糖链抗原125的定量检测试剂盒

摘要

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B。

权利要求

1.一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成：CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B；所述的校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l pH7.4的PBS缓冲液，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。

2.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l pH7.4的PBS缓冲液稀释CA125配制质控品1和2；

CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。

3.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液，所述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液为含0.5mg/L的辣根过氧化物酶标记的CA125单克隆抗体、0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。

5.根据权利要求1所述的定量免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。

说明书

糖链抗原125的定量检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于医疗检测领域，具体涉及糖链抗原125的定量检测试剂盒。

背景技术

[0002] 糖链多肽抗原125(CA125)，又称糖类抗原125、癌抗原125，其是一种糖类肿瘤相关抗原，是一种大分子的多聚糖，主要存在于上皮性卵巢癌组织和病人血液中。糖链多肽抗原检测主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌、卵巢上皮癌，糖链多肽抗原125与卵巢癌患者的病变大小密切相关。同时也是手术切除、化疗后疗效观察和判断有无复发的指标。

[0003] CA125是上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肺癌等多种癌症的肿瘤标志物。其Cutoff值一般为35KU/L，卵巢癌、肺癌、子宫颈癌等患者该指标明显明显升高，但因目前为止尚未发现100％特异性和100％灵敏度的肿瘤标志物，肿瘤与肿瘤标志物之间不是一一对应关系，而只是相关性，因此不能仅仅从该指标阳性就确诊是否是癌症，需要紧密结合临床及其他检查手段综合判断。另外，也有假阳性存在，如某些妊娠期前三个月、行经期、子宫内膜异位、子宫纤维变性、急性输卵管炎、肝病、胸腹膜感染、心包感染等患者该指标也会呈阳性。

[0004] 利用CA125还可以判断残存肿瘤情况，CA125估计再手术的敏感性为50％，特异性为96％。第一个化疗期后，CA125水平可提示疾病的预后，如能降至原来水平的1/10，表明病情转归良好；三个化疗周期后，CA125水平持续升高预后较差。CA125预测肿瘤复发、转移的精确度为75％。从CA125升高到出现临床症状有3～4个月。80％～90％病例中，CA125与疾病的预后和转轨有关。

[0005] 专利CN200910201292以及专利201310582689分别公开了CA125相关的化学发光检测试剂盒，虽然专利声称上述试剂盒具有较高的稳定性以及灵敏度，但是其试剂盒中的试剂组分不是十分明确，并且在实际应用中，稳定性不佳。

发明内容

[0006] 本发明的第一方面是提供一种CA125的定量检测试剂盒，其由以下成分组成CA125单克隆抗体包被微孔反应板、CA125校准品、CA125质控品、酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B。

[0007] 所述的校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。

[0008] CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)稀释CA125配制质控品1和2；CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。

[0009] 所述的酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的CA125抗体溶液为含1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的CA125单克隆抗体，含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mL PEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。

[0010] 所述的浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。

[0011] 所述的发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。

[0012] 本发明的第二方面是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

[0013] (1)CA125单克隆抗体的制备：将表达CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：C201318)体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97％DMEM/F12:RPMI1640＝1:1；3％FBS；滚速0.5rpm；每隔96个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次；并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，
2IU/10ml牛胰岛素；培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；

[0014] (2)所述的CA125单克隆抗体包被微孔反应板的制备方法如下：

[0015] a.包被：取1mol/l Na2HPO4 77.4ml和1mol/l NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入1mg/L的抗CA125单抗混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃，16小时；

[0016] b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％明胶的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；

[0017] c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2～8℃保存。

[0018] (3)酶结合物制备：

[0019] a.将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO41ml，混匀于4℃放置30分钟；

[0020] b.加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；

[0021] c.加入含5mg抗CA125抗体的水溶液2ml，然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；

[0022] d.吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4，4℃下放置2小时；

[0023] e.滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；

[0024] f.上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；

[0025] g.吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；

[0026] h.将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.05g/mL酪蛋白和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。

[0027] (4)所述的校准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，按照本领域常规的溶液配制方法制备。

具体实施方式

[0028] 下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

[0029] 实施例1

[0030] (1)CA125单克隆抗体的制备：将表达CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：C201318)体外培养；接种细胞数2×105/ml；培养液组成为97％DMEM/F12:RPMI1640＝1:1；3％FBS；滚速0.5rpm；每隔96个小时全数换液一次，共进行两次换液，收获三次；并且细胞培养时，在培养基中加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，
2IU/10ml牛胰岛素；培养上清经过过滤澄清，纯化，收集抗体即得；

[0031] (2)所述的CA125单克隆抗体包被微孔反应板的制备方法如下：

[0032] a.包被：取1mol/l Na2HPO4 77.4ml和1mol/l NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量抗CA125单抗混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃，16小时；

[0033] b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％明胶的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；

[0034] c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2～8℃保存。

[0035] (3)酶结合物制备：

[0036] a,将10mg HRP溶于1ml蒸馏水中并加入新鲜配制的0.06mol/LNaIO4 1ml,混匀于4℃放置30分钟；

[0037] b，加入0.16mol/L乙二醇水溶液1ml，室温放置30分钟；

[0038] c,加入含5mg抗CA125抗体的水溶液2ml,然后于4℃下，对0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)透析过夜；

[0039] d，吸出透析袋内溶液，加入0.5ml NaBH4，4℃下放置2小时；

[0040] e，滴加等体积饱和(NH4)2SO4溶液，4℃下放置30分钟；

[0041] f，上述溶液2500rpm离心10分钟，去除上清液，沉淀用少许0.02mol/LpH7.4的PBS溶解，并于4℃下对此缓冲液透析过夜；

[0042] g,吸出透析袋内溶液，离心除去不溶物，上清液过Superose 6层析柱，用0.02mol/L pH7.4的PBS洗脱，收集第一峰，即为纯化的酶标记抗体；

[0043] h，将收集的酶标记抗体除菌过滤，再用含0.05g/mL酪蛋白和0.2mg/L的PEG200的15mmol/L PBS缓冲液溶解至抗体终浓度0.5mg/L。

[0044] (4)所述的校准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，按照本领域常规的溶液配制方法制备。

[0045] 校准品为不同浓度的CA125标准品溶液，其分别含有5、15、50、100、300和600U/ml的CA125标准品的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)，并且每升标准品溶液中含有1g酪蛋白和2g明胶。

[0046] CA125质控品的制备：用含有1g/L酪蛋白和2g/L明胶的15mmol/l PBS缓冲液(pH7.4)稀释CA125配制质控品1和2；CA125浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。

[0047] 浓缩洗涤液为含有吐温20的20％NaCl溶液，吐温20含量为0.1％。

[0048] 发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。

[0049] 实施例2试剂盒灵敏度测定

[0050] 分别配制CA125标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1U/L，0.5U/L，1U/L，5U/L，10U/L，20U/L，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，并且同时使用对比例试剂盒进行同样检测，对比例为专利CN200910201292实施例1制备的化学发光检测试剂盒，具体检测方法如下：

[0051] a.向微孔板加入CA125标准品，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育90分钟；

[0052] b.手工洗涤：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5此后拍干。或者洗板机洗涤：每孔350μl，重复4次，洗涤后拍干。

[0053] c.加入酶结合物，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育60分钟。

[0054] d.重复步骤b。

[0055] e.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。

[0056] f.制作标准曲线：以标准品浓度的lg值为横坐标，标准品测定的OD的值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；

[0057] 计算CA125标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的CA125标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：

[0058] 结果表明本发明实施例1制备的试剂盒其灵敏度可以达到0.1U/L，而对比例的灵敏度为0.5U/L。并且根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为y＝0.79X+0.013；R2＝0.99。

[0059] 实施例3

[0060] 采用HPLC方法测定实施例1步骤1(单克隆抗体制备)中纯化前上清液中以及对比试验上清液中的CA125单克隆抗体含量，而在对比试验中不加入10IU/10ml LIF(白细胞抑制因子)，2IU/10ml HCG，2IU/10ml牛胰岛素，结果表明：本发明实施例1收获的上清液中抗体含量为13.4mg/L，而对比试验上清液中抗体含量为4.4mg/L。

[0061] 实施例4试剂盒稳定性考察

[0062] 将实施例1制备的试剂盒在37℃分别放置1个月，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并对实施例1中试剂盒中校准品测定数据进行回归分析，计算R2值。

[0063] 本实施例中对比例设定如下：

[0064] 对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的CA125单克隆抗体溶液中不添加PEG200。

[0065] 对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于HRP标记的抗CA125抗体溶液中PEG200替换为胎牛血清(FBS)，浓度同PEG200。

[0066] 对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品溶液中，含1g/L的酪蛋白和2g/L的蔗糖。

[0067] 对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含2g/L的酪蛋白和4g/L的明胶。

[0068] 对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于标准品PBS溶液中，含0.5g/L的酪蛋白和0.5g/L的明胶。

[0069] 具体结果如下：