
[0023] 本发明的有益成果
[0024] （1）本发明采用银杂化的二氧化锰纳米片具有良好的生物相容性，通过形成银氮键化学键合至玻碳电极表面。
[0025] （2）本发明采用的银杂化的二氧化锰纳米片对双氧水具有优越的电化学催化性能，提高了生物传感器的灵敏度。
[0026] （3）本发明采用的银杂化的二氧化锰纳米片具有大的比表面积，能够有效固定大量的抗体并增加催化过程的接触面积。
[0027] （4）本发明将制备的无标记型生物传感器用于黄曲霉毒素B1的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。
具体实施方式
[0028] 实施例1 一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法
[0029] （1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
[0030] （2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 mg/mL的银杂化的二氧化锰纳米片水溶液，干燥；
[0031] （3）继续将6 µL浓度为5 µg/mL的黄曲霉毒素B1抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0032] （4）用3 μL浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0033] （5）将6 μL浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
[0034] 实施例2 一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法
[0035] （1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
[0036] （2）在电极表面滴加6 μL浓度为1.5 mg/mL的银杂化的二氧化锰纳米片水溶液，干燥；
[0037] （3）继续将6 µL浓度为10 µg/mL的黄曲霉毒素B1抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0038] （4）用3 μL浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0039] （5）将6 μL浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
[0040] 实施例3 一种基于银杂化的二氧化锰纳米片构建的黄曲霉毒素B1传感器的制备方法
[0041] （1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
[0042] （2）在电极表面滴加6 μL浓度为2 mg/mL的银杂化的二氧化锰纳米片水溶液，干燥；
[0043] （3）继续将6 µL浓度为20 µg/mL的黄曲霉毒素B1抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0044] （4）用3 μL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
[0045] （5）将6 μL浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素B1抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
[0046] 实施例4 银杂化的二氧化锰纳米片的制备
[0047] 将20 mL含有浓度为0.3 mol/L的羟化四甲铵和质量分数为1.5%的双氧水的水溶液迅速加入到10 mL含有浓度为0.15 mol/L的四水合氯化锰溶液中，室温条件下搅拌12 h，离心洗涤后干燥，得到二氧化锰纳米片；
[0048] 取0.1 g二氧化锰纳米片加入到10 mL无水乙醇中，随后加入0.1 mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，将该混合溶液于70℃下反应1.5 h，冷却到室温，离心洗涤后干燥，得到氨基化的二氧化锰纳米片；
[0049] 向10 mL的银纳米水溶液中加入10 mg的氨基化的二氧化锰纳米片，震荡12 h，离心洗涤后干燥，得到银杂化的二氧化锰纳米片。
