一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法

摘要

本发明提供了一种基于离子液体‑超声辅助‑HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，其中技术关键为，在所述制备样品为采用1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液作为提取液提取昆明山海棠药材。采用本发明提供的方法检测效率明显高于传统单成分简称方法，更重要的是本发明提供过程中活性成分的转移率明显高于传统的甲醇提取方法，有效的并避免了检测误差。

权利要求

1.一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，包括制备样品和HPLC检测，其特征在于：所述制备样品为采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液作为提取液提取昆明山海棠药材；

所述提取液中1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的分散剂为甲醇；

所述提取液中1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为0.2-1.0mol·L-1；所述制备样品为采用提取液与昆明山海棠药材10:1的质量比超声萃取30min；

所述制备样品包括以下步骤：

1)精密称定过三号筛昆明山海棠粉末，置于具塞离心试管中；

2)按照固液质量比1:10的比例加入0.6mol·L-1[BMIm]PF6甲醇溶液；

3)超声萃取30min，然后用1 2000r·min-1离心5min，上清液微孔滤膜滤过，即得供试样品；

所述HPLC检测的条件为：

色谱柱：Inertsil ODS-4，色谱柱为3μm,4.6*250mm；

流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液，其中，乙腈简称为A，0.1％磷酸溶液简称为B；

梯度洗脱条件：0～55min，37％A→37％A；

55～75min，37％A→45％A；

75～100min，45％A→45％A；

100～105min，45％A→49％A；

105～125min，49％A→49％A；

检测波长：220nm；

柱温：30℃；流速：0.75mL/min；

进样量：5μl。

说明书

一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检

测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药材的色谱检测方法，更加具体的说涉及一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法。技术背景

[0002] 昆明山海棠是卫矛科雷公藤属植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch.的干燥根，性辛味苦，微温，有大毒，具有祛风除湿，祛瘀通络，续筋接骨的功效。又名火把花、断肠草、紫金皮等，火把花一名始载于《本草纲目》草部毒草类钩吻条，“生滇南者花红，呼为火把花”，是药典品种“昆明山海棠片”的原料药材，也是雷公藤类对人和动物效高毒小的药用植物，应用范围广，具有抗炎、免疫抑制，抗肿瘤，改善肾脏功能等作用，自古中医用于杀虫、舒筋活络、祛风除湿等，使之成为世界瞩目的药用植物资源。化学成分主要为生物碱及萜类化合物等，其中雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤醌A等二萜类成分和雷公藤红素、雷公藤内酯甲等三萜类成分被认为是特征性活性成分。昆明山海棠素(如昆明山海棠素A、D、K等,山海棠素又名雷酚内酯)是昆明山海棠中的特有化学成分。

[0003] 离子液体一般是指由结构不对称的阴阳离子所构成，具有挥发性极低、无毒、无污染、溶解能力强、热稳定性高、绿色环保等优势，近年来，离子液体萃取技术在中药研究领域的引入越来越受到关注。另外在《昆明山海棠—湖南省中药材标准》(2009)未见有含量测定对其进行质量控制，本文首次采用离子液体对昆明山海棠进行微萃取，同时测定昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A，优化了含量测定色谱条件，微萃取中离子液体类型，浓度等，为昆明山海棠进行多成分的质量控制提供一定的参考依据。

发明内容

[0004] 为解决昆明山海棠中活成成分多样化检测困难的问题，本发明提供了一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，其中技术关键为，在所述制备样品为采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液作为提取液提取昆明山海棠药材。

[0005] 其中所述提取液的为0.2-1.0mol·L-1 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐甲醇溶液。

[0006] 所述制备样品为采用提取液与昆明山海棠药材10:1的固液质量比超声提取30min。

[0007] 其中，所述制备HPLC样品的前处理方法包括以下步骤：

[0008] 1)精密称定过三号筛昆明山海棠粉末，置于具塞离心试管中；

[0009] 2)按照固液质量比1:10的比例加入0.6mol·L-1[BMIm]PF6甲醇溶液；

[0010] 3)超声萃取30min，然后用12000r·min-1离心5min，上清液微孔滤膜滤过，即得供试样品。

[0011] 所述HPLC检测的条件为：

[0012] 色谱柱：Inertsil ODS-4(3μm,4.6*250mm)；

[0013] 流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)；

[0014] 梯度洗脱条件：0～55min，37％A→37％A；

[0015] 55～75min，37％A→45％A；

[0016] 75～100min，45％A→45％A；

[0017] 100～105min，45％A→49％A；

[0018] 105～125min，49％A→49％A；

[0019] 检测波长：220nm；

[0020] 柱温：30℃；流速：0.75mL/min；

[0021] 进样量：5μl。

[0022] 本发明的有益技术效果是：采用本发明提供基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法检测效率明显高于传统单成分简称方法，更重要的是本发明提供过程中活性成分的转移率明显高于传统的甲醇提取方法，有效的并避免了检测误差。

附图说明

[0023] 图1昆明山海棠药材及对照品色谱图；

[0024] 图2离子液体对雷公藤晋碱提取率的影响；

[0025] 图3离子液体对雷公藤碱庚提取率的影响；

[0026] 图4离子液体对雷酚内酯提取率的影响；

[0027] 图5离子液体对雷公藤次碱提取率的影响；

[0028] 图6离子液体对.雷公藤醌A提取率的影响；

[0029] 图7离子液体浓度对5种成分提取率的影响；

[0030] 图8固液比对昆明山海棠中5中成分提取率的影响；

[0031] 图9雷公藤晋碱对5种化合物提取率的影响；

[0032] 图10雷公藤碱庚对5种化合物提取率的影响；

[0033] 图11雷酚内酯对5种化合物提取率的影响；

[0034] 图12雷公藤次碱对5种化合物提取率的影响；

[0035] 图13雷公藤醌A对5种化合物提取率的影响；

[0036] 图14提取方式对雷公藤晋碱提取率的影响；

[0037] 图15提取方式对雷公藤碱庚提取率的影响；

[0038] 图16提取方式对雷酚内酯提取率的影响；

[0039] 图17提取方式对雷公藤次碱提取率的影响；

[0040] 图18提取方式对雷公藤醌A提取率的影响；

[0041] 图19超声时间对雷公藤晋碱提取率的影响；

[0042] 图20超声时间对雷公藤碱庚提取率的影响；

[0043] 图21超声时间对雷酚内酯提取率的影响；

[0044] 图22超声时间对雷公藤次碱提取率的影响；

[0045] 图23超声时间对雷公藤醌A提取率的影响；

[0046] 图24粉碎度对雷公藤晋碱提取率的影响；

[0047] 图25粉碎度对雷公藤碱庚提取率的影响；

[0048] 图26粉碎度对雷酚内酯提取率的影响；

[0049] 图27粉碎度对雷公藤次碱提取率的影响；

[0050] 图28粉碎度对雷公藤醌A提取率的影响；

[0051] 其中，附图1中，A.昆明山海棠药材；B.雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的混合对照品；C.雷公藤晋碱对照品；D.雷公藤碱庚对照品；E.雷酚内酯对照品；F.雷公藤次碱对照品；G.雷公藤醌A对照品；色谱峰分别是：1.雷公藤晋碱；2.雷公藤碱庚；3.雷酚内酯；4.雷公藤次碱；5.雷公藤醌A。

具体实施方式

[0052] 实施例1 HPLC的条件考察

[0053] 1.仪器与试药

[0054] 岛津HPLC LC-30A高效液相色谱仪，AEG-45SM电子天平(十万分之一，日本岛津公司)，BP121S(万分之一)(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。KQ250DB型数控超声波清洗器(功率250W，频率40kHz，巩义市予华仪器有限责任公司)，BJ-100多功能粉碎机(德清拜杰电器有限公司)，

[0055] 1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIm]Br，纯度≥99％)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIm]BF4，纯度≥99％)，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm]PF6，纯度≥99％)，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIm]BF4，纯度≥99％)，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([HMIm]PF4，纯度≥99％)，1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([OMIm]BF4，纯度≥99％)，均由中科院兰州化学物理研究所提供。雷公藤晋碱(批号：140925，纯度≥98.0％，成都普菲德生物技术有限公司)，雷酚内酯(批号：14102609，纯度≥98.0％，南京景竹生物科技有限公司)，雷公藤次碱(批号：150623，纯度≥98.0％，成都普菲德生物技术有限公司)，雷公藤碱庚和雷公藤醌A(自制，纯度≥98.0％，中国医学科学研究院药物研究所提供)，乙腈为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯(重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂)。

[0056] 2.方法学考察

[0057] 分别比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈-0.1％磷酸-0.2％三乙胺溶液，乙腈-0.1mol·L-1磷酸二氢钾溶液，乙腈-0.1mol·L-1乙酸铵溶液等梯度洗脱对目标成分的分离效果，结果雷酚内酯和雷公藤次碱不能有效地分离，分离度和对称因子达不到要求。用乙腈-0.1％磷酸溶液进行梯度洗脱分离，能有效地分离昆明山海棠中的5种有效成分。另对检测波长，柱温和流速等进行了考察，最后选择检测波长220nm，柱温30℃，流速为0.75mL·min-1能有效地分离昆明山海棠中的5中有效成分，5种成分的分离度均大于1.5，对称因子均在0.95～1.05之间。

[0058] 分别精密吸取混合对照品溶液0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。分别以雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的含量(ug)为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行回归，回归方程及线性关系见表1。

[0059] 表1 回归方程及线性关系

[0060] Table1 Regression equations and linear relation

[0061]

[0062] 精密吸取同一混合对照品溶液(2.2.1项下)5μL，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD值。结果，昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的RSD依次为0.71％，1.67％，1.98％，0.52％，0.89％，表明仪器具有较好的精密度。

[0063] 因此确定HPLC的检测条件为：色谱柱：Inertsil ODS-4(3μm,4.6*250mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～55min，37％A→37％A；55～75min，37％A→45％A；75～100min，45％A→45％A；100～105min，45％A→49％A；105～125min，49％A→49％A)；
检测波长：220nm；柱温：30℃；流速：0.75mL/min；进样量：5μl。昆明山海棠对照品及样品色谱图见图1。

[0064] 实施例2 制备样品条件的考察

[0065] 1.提取条件中离子液体种类的考察

[0066] 取7份昆明山海棠粉末(过三号筛)各0.5g，精密称定，分别加入0.6mol·L-1[15]的6种离子液体﹛1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIm]Br)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIm]BF4)，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm]PF6)，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIm]BF4)，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([HMIm]PF6)，1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([OMIm]BF4)﹜的甲醇溶液及纯甲醇溶剂各2mL，超声提取30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率，考察离子液体对昆明山海棠粉末超声微萃取效率，选择能有效提取昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的离子液体。结果见图2-6。

[0067] 由图2-6可知，6种离子液体中萃取雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A时[BMIm]PF6的提取率均为最高，为0.047％、0.005％、0.003％、0.018％和0.086％，因此选择[BMIm]PF6里萃取昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A。

[0068] 2.离子液体的浓度考察

[0069] 取6份昆明山海棠粉末(过三号筛)各0.5g，精密称定，分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mol·L-1的[BMIm]PF6甲醇溶液各2mL，超声提取30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率，考察[BMIm]PF6离子液体的浓度对5种成分提取率的影响。结果见图7。

[0070] 由图7可知，[BMIm]PF6甲醇溶液浓度为0.6mol·L-1时雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率都显著高于其它浓度，因此选择[BMIm]PF6甲醇溶液离子液体的浓度为0.6mol·L-1。

[0071] 3.固液比的考察

[0072] 取3份昆明山海棠粉末(过三号筛)适量，精密称定，精密加入0.6mol·L-1的[BMIm]PF6甲醇溶液，分别配制成固液比1:4、1:10、1:20(g·mL-1)的样品，超声提取30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率，考察不同的固液比对5种成分的提取率的影响，结果见图8。

[0073] 由图8可知，固液比为1:4和1:10时，雷酚内酯和雷公藤碱庚的提取率相差不大，溶剂比例大时略有下降，但雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率都有不同程度的提高，综合5个成分的提取率，选择提取昆明山海棠固液比为1:10。

[0074] 4.分散剂的考察

[0075] 分别考察了甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯4种分散剂对昆明山海棠中5种成分的-1提取率。取4份昆明山海棠粉末(过三号筛)各0.1g，精密称定，分别加入0.6mol·L 的[BMIm]PF6甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯溶液各1mL，超声提取30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率。结果见图
9-13。

[0076] 由图9-13可知，无水乙醇为分散剂时，雷公藤晋碱、雷公藤碱庚和雷公藤次碱的提取率均远远高于甲醇、乙腈和乙酸乙酯。甲醇为分散剂时，雷酚内酯和雷公藤醌A的提取率远远高于无水乙醇、乙腈和乙酸乙酯。因此测定雷公藤晋碱、雷公藤碱庚和雷公藤次碱时选择无水乙醇为分散剂；测定雷酚内酯和雷公藤醌A时选择甲醇为分散剂。

[0077] 5.提取方式的考察

[0078] 取4份昆明山海棠粉末(过三号筛)适量，精密称定，其中2份精密加入0.6mol·L-1[BMIm]PF6(分散剂甲醇、无水乙醇)溶液超声30min，2份0.6mol·L-1精密加入[BMIm]PF6(分散剂用甲醇、无水乙醇)溶液回流30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，分别计算各成分的提取率，考察离子液体不同提取方式对昆明山海棠各成分的提取率，结果见图14-18。

[0079] 由图14-18可知，样品采用回流和超声两种提取方式时雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A的提取率相差不大，考虑到超声提取工艺简单，溶剂用量小，因此选择提取方式为超声。

[0080] 6.超声时间的考察

[0081] 取6份昆明山海棠粉末(过三号筛)0.1g，精密称定，加入0.6mol·L-1[BMIm]PF6甲醇溶液各1mL，分成3份，每个2份(分别用分散剂甲醇、无水乙醇)超声提取20min、30min、40min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按选择的分散剂计算各成分的提取率，考察离子液体在不同超声时间对昆明山海棠各成分的提取率，结果见图19-23。

[0082] 由图19-23可知，仅雷公藤晋碱的提取率超声40min时稍高于超声30min，雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率在超声30min时均比超声40min要高，因此选择超声提取的时间为30min。

[0083] 7.不同粉碎度的考察

[0084] 取昆明山海棠粉末(分别过二、三、四、五号筛)0.1g(8份)，分别加入0.6mol·L-1[BMIm]PF6甲醇溶液和无水乙醇溶液各1mL(各4份)，精密称定，超声30min，离心5min(12000r·min-1)，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率，考察离子液体在不同超声时间对昆明山海棠各成分的提取率，结果见图23-28。

[0085] 由图24-28可知，综合不同粉碎度雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率，昆明山海棠粉碎后过三号筛能有效的提取5种成分。因此选择粉碎昆明山海棠后过三号筛来进行提取。

[0086] 根上述优选条件，对昆明山海棠原药材粉末进行检测，证明试验离子液体中仅[BMIm]PF6提取雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A时均比甲醇的提取率高。采用离子液体提取5中成分的含量相比单纯用甲醇提取，雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A含量分别高出104.7％、83.1％、28.8％、141.8％和11.1％；采用离子液体提取5种成分的含量相比单纯用无水乙醇提取，雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A含量分别高出23.9％、9.8％、48.7％、15.6％和
61.7％。采用离子液体结合超声波提取法的优势，有效的测定了昆明山海棠中5种活性成分，结果表明该方法稳定、简单、绿色环保。