芋螺毒素(CONOTOXIN)肽，其医药组合物和用途转让专利
申请号 : CN201480037106.7
文献号 : CN105377286B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : J·迈克尔·麦金托什
申请人 : 犹他大学研究基金会
摘要 :
本发明描述α‑芋螺毒素肽RgIA的芋螺毒素肽类似物。所述芋螺毒素肽类似物阻断烟碱型乙酰胆碱受体nAChR的α9α10亚型并且可用于治疗疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症。
权利要求 :
1.一种芋螺毒素肽，其由式SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:
26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:
17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:37组成。
2.根据权利要求1所述的芋螺毒素肽，其由式：SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:11组成。
3.根据权利要求1或2所述的芋螺毒素肽，其中所述芋螺毒素肽的C‑末端为羧酸基或酰胺基。
4.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到3中任一权利要求所述的芋螺毒素肽或其盐，以及药学上可接受的载剂。
5.一种根据权利要求1到3中任一项所述的芋螺毒素肽或根据权利要求4所述的医药组合物的用途，其用于制造用以治疗有需要的受试者中与人类烟碱型乙酰胆碱受体nAChR的α
9α10亚型的表达升高相关的至少一种病况的药剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况为疼痛或炎症性病况。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况选自慢性疼痛、神经痛、伤害性疼痛、炎症性病症诱发的疼痛、代谢失调诱发的疼痛、化学疗法诱发的疼痛、外科手术程序诱发的疼痛、烧伤诱发的疼痛和/或化学疗法相关的神经病变。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述慢性疼痛是化学疗法相关的慢性疼痛。
9.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况选自炎症性疼痛或癌症诱发的疼痛。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述神经痛是末梢神经损伤诱发的疼痛。
11.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况为选自慢性炎症、风湿性疾病、败血症、纤维肌痛、炎症性肠病、类肉瘤病、子宫内膜异位、子宫肌瘤、炎症性皮肤病、免疫细胞介导的炎症、肺炎症性病况、神经系统炎症相关的疾病、牙周病或心血管疾病的炎症性病况。
12.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况为疼痛和炎症。
13.根据权利要求5所述的用途，其中所述至少一种病况为炎症和神经病变。
说明书 :
芋螺毒素(CONOTOXIN)肽，其医药组合物和用途
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002] 本申请案要求2013年5月31日申请的美国临时专利申请案第61/829,633号和2013年7月5日申请的美国临时专利申请案第61/843,135号的优先权，所述申请案的全部内容都
以引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入本文中。
[0003] 政府支持的引用
[0004] 本发明在由国立卫生研究所(National Institutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰(Maryland)颁发的授权号为MH53631、GM48677和NS048158的政府支持
下产生。美国政府享有本发明中的特定权利。
下产生。美国政府享有本发明中的特定权利。
背景技术
[0005] 芋螺属的食肉性海蜗牛的毒液富含神经药理学活性肽(阿米肖(Armishaw)等人,2005；王(Wang)等人,2004；列维特(Livett)等人,2004；路易斯(Lewis),2004；特劳
(Terlau)等人,2004)。芋螺属中有约500个物种，并且在目前已检验的那些物种中，不变的
特征是其毒液中存在α‑芋螺毒素(α‑conotoxin)肽。α‑芋螺毒素肽为具有C1‑C3二硫键和
C2‑C4二硫键的高度二硫交联的肽。
(Terlau)等人,2004)。芋螺属中有约500个物种，并且在目前已检验的那些物种中，不变的
特征是其毒液中存在α‑芋螺毒素(α‑conotoxin)肽。α‑芋螺毒素肽为具有C1‑C3二硫键和
C2‑C4二硫键的高度二硫交联的肽。
[0006] 由于α‑芋螺毒素的非半胱氨酸残基的高序列变异性，α‑芋螺毒素非常多样并且每个芋螺物种具有独特的α‑芋螺毒素肽补体。α‑芋螺毒素肽以大型前驱体形式合成，且成熟
毒素通过对前驱体的C‑末端进行蛋白酶裂解而产生。与成熟毒素的半胱氨酸间可变序列相
反，前驱体以及其编码基因在给定芋螺物种中的α‑芋螺毒素肽之间和物种与物种之间都相
当保守。
毒素通过对前驱体的C‑末端进行蛋白酶裂解而产生。与成熟毒素的半胱氨酸间可变序列相
反，前驱体以及其编码基因在给定芋螺物种中的α‑芋螺毒素肽之间和物种与物种之间都相
当保守。
[0007] α‑芋螺毒素肽通常显示为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)拮抗剂(麦金托什(Mcintosh)等人,1999；简斯(Janes),2005；达顿(Dutton)等人,2001；阿里亚斯(Arias)等
人,2000)。nAChR为乙酰胆碱闸控离子通道的群组，所述乙酰胆碱闸控离子通道为配体闸控
离子通道超家族的部分(卡林(Karlin)，2002；戈蒂(Gotti)等人，2004)。其为环绕中心离子
传导信道的跨膜子单元的五聚物。已识别出多种不同子单元，且大多数属于两个主要超家
族(α子单元和β子单元)。子单元在受体五聚物中可用多种组合缔合，导致受体亚型的不同
家族。大多数亚型包含来自α子单元家族和β子单元家族的子单元，例如人类成体肌肉亚型
包含两个α子单元和一个β子单元(除δ子单元和ε子单元之外)并且α3β2亚型由α3子单元和β
2子单元构成。仅由α子单元构成的nAChR为α7亚型和α9亚型(均五聚物)以及α9α10亚型(全α
杂五聚物)。系统发生分析显示，α7子单元、α9子单元和α10子单元彼此间的关系相较于与其
它nAChR子单元的关系更紧密(雷诺夫(Le Novere)等人,2002；斯嘉德(Sgard)等人,2002)。
人,2000)。nAChR为乙酰胆碱闸控离子通道的群组，所述乙酰胆碱闸控离子通道为配体闸控
离子通道超家族的部分(卡林(Karlin)，2002；戈蒂(Gotti)等人，2004)。其为环绕中心离子
传导信道的跨膜子单元的五聚物。已识别出多种不同子单元，且大多数属于两个主要超家
族(α子单元和β子单元)。子单元在受体五聚物中可用多种组合缔合，导致受体亚型的不同
家族。大多数亚型包含来自α子单元家族和β子单元家族的子单元，例如人类成体肌肉亚型
包含两个α子单元和一个β子单元(除δ子单元和ε子单元之外)并且α3β2亚型由α3子单元和β
2子单元构成。仅由α子单元构成的nAChR为α7亚型和α9亚型(均五聚物)以及α9α10亚型(全α
杂五聚物)。系统发生分析显示，α7子单元、α9子单元和α10子单元彼此间的关系相较于与其
它nAChR子单元的关系更紧密(雷诺夫(Le Novere)等人,2002；斯嘉德(Sgard)等人,2002)。
[0008] α9nAChR子单元和α10nAChR子单元在不同组织中表达。在内耳中，α9α10 nAChR介导传出橄榄耳蜗纤维与耳蜗毛细胞之间的突触传输(斯嘉德等人,2002；爱高恒(Elgoyhen)
等人,1994；爱高恒等人,2001)。α9子单元和α10子单元还发现于背根神经节神经元(哈伯格
(Harberger)等人,2004；利普斯(Lips)等人,2002)、淋巴细胞(彭(Peng)等人,2004)、皮肤
角质细胞(阿雷东多(Arredondo)等人,2002；阮(Nguyen)等人,2000；库尔森(Kurzen)等人,
2004)以及垂体结节部(斯嘉德等人,2002；爱高恒等人,1994；爱高恒等人,2001)。此外，α
9nAChR子单元在乳癌中活跃(李(Lee)等人,2010a；李等人,2010b；林诺拉(Linnoila),
2010)。α‑芋螺毒素肽RgIA(RgIA；GCCSDPRCRYRCR；SEQ ID NO:1)已显示阻断α9α10 nAChR
(艾里森(Ellison)等人,2006)。RgIA的某些类似物也已经显示阻断α9α10 nAChR(US 2009/
0203616、US 2012/0220539以及WO 2008/011006)。
等人,1994；爱高恒等人,2001)。α9子单元和α10子单元还发现于背根神经节神经元(哈伯格
(Harberger)等人,2004；利普斯(Lips)等人,2002)、淋巴细胞(彭(Peng)等人,2004)、皮肤
角质细胞(阿雷东多(Arredondo)等人,2002；阮(Nguyen)等人,2000；库尔森(Kurzen)等人,
2004)以及垂体结节部(斯嘉德等人,2002；爱高恒等人,1994；爱高恒等人,2001)。此外，α
9nAChR子单元在乳癌中活跃(李(Lee)等人,2010a；李等人,2010b；林诺拉(Linnoila),
2010)。α‑芋螺毒素肽RgIA(RgIA；GCCSDPRCRYRCR；SEQ ID NO:1)已显示阻断α9α10 nAChR
(艾里森(Ellison)等人,2006)。RgIA的某些类似物也已经显示阻断α9α10 nAChR(US 2009/
0203616、US 2012/0220539以及WO 2008/011006)。
发明内容
[0009] 本发明涉及α‑芋螺毒素肽RgIA的类似物(本文的芋螺毒素肽类似物)。这些芋螺毒素肽类似物阻断烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9α10亚型，并且可用于治疗疼痛、炎症性
病况、炎症和/或癌症。
病况、炎症和/或癌症。
附图说明
[0010] 图1A和1B展示苏氨酸(Thr或T)56/异亮氨酸(Ile或I)造成大鼠对比人类的RgIA抑制效能差异。大鼠α9子单元中Thr56突变为Ile，导致对大鼠受体的RgIA效能降低到人类受
体发现的水平(图1A)。将人类α9受体中的Ile56置换为Thr导致对人类受体的RgIA效能增加
到大鼠体内所发现的水平(图1B)。各值为由至少三个卵母细胞的平均值±平均值标准误差
(standard error of the mean；SEM)，所述卵母细胞中注射有比率为1:1的来自α9子单元
基因的cRNA和α10子单元基因的cRNA。
体发现的水平(图1A)。将人类α9受体中的Ile56置换为Thr导致对人类受体的RgIA效能增加
到大鼠体内所发现的水平(图1B)。各值为由至少三个卵母细胞的平均值±平均值标准误差
(standard error of the mean；SEM)，所述卵母细胞中注射有比率为1:1的来自α9子单元
基因的cRNA和α10子单元基因的cRNA。
[0011] 图2展示类似物2(表1；SEQ ID NO:4)选择性阻断α9α10 nAChR对于α7nAChR。类似物2施用于表达人类α9α10 nAChR或人类α7nAChR的爪蟾(Xenopus)卵母细胞。10nM的类似物
2阻断α9α10 nAChR的Ach‑诱发反应的75±2.8％。高一千倍的浓度(10μM肽)没有能阻断α
7nAChR。(n＝5)。展示个别卵母细胞的代表性迹线。
2阻断α9α10 nAChR的Ach‑诱发反应的75±2.8％。高一千倍的浓度(10μM肽)没有能阻断α
7nAChR。(n＝5)。展示个别卵母细胞的代表性迹线。
[0012] 图3展示神经损伤后的物质P表达。其为热损伤24小时和一周后，脊髓背角中提高的物质P表达的显微照片。
[0013] 图4A到4J展示芋螺毒素肽在化学疗法诱发的神经痛中的功效。每天投予RgIA在第14天和第21天产生显著镇痛效果(图4A、4B、4E、4F以及4I)。图4C、4D、4G、4H以及4J展示表明
此预防性治疗范例中CSP‑4的镇痛效果的数据。
此预防性治疗范例中CSP‑4的镇痛效果的数据。
[0014] 图5A和5B展示RgIA(图5A)和CSP‑7(图5B)显著降低烧伤引发的热痛觉过敏，如通过哈格雷夫斯(Hargraves)方法以全部三个测试剂量(4mcg/Kg、20mcg/Kg和100mcg/Kg)测
量。
量。
具体实施方式
[0015] 本发明涉及芋螺毒素肽，所述芋螺毒素肽为α‑芋螺毒素肽RgIA的类似物(本文中的芋螺毒素肽类似物)，以及其变异体、d取代类似物、修饰物以及衍生物(本文中统称“芋螺
毒素肽”)。这些芋螺毒素肽阻断烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9α10亚型，并且可用于治
疗疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症。芋螺毒素肽还可用于本文所述的进一步药物开发。
毒素肽”)。这些芋螺毒素肽阻断烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9α10亚型，并且可用于治
疗疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症。芋螺毒素肽还可用于本文所述的进一步药物开发。
[0016] I.α‑芋螺毒素肽RgIA的类似物
[0017] 来自无急性或慢性毒性存在的动物疼痛模型的数据表明α‑芋螺毒素肽为药物开发提供有前景的引导。支持这一结论的是，来自维多利亚芋螺(Conus victoriae)的相关肽
(Vc1.1)已进行到第2期临床试验才发现其对于人类α9α10 nAChR的效用显著低于对大鼠α9
α10 nAChR(列维特等人,2006)。同样地，对RgIA的研究已证实这一肽对人类受体的效用比
对大鼠受体的效用小约170倍(阿扎姆(Azam)等人,2012)。通过使用定点突变诱发，已识别
出α9子单元中的单一残基(Thr/Ile 56)为导致大鼠α9α10和人类α9α10与RgIA之间大部分
相互作用差异的原因(图1A)。将人类α9从Ile56改变为大鼠体内发现的Thr导致对人类受体
的RgIA效能增大2的对数(图1B)。
(Vc1.1)已进行到第2期临床试验才发现其对于人类α9α10 nAChR的效用显著低于对大鼠α9
α10 nAChR(列维特等人,2006)。同样地，对RgIA的研究已证实这一肽对人类受体的效用比
对大鼠受体的效用小约170倍(阿扎姆(Azam)等人,2012)。通过使用定点突变诱发，已识别
出α9子单元中的单一残基(Thr/Ile 56)为导致大鼠α9α10和人类α9α10与RgIA之间大部分
相互作用差异的原因(图1A)。将人类α9从Ile56改变为大鼠体内发现的Thr导致对人类受体
的RgIA效能增大2的对数(图1B)。
[0018] 使用受体‑配体动力学以及RgIA的核磁共振(nuclear magnetic resonance；NMR)结构的知识，设计出对人类受体和对大鼠受体大致等效的RgIA的结构类似物。识别出RgIA
中提高人类α9α10结合的四个突变。精氨酸(Arg或R)9到瓜氨酸或ω‑硝基‑Arg的单一取代，
以及酪氨酸(Tyr或Y)10到单碘‑Tyr(后者为SEQ ID NO:21)的单一取代各对大鼠受体导致
小效能提高，但对人类受体导致4倍到8倍的效能提高。丝氨酸(Ser或S)4改变为Thr，或
Arg11改变为谷氨酸(Gln或Q)各自也导致对人类受体的3倍到4倍效能提高。在单个肽(类似
物2；SEQ ID NO:19)中组合这些四个改变导致IC50约为8nM时对人类受体的效能提高>100
倍(表2)。
中提高人类α9α10结合的四个突变。精氨酸(Arg或R)9到瓜氨酸或ω‑硝基‑Arg的单一取代，
以及酪氨酸(Tyr或Y)10到单碘‑Tyr(后者为SEQ ID NO:21)的单一取代各对大鼠受体导致
小效能提高，但对人类受体导致4倍到8倍的效能提高。丝氨酸(Ser或S)4改变为Thr，或
Arg11改变为谷氨酸(Gln或Q)各自也导致对人类受体的3倍到4倍效能提高。在单个肽(类似
物2；SEQ ID NO:19)中组合这些四个改变导致IC50约为8nM时对人类受体的效能提高>100
倍(表2)。
[0019] 类似物2的进一步优化显示可通过进一步向肽末端添加两个Arg残基(类似物4；SEQ ID NO:4)和/或通过将Arg13修饰为Tyr(类似物3；SEQ ID NO:3)实现对人类受体的效
能提高。除这些取代之外，半胱氨酸(Cys或C)残基(Cys2和Cys3)中的两者也修饰为硒代半
胱氨酸以提高肽的稳定性和再折叠效率(SEQ ID NO:20)。双重硒代半胱氨酸突变体对人类
受体的效能相对于未修饰的RgIA显示出10倍提高。RgIA的上述改变单独或组合用于构造对
人类通道具有提高效能的类似物，解决先前临床候选物Vc1.1的关键开发问题。
能提高。除这些取代之外，半胱氨酸(Cys或C)残基(Cys2和Cys3)中的两者也修饰为硒代半
胱氨酸以提高肽的稳定性和再折叠效率(SEQ ID NO:20)。双重硒代半胱氨酸突变体对人类
受体的效能相对于未修饰的RgIA显示出10倍提高。RgIA的上述改变单独或组合用于构造对
人类通道具有提高效能的类似物，解决先前临床候选物Vc1.1的关键开发问题。
[0020] 在 多 个 实 施 例 中 ，本 文 所 披 露 的 芋 螺 毒 素 肽 类 似 物 具 有式GX6X7X3DPRX8X1X2X4X9X5(SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:37)，其中X1为Arg、
瓜氨酸或ω‑硝基‑Arg；X2为Tyr或单碘‑Tyr；X3为Ser或Thr；X4为Arg、Gln或Glu；X5为Arg、
Tyr、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、Tyr‑Tyr、Tyr‑Arg、Arg‑Arg‑Arg、Arg‑Arg‑Tyr或
Tyr‑Arg‑Arg；X6为Cys或硒代半胱氨酸；X7为Cys或硒代半胱氨酸；X8为Cys或硒代半胱氨
酸；且X9为Cys或硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X1为Arg。在一个实施例中，X1为瓜氨酸。
在一个实施例中，X1为ω‑硝基‑Arg。在一个实施例中，X3为Ser。在一个实施例中，X3为Thr。
在一个实施例中，X4为Arg。在一个实施例中，X4为Gln。在一个实施例中，X4为Glu。在一个实
施例中，X5为Arg。在一个实施例中，X5为Tyr。在一个实施例中，X5为Phe。在一个实施例中，
X5为Trp。在一个实施例中，X5为Tyr‑Tyr。在一个实施例中，X5为Tyr‑Arg。在一个实施例中，
X5为Arg‑Arg‑Arg。在一个实施例中，X5为Arg‑Arg‑Tyr。在一个实施例中，X5为Tyr‑Arg‑
Arg。在一个实施例中，X6为Cys。在一个实施例中，X6为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X7
为Cys。在一个实施例中，X7为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X8为Cys。在一个实施例中，
X8为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X9为Cys。在一个实施例中，X9为硒代半胱氨酸。
瓜氨酸或ω‑硝基‑Arg；X2为Tyr或单碘‑Tyr；X3为Ser或Thr；X4为Arg、Gln或Glu；X5为Arg、
Tyr、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、Tyr‑Tyr、Tyr‑Arg、Arg‑Arg‑Arg、Arg‑Arg‑Tyr或
Tyr‑Arg‑Arg；X6为Cys或硒代半胱氨酸；X7为Cys或硒代半胱氨酸；X8为Cys或硒代半胱氨
酸；且X9为Cys或硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X1为Arg。在一个实施例中，X1为瓜氨酸。
在一个实施例中，X1为ω‑硝基‑Arg。在一个实施例中，X3为Ser。在一个实施例中，X3为Thr。
在一个实施例中，X4为Arg。在一个实施例中，X4为Gln。在一个实施例中，X4为Glu。在一个实
施例中，X5为Arg。在一个实施例中，X5为Tyr。在一个实施例中，X5为Phe。在一个实施例中，
X5为Trp。在一个实施例中，X5为Tyr‑Tyr。在一个实施例中，X5为Tyr‑Arg。在一个实施例中，
X5为Arg‑Arg‑Arg。在一个实施例中，X5为Arg‑Arg‑Tyr。在一个实施例中，X5为Tyr‑Arg‑
Arg。在一个实施例中，X6为Cys。在一个实施例中，X6为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X7
为Cys。在一个实施例中，X7为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X8为Cys。在一个实施例中，
X8为硒代半胱氨酸。在一个实施例中，X9为Cys。在一个实施例中，X9为硒代半胱氨酸。
[0021] 在多个实施例中，本文所披露的芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCX3(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:29)，其中X1为Arg或瓜氨酸；X2为单碘‑Tyr；且X3为
Tyr、Phe、Trp、Tyr‑Tyr、Tyr‑Arg、Arg‑Arg‑Arg、Arg‑Arg‑Tyr或Tyr‑Arg‑Arg。在一个实施例
中，X1为Arg。在另一实施例中，X1为瓜氨酸。在一个实施例中，X3为Tyr。在另一实施例中，X3
为Phe。在另一实施例中，X3为Trp。在另一实施例中，X3为Tyr‑Tyr。在另一实施例中，X3为
Tyr‑Arg。在另一实施例中，X3为Arg‑Arg‑Arg。在另一实施例中，X3为Arg‑Arg‑Tyr。在另一
实施例中，X3为Tyr‑Arg‑Arg。
Tyr、Phe、Trp、Tyr‑Tyr、Tyr‑Arg、Arg‑Arg‑Arg、Arg‑Arg‑Tyr或Tyr‑Arg‑Arg。在一个实施例
中，X1为Arg。在另一实施例中，X1为瓜氨酸。在一个实施例中，X3为Tyr。在另一实施例中，X3
为Phe。在另一实施例中，X3为Trp。在另一实施例中，X3为Tyr‑Tyr。在另一实施例中，X3为
Tyr‑Arg。在另一实施例中，X3为Arg‑Arg‑Arg。在另一实施例中，X3为Arg‑Arg‑Tyr。在另一
实施例中，X3为Tyr‑Arg‑Arg。
[0022] 在一个实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCY(SEQ ID NO:3；本文中也称为类似物3)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物
具有式GCCTDPRCX1X2QCRRR(SEQ ID NO:4；本文中也称为类似物4)，其中X1为瓜氨酸且X2为
单碘‑Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYRR(SEQ ID NO:5；
本文中也称为类似物5)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类
似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRY(SEQ ID NO:6；本文中也称为类似物6)，其中X1为瓜氨酸且
X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCF(SEQ ID NO:
7；本文中也称为类似物7)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽
类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCW(SEQ ID NO:8；本文中也称为类似物8)，其中X1为瓜氨酸且
X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYY(SEQ ID NO:
9；本文中也称为类似物9)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽
类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYR(SEQ ID NO:10；本文中也称为类似物10)，其中X1为瓜氨
酸且X2为单碘‑Tyr。
具有式GCCTDPRCX1X2QCRRR(SEQ ID NO:4；本文中也称为类似物4)，其中X1为瓜氨酸且X2为
单碘‑Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYRR(SEQ ID NO:5；
本文中也称为类似物5)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类
似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRY(SEQ ID NO:6；本文中也称为类似物6)，其中X1为瓜氨酸且
X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCF(SEQ ID NO:
7；本文中也称为类似物7)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽
类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCW(SEQ ID NO:8；本文中也称为类似物8)，其中X1为瓜氨酸且
X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYY(SEQ ID NO:
9；本文中也称为类似物9)，其中X1为瓜氨酸且X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽
类似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYR(SEQ ID NO:10；本文中也称为类似物10)，其中X1为瓜氨
酸且X2为单碘‑Tyr。
[0023] 在一个实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCY(SEQ ID NO:11；本文中也称为类似物11)，其中X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式
GCCTDPRCRX2QCRRR(SEQ ID NO:12；本文中也称为类似物12)，其中X2为单碘‑Tyr。在额外实
施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYRR(SEQ ID NO:13；本文中也称为类似物
13)，其中X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCRRY
(SEQ ID NO:14；本文中也称为类似物14)，其中X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素
肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCF(SEQ ID NO:15；本文中也称为类似物15)，其中X2为单碘‑
Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCW(SEQ ID NO:16；本文中也
称为类似物16)，其中X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式
GCCTDPRCRX2QCYY(SEQ ID NO:17；本文中也称为类似物17)，其中X2为单碘‑Tyr。在另一实
施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYR(SEQ ID NO:18；本文中也称为类似物
18)，其中X2为单碘‑Tyr。
GCCTDPRCRX2QCRRR(SEQ ID NO:12；本文中也称为类似物12)，其中X2为单碘‑Tyr。在额外实
施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYRR(SEQ ID NO:13；本文中也称为类似物
13)，其中X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCRRY
(SEQ ID NO:14；本文中也称为类似物14)，其中X2为单碘‑Tyr。在另一实施例中，芋螺毒素
肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCF(SEQ ID NO:15；本文中也称为类似物15)，其中X2为单碘‑
Tyr。在额外实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCW(SEQ ID NO:16；本文中也
称为类似物16)，其中X2为单碘‑Tyr。在又一实施例中，芋螺毒素肽类似物具有式
GCCTDPRCRX2QCYY(SEQ ID NO:17；本文中也称为类似物17)，其中X2为单碘‑Tyr。在另一实
施例中，芋螺毒素肽类似物具有式GCCTDPRCRX2QCYR(SEQ ID NO:18；本文中也称为类似物
18)，其中X2为单碘‑Tyr。
[0024] 本文所披露的芋螺毒素肽类似物的“变异体”包括相较于本文所披露的芋螺毒素肽类似物具有一或多个氨基酸添加、氨基酸缺失、氨基酸终止位置或氨基酸取代的肽。
[0025] 氨基酸取代可为保守取代或非保守取代。本文所披露的芋螺毒素肽类似物的变异体可包括具有一或多个保守氨基酸取代的那些变异体。如本文所使用，“保守取代”涉及以
下保守取代群组中的一者中出现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、Ser、
Thr；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、Glu；第3组：天冬酰氨酸(Asn或N)、谷氨酸(Gln或Q)；第4组：
Arg、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：Ile、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、
缬氨酸(Val或V)；以及第6组：Phe、Tyr、Trp。
下保守取代群组中的一者中出现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、Ser、
Thr；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、Glu；第3组：天冬酰氨酸(Asn或N)、谷氨酸(Gln或Q)；第4组：
Arg、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：Ile、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、
缬氨酸(Val或V)；以及第6组：Phe、Tyr、Trp。
[0026] 此外，氨基酸可以按相似的功能、化学结构或组成(例如酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫)分组成保守取代组。举例来说，脂肪族组可包括(出于取代目的)Gly、Ala、Val、Leu
以及Ile。彼此视为保守取代的含有氨基酸的其它群组包括：含硫：Met和Cys；酸性：Asp、
Glu、Asn以及Gln；小分子脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro以及Gly；极性带负
电残基以及其酰胺：Asp、Asn、Glu以及Gln；极性带正电残基：His、Arg以及Lys；大分子脂肪
族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val以及Cys；以及大分子芳香族残基：Phe、Tyr以及Trp。额外
信息发现于克赖顿(Creighton)(1984)蛋白质(Proteins),W.H.费里曼公司(W.H.Freeman
and Company)中。
以及Ile。彼此视为保守取代的含有氨基酸的其它群组包括：含硫：Met和Cys；酸性：Asp、
Glu、Asn以及Gln；小分子脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro以及Gly；极性带负
电残基以及其酰胺：Asp、Asn、Glu以及Gln；极性带正电残基：His、Arg以及Lys；大分子脂肪
族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val以及Cys；以及大分子芳香族残基：Phe、Tyr以及Trp。额外
信息发现于克赖顿(Creighton)(1984)蛋白质(Proteins),W.H.费里曼公司(W.H.Freeman
and Company)中。
[0027] 本文所披露或所提到的芋螺毒素肽类似物序列的变异体还包括相对于本文所披露或所提到的肽序列具有至少70％的序列一致性、至少80％的序列一致性、至少85％的序
列、至少90％的序列一致性、至少95％的序列一致性、至少96％的序列一致性、至少97％的
序列一致性、至少98％的序列一致性或至少99％的序列一致性的序列。更特定来说，本文所
披露的芋螺毒素肽类似物的变异体包括以下肽，所述肽具有：与SEQ ID NO:1‑37中的任一
者的70％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的80％的序列一致性；与SEQ ID
NO:1‑37中的任一者的81％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的82％的序列一
致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的83％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者
的84％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的85％的序列一致性；与SEQ ID NO:
1‑37中的任一者的86％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的87％的序列一致
性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的88％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的
89％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的90％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑
37中的任一者的91％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的92％的序列一致性；
与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的93％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的94％
的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的95％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中
的任一者的96％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的97％的序列一致性；与SEQ
ID NO:1‑37中的任一者的98％的序列一致性；或与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的99％的序
列一致性。
列、至少90％的序列一致性、至少95％的序列一致性、至少96％的序列一致性、至少97％的
序列一致性、至少98％的序列一致性或至少99％的序列一致性的序列。更特定来说，本文所
披露的芋螺毒素肽类似物的变异体包括以下肽，所述肽具有：与SEQ ID NO:1‑37中的任一
者的70％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的80％的序列一致性；与SEQ ID
NO:1‑37中的任一者的81％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的82％的序列一
致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的83％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者
的84％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的85％的序列一致性；与SEQ ID NO:
1‑37中的任一者的86％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的87％的序列一致
性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的88％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的
89％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的90％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑
37中的任一者的91％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的92％的序列一致性；
与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的93％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的94％
的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的95％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中
的任一者的96％的序列一致性；与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的97％的序列一致性；与SEQ
ID NO:1‑37中的任一者的98％的序列一致性；或与SEQ ID NO:1‑37中的任一者的99％的序
列一致性。
[0028] “序列一致性百分比”指的是通过比较序列判断的两个或两个以上序列之间的关系。所属领域中，“一致性”意思是通过所述序列串之间的匹配判断的肽序列之间的序列相
关程度。“一致性”(通常称为“相似性”)容易通过已知方法计算出，所述方法包括描述于以
下文献的那些方法：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)(莱斯克,A.M.
(Lesk,A.M.)编,)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(NY)(1988)；生物计
算：信息学和基因组工程(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)(史密斯,
D.W.(Smith,D.W.)编,)学术出版社(Academic Press),纽约(1994)；序列数据的计算机分
析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分(Part I)(格里芬,A.M.(Griffin,
A.M.)和格里芬,H.G.编,)胡马纳出版社(Humana Press),纽约(1994)；分子生物学序列分
析(Sequence Analysis in Molecular Biology)(冯海耶,G.(Von Heijne,G.)编,)学术出
版社(1987)；以及序列分析引物(Sequence Analysis Primer)(格里布斯考,M.(Gribskov,
M.)和德弗罗,J.(Devereux,J.)编,)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约
(1992)。判断序列一致性的优选方法经设计以提供测试序列之间的最佳匹配。判断序列一
致性和相似性的方法被整理到公众可用的计算机程序中。序列比对和一致性百分比计算可
使用LASERGENE生物信息计算套件(登斯塔公司(DNASTAR,Inc.),麦迪逊(Madison),威斯康
星州(Wisconsin))的Megalign程序进行。序列的多重比对也可使用Clustal比对方法(希金
斯(Higgins)和夏普卡宾斯(Sharp CABIOS)，5，151‑153(1989))和预设参数(GAP PENALTY
＝10、GAP LENGTH PENALTY＝10)进行。相关程序还包括GCG程序套件(威斯康星套装软件
(Wisconsin Package)9.0版,遗传学计算机集团(Genetics Computer Group，GCG),麦迪
逊,威斯康星州)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志
(J.Mol.Biol.)215:403‑410(1990))；DNASTAR(登斯塔公司,麦迪逊,威斯康星州)；以及并
入史密斯‑沃特曼(Smith‑Waterman)算法的FASTA程序(皮尔森(Pearson),计算机方法染色
体组研究(Comput.Methods Genome Res.),[国际计算机协会(Proc.Int.Symp.)](1994)，
会议日期1992,111‑20,编辑：舒豪伊(Suhai),桑德尔(Sandor)，出版商：普莱南(Plenum),
纽约)。在本发明的上下文中，应了解，在将序列分析软件用于分析时，分析结果为基于所引
用程序的“默认值”。本文所使用的“默认值”意思是任意值或参数组，所述值或参数在首次
初始化时用软件加载。
关程度。“一致性”(通常称为“相似性”)容易通过已知方法计算出，所述方法包括描述于以
下文献的那些方法：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)(莱斯克,A.M.
(Lesk,A.M.)编,)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(NY)(1988)；生物计
算：信息学和基因组工程(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)(史密斯,
D.W.(Smith,D.W.)编,)学术出版社(Academic Press),纽约(1994)；序列数据的计算机分
析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分(Part I)(格里芬,A.M.(Griffin,
A.M.)和格里芬,H.G.编,)胡马纳出版社(Humana Press),纽约(1994)；分子生物学序列分
析(Sequence Analysis in Molecular Biology)(冯海耶,G.(Von Heijne,G.)编,)学术出
版社(1987)；以及序列分析引物(Sequence Analysis Primer)(格里布斯考,M.(Gribskov,
M.)和德弗罗,J.(Devereux,J.)编,)牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约
(1992)。判断序列一致性的优选方法经设计以提供测试序列之间的最佳匹配。判断序列一
致性和相似性的方法被整理到公众可用的计算机程序中。序列比对和一致性百分比计算可
使用LASERGENE生物信息计算套件(登斯塔公司(DNASTAR,Inc.),麦迪逊(Madison),威斯康
星州(Wisconsin))的Megalign程序进行。序列的多重比对也可使用Clustal比对方法(希金
斯(Higgins)和夏普卡宾斯(Sharp CABIOS)，5，151‑153(1989))和预设参数(GAP PENALTY
＝10、GAP LENGTH PENALTY＝10)进行。相关程序还包括GCG程序套件(威斯康星套装软件
(Wisconsin Package)9.0版,遗传学计算机集团(Genetics Computer Group，GCG),麦迪
逊,威斯康星州)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志
(J.Mol.Biol.)215:403‑410(1990))；DNASTAR(登斯塔公司,麦迪逊,威斯康星州)；以及并
入史密斯‑沃特曼(Smith‑Waterman)算法的FASTA程序(皮尔森(Pearson),计算机方法染色
体组研究(Comput.Methods Genome Res.),[国际计算机协会(Proc.Int.Symp.)](1994)，
会议日期1992,111‑20,编辑：舒豪伊(Suhai),桑德尔(Sandor)，出版商：普莱南(Plenum),
纽约)。在本发明的上下文中，应了解，在将序列分析软件用于分析时，分析结果为基于所引
用程序的“默认值”。本文所使用的“默认值”意思是任意值或参数组，所述值或参数在首次
初始化时用软件加载。
[0029] “D‑取代的类似物”包括本文所披露的芋螺毒素肽类似物，所述芋螺毒素肽类似物中又一个L‑氨基酸取代为D‑氨基酸。D‑氨基酸可与在类似物序列中发现的氨基酸为相同氨
基酸类型，或可为不同的氨基酸。相应地，D‑类似物也为变异体。
基酸类型，或可为不同的氨基酸。相应地，D‑类似物也为变异体。
[0030] “修饰物”包括本文所披露的芋螺毒素肽类似物，其中一或多个氨基酸已置换为非氨基酸组份，或其中氨基酸已与官能基结合，或官能基以其它方式与氨基酸关联。经修饰的
氨基酸可为例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化(farnesylated)氨基酸、乙酰
基化氨基酸、生物素标记氨基酸、与脂质部分结合的氨基酸或与有机衍生剂结合的氨基酸。
以下各者中存在经修饰氨基酸的可能有利：例如，(a)延长多肽血清半衰期和/或体内功能
性半衰期，(b)降低多肽抗原性，(c)提高多肽储存稳定性，(d)提高肽溶解度，(e)延长循环
时间和/或(f)提高生物可用性，例如增大曲线下面积(AUCsc)。氨基酸可例如在重组制造期
间经共转译修饰或转译后修饰(例如在哺乳动物细胞中表达期间在N‑X‑S/T基元处经N连接
糖基化)，或通过合成方式改质。经修饰的氨基酸可在序列内，或在序列末端。修饰物可包括
本文其它部分所述的衍生物。
氨基酸可为例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化(farnesylated)氨基酸、乙酰
基化氨基酸、生物素标记氨基酸、与脂质部分结合的氨基酸或与有机衍生剂结合的氨基酸。
以下各者中存在经修饰氨基酸的可能有利：例如，(a)延长多肽血清半衰期和/或体内功能
性半衰期，(b)降低多肽抗原性，(c)提高多肽储存稳定性，(d)提高肽溶解度，(e)延长循环
时间和/或(f)提高生物可用性，例如增大曲线下面积(AUCsc)。氨基酸可例如在重组制造期
间经共转译修饰或转译后修饰(例如在哺乳动物细胞中表达期间在N‑X‑S/T基元处经N连接
糖基化)，或通过合成方式改质。经修饰的氨基酸可在序列内，或在序列末端。修饰物可包括
本文其它部分所述的衍生物。
[0031] 针对芋螺毒素肽的每一者，C‑末端可为羧酸基或酰胺基，优选为羧酸基。本发明还涉及通过以下进一步修饰的芋螺毒素肽类似物：(i)对C‑末端进行添加，例如Tyr、碘‑Tyr、
荧光标签，或(ii)对N‑末端进行添加，例如Tyr、碘‑Tyr、焦谷氨酸盐或荧光标签。
荧光标签，或(ii)对N‑末端进行添加，例如Tyr、碘‑Tyr、焦谷氨酸盐或荧光标签。
[0032] 此外，所属领域的技术人员已知用于改良稳定性的残基或残基的群组可添加到C‑末端和/或N‑末端。同样，所属领域的技术人员已知的用于改良口服可用性的残基或残基的
群组可添加至C‑末端和/或N‑末端。
群组可添加至C‑末端和/或N‑末端。
[0033] 本发明进一步针对所披露的芋螺毒素肽类似物的衍生物。衍生物包括具有非环状排列的芋螺毒素肽类似物，其中环状排列保留天然芋螺毒素肽的天然桥接模式(克雷克
(Craik)等人(2001)，例如环化芋螺毒素肽具有酰胺环化主链，使得芋螺毒素肽不具有游离
N‑末端或C‑末端，其中芋螺毒素肽包括天然二硫键(美国专利第7,312,195号))。在一个实
施例中，环化芋螺毒素肽包括线性芋螺毒素肽和肽连接符，其中线性芋螺毒素肽的N‑末端
和C‑末端通过肽连接符连接以形成酰胺环化肽主链。在一些实施例中，肽连接符包括选自
Gly、Ala以及其组合的氨基酸。
(Craik)等人(2001)，例如环化芋螺毒素肽具有酰胺环化主链，使得芋螺毒素肽不具有游离
N‑末端或C‑末端，其中芋螺毒素肽包括天然二硫键(美国专利第7,312,195号))。在一个实
施例中，环化芋螺毒素肽包括线性芋螺毒素肽和肽连接符，其中线性芋螺毒素肽的N‑末端
和C‑末端通过肽连接符连接以形成酰胺环化肽主链。在一些实施例中，肽连接符包括选自
Gly、Ala以及其组合的氨基酸。
[0034] 各种环化方法可应用于本文所述的芋螺毒素肽类似物。使用丙氨酸桥容易环化本文所述的芋螺毒素肽类似物(克拉克(Clark)等人,2013；克拉克等人,2012)。环化芋螺毒素
肽类似物可改良其口服生物可用性且减少对蛋白水解的易感性，而不影响芋螺毒素肽类似
物对其特定目标的亲和力。
肽类似物可改良其口服生物可用性且减少对蛋白水解的易感性，而不影响芋螺毒素肽类似
物对其特定目标的亲和力。
[0035] 本文所披露的实施例包括本文所述的芋螺毒素肽类似物，以及本文所述的芋螺毒素肽类似物的变异体、D‑取代的类似物、修饰物以及衍生物。在一些实施例中，变异体、D‑取
代的类似物、修饰物以及衍生物具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个序列添加、序列缺失、序列终止位置、取代、置换、
结合、关联或排列。在额外实施例中，Xaa位置可包括于芋螺毒素肽类似物的任何位置中，其
中Xaa代表添加、缺失、终止位置、取代、置换、结合、关联或排列。
代的类似物、修饰物以及衍生物具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个序列添加、序列缺失、序列终止位置、取代、置换、
结合、关联或排列。在额外实施例中，Xaa位置可包括于芋螺毒素肽类似物的任何位置中，其
中Xaa代表添加、缺失、终止位置、取代、置换、结合、关联或排列。
[0036] 本文所披露的各芋螺毒素肽也可包括任何位置处的添加、缺失、终止位置、取代、置换、结合、关联或排列，所述位置包括本文所披露的芋螺毒素肽类似物序列的位置1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。相应地，在特定实施例中，各芋螺毒素肽类
似物中的各氨基酸位置可为Xaa位置，其中Xaa表示在特定位置处的氨基酸的添加、缺失、终
止位置、取代、置换、结合、关联或排列。在特定实施例中，各芋螺毒素肽类似物在位置1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中的一或多者处具有1个、2个、3个、4个、5
个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个Xaa位置。
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。相应地，在特定实施例中，各芋螺毒素肽类
似物中的各氨基酸位置可为Xaa位置，其中Xaa表示在特定位置处的氨基酸的添加、缺失、终
止位置、取代、置换、结合、关联或排列。在特定实施例中，各芋螺毒素肽类似物在位置1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中的一或多者处具有1个、2个、3个、4个、5
个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个Xaa位置。
[0037] 类似物可具有一个以上改变(添加、缺失、终止位置、取代、置换、结合、关联或排列)且成为变异体、D‑取代的类似物、修饰物和/或衍生物中的一或多者。也就是说，包括一
种类别的类似物、变异体、D‑取代的类似物、修饰物和/或衍生物不排除包括其它类别，且在
本文中全部统称为“芋螺毒素肽”。
种类别的类似物、变异体、D‑取代的类似物、修饰物和/或衍生物不排除包括其它类别，且在
本文中全部统称为“芋螺毒素肽”。
[0038] 如所述，本文所披露的芋螺毒素肽阻断nAChR的α9α10亚型。阻断可通过任何有效手段测量。在一个实施例中，阻断经测量为由本文所披露的芋螺毒素肽置换来自nAChR的α9
α10亚型的经标记RgIA。在一个实施例中，阻断可为由本文所披露的芋螺毒素20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％置换来自nAChR的α9α10亚型的经标记
RgIA。在第二实施例中，可通过对本文所披露的芋螺毒素肽进行生物分析来判定与RgIA的
生物分析所得结果相比本文所披露的芋螺毒素肽的治疗活性，从而测量阻断。在一个实施
例中，如通过生物分析所测量，本文所披露的芋螺毒素肽的治疗活性相较于RgIA高20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一第三实施例中，可测量本文所
披露的芋螺毒素肽对nAChR的α9α10亚型的结合亲和力，且与RgIA对nAChR的α9α10亚型的结
合亲和力相比较。在一个实施例中，阻断可为本文所披露的芋螺毒素肽的结合亲和力较
RgIA高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一第四实施例中，通
过测量功能性分析(例如电生理学分析、钙成像分析以及其类似分析)中的作用来分析本文
所披露的芋螺毒素肽对nAChR的α9α10亚型的功能的作用。在一个实施例中，阻断包括通过
功能性分析所测量nAChR的α9α10亚型的功能相较于RgIA降低20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％。
α10亚型的经标记RgIA。在一个实施例中，阻断可为由本文所披露的芋螺毒素20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％置换来自nAChR的α9α10亚型的经标记
RgIA。在第二实施例中，可通过对本文所披露的芋螺毒素肽进行生物分析来判定与RgIA的
生物分析所得结果相比本文所披露的芋螺毒素肽的治疗活性，从而测量阻断。在一个实施
例中，如通过生物分析所测量，本文所披露的芋螺毒素肽的治疗活性相较于RgIA高20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一第三实施例中，可测量本文所
披露的芋螺毒素肽对nAChR的α9α10亚型的结合亲和力，且与RgIA对nAChR的α9α10亚型的结
合亲和力相比较。在一个实施例中，阻断可为本文所披露的芋螺毒素肽的结合亲和力较
RgIA高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一第四实施例中，通
过测量功能性分析(例如电生理学分析、钙成像分析以及其类似分析)中的作用来分析本文
所披露的芋螺毒素肽对nAChR的α9α10亚型的功能的作用。在一个实施例中，阻断包括通过
功能性分析所测量nAChR的α9α10亚型的功能相较于RgIA降低20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％。
[0039] 芋螺毒素肽可使用重组DNA技术制备。芋螺毒素肽还可使用Merrifield固相合成制备，但也可使用所属领域中已知的其它等效化学合成法。通过将经保护的α‑氨基酸偶合
到适合树脂而从芋螺毒素肽的C‑末端开始固相合成。可通过用酯键联将α‑氨基保护的氨基
酸连接至氯甲基化树脂或羟甲基树脂，或用酰胺键将α‑氨基保护的氨基酸连接到二苯甲胺
(BHA)树脂或对甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂来制备所述起始物质。羟甲基树脂的制备由博
丹斯基(Bodansky)等人(1966)描述。氯甲基化树脂可自伯乐实验室(Bio Rad
Laboratories)(里士满(Richmond),加利福尼亚(Calif.))和自来博系统公司
(Lab.Systems,Inc.)处购得。所述树脂的制备由斯图尔特(Stewart)和杨(Young)(1969)描
述。BHA树脂和MBHA树脂支撑物市场有售，且通常当正在合成的所需芋螺毒素肽在C‑末端具
有未经取代的酰胺时使用。因此，固体树脂支撑物可为所属领域中已知的彼等固体树脂支
撑物中的任一者，例如具有化学式‑O‑CH2‑树脂支撑物、‑NH BHA树脂支撑物或‑NH‑MBHA树
脂支撑物者。当需要未经取代的酰胺时，BHA树脂或MBHA树脂的使用可能有利，因为裂解直
接获得酰胺。在需要N‑甲基酰胺的情况下，N‑甲基酰胺可由N‑甲基BHA树脂产生。如果需要
其它经取代的酰胺，那么可使用美国专利第4,569,967号的教示；或如果C‑末端处需要除游
离酸外的其它基团，那么优选可使用如霍本‑魏尔主题(Houben‑Weyl text)(1974)中所阐
述的经典方法合成芋螺毒素肽。
到适合树脂而从芋螺毒素肽的C‑末端开始固相合成。可通过用酯键联将α‑氨基保护的氨基
酸连接至氯甲基化树脂或羟甲基树脂，或用酰胺键将α‑氨基保护的氨基酸连接到二苯甲胺
(BHA)树脂或对甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂来制备所述起始物质。羟甲基树脂的制备由博
丹斯基(Bodansky)等人(1966)描述。氯甲基化树脂可自伯乐实验室(Bio Rad
Laboratories)(里士满(Richmond),加利福尼亚(Calif.))和自来博系统公司
(Lab.Systems,Inc.)处购得。所述树脂的制备由斯图尔特(Stewart)和杨(Young)(1969)描
述。BHA树脂和MBHA树脂支撑物市场有售，且通常当正在合成的所需芋螺毒素肽在C‑末端具
有未经取代的酰胺时使用。因此，固体树脂支撑物可为所属领域中已知的彼等固体树脂支
撑物中的任一者，例如具有化学式‑O‑CH2‑树脂支撑物、‑NH BHA树脂支撑物或‑NH‑MBHA树
脂支撑物者。当需要未经取代的酰胺时，BHA树脂或MBHA树脂的使用可能有利，因为裂解直
接获得酰胺。在需要N‑甲基酰胺的情况下，N‑甲基酰胺可由N‑甲基BHA树脂产生。如果需要
其它经取代的酰胺，那么可使用美国专利第4,569,967号的教示；或如果C‑末端处需要除游
离酸外的其它基团，那么优选可使用如霍本‑魏尔主题(Houben‑Weyl text)(1974)中所阐
述的经典方法合成芋螺毒素肽。
[0040] 当合成在C‑末端具有游离酸的芋螺毒素肽时，适当时，可根据霍里克(Horiki)等人(1978)所述的程序，在约60℃下在搅拌下使用含KF的二甲基甲酰胺(DMF)持续24小时，首
先将由Boc或Fmoc以及侧链保护基保护的C‑端氨基酸偶合到氯甲基化树脂。在BOC保护的氨
基酸偶合至树脂支撑物后，可通过使用含三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷或单独的TFA去除α‑氨
基保护基。可在0℃到室温的温度下脱除保护基。如施罗德(Schroder)和吕布克(Lubke)
(1965)所描述，可使用用于去除特定α‑氨基保护基的其它标准裂解剂(例如含HCl的二噁
烷)和条件。
先将由Boc或Fmoc以及侧链保护基保护的C‑端氨基酸偶合到氯甲基化树脂。在BOC保护的氨
基酸偶合至树脂支撑物后，可通过使用含三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷或单独的TFA去除α‑氨
基保护基。可在0℃到室温的温度下脱除保护基。如施罗德(Schroder)和吕布克(Lubke)
(1965)所描述，可使用用于去除特定α‑氨基保护基的其它标准裂解剂(例如含HCl的二噁
烷)和条件。
[0041] 去除α‑氨基保护基之后，剩余α‑氨基保护和侧链保护的氨基酸可按所需顺序逐步偶合以获得中间化合物，或者在合成中各别地添加各氨基酸，其中一些氨基酸可在添加到
固相反应器之前彼此偶合。适当偶合剂的选择在所属领域的技术范围内。示范性偶合剂包
括N,N'‑二环己基碳化二亚氨(存在HoBt或HoAt的情况下的DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU)。
固相反应器之前彼此偶合。适当偶合剂的选择在所属领域的技术范围内。示范性偶合剂包
括N,N'‑二环己基碳化二亚氨(存在HoBt或HoAt的情况下的DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU)。
[0042] 用于肽(包括芋螺毒素肽)的固相合成中的活化剂为所属领域中所熟知的。适合活化剂的实例包括碳化二亚氨，例如N,N'‑二异丙基碳化二亚氨和N‑乙基‑N'‑(3‑二甲氨丙
基)碳化二亚氨。其它活化剂以及其在肽偶合中的用途由施罗德和吕布克(1965)以及卡普
尔(Kapoor)(1970)描述。
基)碳化二亚氨。其它活化剂以及其在肽偶合中的用途由施罗德和吕布克(1965)以及卡普
尔(Kapoor)(1970)描述。
[0043] 各经保护的氨基酸或氨基酸序列可双倍或双倍以上过量引入固相反应器中，且偶合可在DMF:CH2Cl2(1:1)的介质中或在单独DMF或CH2Cl2中进行。在发生中间偶合的情况
下，在下一氨基酸偶合之前，可重复偶合程序随后去除α‑氨基保护基。如凯撒(Kaiser)等人
(1970)所述，若手动进行，则可通过宁海准反应(ninhydrin reaction)监测合成的各阶段
中偶合反应的成功。通过使用例如里维耶(Rivier)等人(1978)所报告的程序，可在如贝克
曼(Beckman)990自动合成仪中自动进行偶合反应。
下，在下一氨基酸偶合之前，可重复偶合程序随后去除α‑氨基保护基。如凯撒(Kaiser)等人
(1970)所述，若手动进行，则可通过宁海准反应(ninhydrin reaction)监测合成的各阶段
中偶合反应的成功。通过使用例如里维耶(Rivier)等人(1978)所报告的程序，可在如贝克
曼(Beckman)990自动合成仪中自动进行偶合反应。
[0044] 所需氨基酸序列完成后，可通过使用例如液态氟化氢或TFA(若使用Fmoc化学)的试剂处理从树脂支撑物去除中间肽，所述试剂不仅使肽自树脂裂解，而且还裂解所有剩余
的侧链保护基，且如果中间肽先前未经去除以获得游离酸形式的肽，那么在N‑末端处裂解
α‑氨基保护基。如果序列中存在Met，那么在使用HF将肽从树脂裂解以消除潜在S‑烷基化作
用之前，可首先使用TFA/乙二硫醇去除Boc保护基。在使用氟化氢或TFA进行裂解时，反应容
器中可包括一或多种清除剂，例如苯甲醚、甲酚、甲硫醚以及甲基乙基硫醚。
的侧链保护基，且如果中间肽先前未经去除以获得游离酸形式的肽，那么在N‑末端处裂解
α‑氨基保护基。如果序列中存在Met，那么在使用HF将肽从树脂裂解以消除潜在S‑烷基化作
用之前，可首先使用TFA/乙二硫醇去除Boc保护基。在使用氟化氢或TFA进行裂解时，反应容
器中可包括一或多种清除剂，例如苯甲醚、甲酚、甲硫醚以及甲基乙基硫醚。
[0045] 与环化作为肽‑树脂的一部分的芋螺毒素肽相对，线性芋螺毒素肽的环化可能受影响，以在Cys残基之间形成键。如所属领域中众所周知，为实现所述二硫化物环化键联，可
通过氨解作用自羟甲基化树脂或氯甲基化树脂支撑物裂解经充分保护的芋螺毒素肽，以产
生经充分保护的酰胺中间物，其随后经适当环化且脱除保护基。或者，可在0℃下用氢氟酸
(HF)或TFA脱除保护基以及从上述树脂或二苯甲胺(BHA)树脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)裂
解芋螺毒素肽，随后如上文所述氧化。
通过氨解作用自羟甲基化树脂或氯甲基化树脂支撑物裂解经充分保护的芋螺毒素肽，以产
生经充分保护的酰胺中间物，其随后经适当环化且脱除保护基。或者，可在0℃下用氢氟酸
(HF)或TFA脱除保护基以及从上述树脂或二苯甲胺(BHA)树脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)裂
解芋螺毒素肽，随后如上文所述氧化。
[0046] 芋螺毒素肽还可使用自动合成仪合成。在这些实施例中，可从C‑末端开始，使用Advanced Chemtech 357肽自动合成仪将氨基酸依序偶合到MBHA Rink树脂(通常为100mg
的树脂)。使用含1,3‑二异丙基碳化二亚氨的N‑甲基吡咯啶酮(NMP)或通过六氟磷酸2‑(1H‑
苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基 (HBTU)和二乙基异丙基乙基胺(DIEA)进行偶合。可通
过使用哌啶于二甲基甲酰胺(DMF)中的20％溶液处理去除Fmoc保护基。随后，使用DMF(两
次)，接着用甲醇和NMP洗涤树脂。
的树脂)。使用含1,3‑二异丙基碳化二亚氨的N‑甲基吡咯啶酮(NMP)或通过六氟磷酸2‑(1H‑
苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基 (HBTU)和二乙基异丙基乙基胺(DIEA)进行偶合。可通
过使用哌啶于二甲基甲酰胺(DMF)中的20％溶液处理去除Fmoc保护基。随后，使用DMF(两
次)，接着用甲醇和NMP洗涤树脂。
[0047] II.使用方法
[0048] A.治疗方法
[0049] 本发明的芋螺毒素肽适用于治疗与受试者中烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9α10受体亚型相关的病况的方法中。所述方法包括向有此需要的受试者投予治疗有效量的所
披露的芋螺毒素肽或其药学上可接受的盐，其中所述披露的芋螺毒素肽阻断nAChR的α9α10
亚型。
披露的芋螺毒素肽或其药学上可接受的盐，其中所述披露的芋螺毒素肽阻断nAChR的α9α10
亚型。
[0050] 已在本文中使用表达nAChR的不同亚型的卵母细胞的研究(艾里森等人,2006；文克拉(Vincler)等人,2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616；US 2012/0220539)中显示
某些α‑芋螺毒素(包括RgIA等)阻断nAChR的α9α10亚型的活性。α‑芋螺毒素(包括RgIA)作为
镇痛剂和止痛剂的活性已展示于慢性压迫性损伤的研究中(文克拉等人,2006；WO 2008/
011006；US 2009/0203616)。α‑芋螺毒素(包括RgIA)关于抑制免疫细胞的迁移的活性已展
示于慢性压迫性损伤的研究中(文克拉等人,2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616)。
某些α‑芋螺毒素(包括RgIA等)阻断nAChR的α9α10亚型的活性。α‑芋螺毒素(包括RgIA)作为
镇痛剂和止痛剂的活性已展示于慢性压迫性损伤的研究中(文克拉等人,2006；WO 2008/
011006；US 2009/0203616)。α‑芋螺毒素(包括RgIA)关于抑制免疫细胞的迁移的活性已展
示于慢性压迫性损伤的研究中(文克拉等人,2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616)。
[0051] 阻断nAChR的α9α10亚型的芋螺毒素肽适用于治疗疼痛、治疗炎症和/或炎症性病况以及适用于治疗癌症。在某些实施例中，芋螺毒素肽的有效性是基于其抑制免疫细胞迁
移的能力。在其它实施例中，化合物的有效性是基于其减缓脱髓鞘作用和/或增加完整神经
纤维的数目的能力。
移的能力。在其它实施例中，化合物的有效性是基于其减缓脱髓鞘作用和/或增加完整神经
纤维的数目的能力。
[0052] 可治疗的示范性疼痛类型包括一般疼痛、慢性疼痛、神经痛、伤害性疼痛以及炎症性疼痛。此外，这些疼痛类型可与以下原因相关和/或由以下原因引发，所述原因包括：末梢
神经或疼痛感受器损伤、炎症性病症、代谢失调、病毒感染、癌症、化学治疗剂引发的疼痛、
外科手术后引发的疼痛以及由烧伤或其它身体组织损伤引发的疼痛。
神经或疼痛感受器损伤、炎症性病症、代谢失调、病毒感染、癌症、化学治疗剂引发的疼痛、
外科手术后引发的疼痛以及由烧伤或其它身体组织损伤引发的疼痛。
[0053] 可治疗的示范性炎症性病况包括炎症、慢性炎症、风湿性炎症(包括关节炎、狼疮、僵直性脊椎炎、纤维肌痛、肌腱炎、滑囊炎、硬皮病和痛风)、败血症、纤维肌痛、炎症性肠病
(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease))、类肉瘤病、子宫内膜异位、子宫肌
瘤、炎症性皮肤病(包括牛皮癣和伤口愈合不良)、肺炎症性病况(包括哮喘和慢性阻塞性肺
病)、与神经系统的炎症相关的疾病(包括帕金森氏病(Parkinson's Disease)和阿兹海默
氏病(Alzheimer's Disease))、牙周病和心血管疾病。
(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease))、类肉瘤病、子宫内膜异位、子宫肌
瘤、炎症性皮肤病(包括牛皮癣和伤口愈合不良)、肺炎症性病况(包括哮喘和慢性阻塞性肺
病)、与神经系统的炎症相关的疾病(包括帕金森氏病(Parkinson's Disease)和阿兹海默
氏病(Alzheimer's Disease))、牙周病和心血管疾病。
[0054] 可治疗的示范性癌症包括乳癌。α9‑nAChR在人类乳房肿瘤组织中过度表达(李等人,2010(a))且siRNA或其它机制所致的受体抑制在体外和体内乳癌细胞致癌特性中减少，
包括癌细胞增殖的抑制(陈(Chen)等人,2011)。在某些实施例中，RgIA类似物以治疗量使
用，以便通过抑制α9‑nAChR来抑制肿瘤生长。
包括癌细胞增殖的抑制(陈(Chen)等人,2011)。在某些实施例中，RgIA类似物以治疗量使
用，以便通过抑制α9‑nAChR来抑制肿瘤生长。
[0055] 本文所披露的方法包括使用本文所披露的芋螺毒素肽(包括其药学上可接受的盐和前药)治疗受试者(人类、兽医动物(犬、猫、爬行动物、鸟等)、家畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)
以及研究用动物(猴子、大鼠、小鼠、鱼等))。治疗受试者包括传递治疗有效量的所披露的芋
螺毒素肽。治疗有效量包括提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的量。
以及研究用动物(猴子、大鼠、小鼠、鱼等))。治疗受试者包括传递治疗有效量的所披露的芋
螺毒素肽。治疗有效量包括提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的量。
[0056] “有效量”为导致受试者体内所需生理学变化所必需的芋螺毒素肽的量。有效量通常出于研究目的投予。在预期研究芋螺毒素肽于疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的治疗
中的有效性的研究分析中，本文所披露的有效量导致所需的生理学变化。
中的有效性的研究分析中，本文所披露的有效量导致所需的生理学变化。
[0057] “预防性治疗”包括对未显示疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的迹象或症状，或仅显示疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的早期迹象或症状的受试者投予的治疗，使得投
予治疗以减弱、防止或减少疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症进一步发展的风险。因此，预
防性治疗起到对疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的预防性治疗的作用。
予治疗以减弱、防止或减少疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症进一步发展的风险。因此，预
防性治疗起到对疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的预防性治疗的作用。
[0058] “治疗性治疗”包括对显示疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的症状或迹象的受试者投予的处理，且向受试者投予所述处理以减弱或消除疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症
的那些迹象或症状。治疗性治疗可减轻、控制或消除疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的存
在或活性，和/或减轻、控制或消除疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的副作用。
的那些迹象或症状。治疗性治疗可减轻、控制或消除疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的存
在或活性，和/或减轻、控制或消除疼痛、炎症性病况、炎症和/或癌症的副作用。
[0059] 治疗化学疗法引发的神经痛(CINP)的治疗有效量可包括减少机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛、热(热引发的)痛觉过敏、热(冷引发的)异常疼痛、迁移免疫细胞的数目、炎
症性介体的含量和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
症性介体的含量和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
[0060] 治疗烧伤引发的神经痛的治疗有效量可包括减少机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛、热(热引发的)痛觉过敏、热(冷引发的)异常疼痛、迁移免疫细胞的数目、炎症性介体的
含量和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
含量和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
[0061] 治疗术后神经痛的治疗有效量可包括减少机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛、热(热引发的)痛觉过敏、热(冷引发的)异常疼痛、迁移免疫细胞的数目、炎症性介体的含量
和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
和/或受试者报告的主观疼痛程度的量。
[0062] 治疗炎症性病症的治疗有效量可包括减少基因表达或蛋白质层面上的炎症性标记的量，和/或减少迁移免疫细胞的数目的量。此外，可通过治疗有效量治疗与炎症性病症
相关的疼痛，此导致机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛、热(热引发的)痛觉过敏、热(冷引发
的)异常疼痛和/或受试者报告的主观疼痛程度减少。
相关的疼痛，此导致机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛、热(热引发的)痛觉过敏、热(冷引发
的)异常疼痛和/或受试者报告的主观疼痛程度减少。
[0063] 治疗例如乳癌的癌症的治疗有效量可包括减少肿瘤细胞的数目、减少转移的数目、减小肿瘤体积、增加预期寿命、诱发癌细胞的细胞凋亡、诱发癌细胞死亡、诱发癌细胞的
化疗敏感性或辐射敏感性、抑制癌细胞附近的血管生成、抑制癌细胞增殖细胞、抑制肿瘤生
长细胞、防止转移、延长受试者寿命、减轻癌症相关的疼痛和/或减少治疗后受试者的癌症
复发或再次发生的量。
化疗敏感性或辐射敏感性、抑制癌细胞附近的血管生成、抑制癌细胞增殖细胞、抑制肿瘤生
长细胞、防止转移、延长受试者寿命、减轻癌症相关的疼痛和/或减少治疗后受试者的癌症
复发或再次发生的量。
[0064] 对于投予，治疗有效量(本文中也称为剂量)最初可基于体外分析和/或动物模型研究的结果估算。举例来说，可在动物模型中配制剂量以实现包括IC50的循环浓度范围，如
在针对特定目标的细胞培养物中所判断。所述信息可用于更精确判断对相关受试者的适用
剂量。
在针对特定目标的细胞培养物中所判断。所述信息可用于更精确判断对相关受试者的适用
剂量。
[0065] 向特定受试者投予的作为治疗有效量的实际量可由医师、兽医或研究人员考虑例如以下的参数而判断：身体因素和生理学因素，包括目标、体重、病况严重程度、疼痛类型、
炎症性病况类型或癌症类型、前期或同步治疗性干预、受试者的特发症以及投予途径。
炎症性病况类型或癌症类型、前期或同步治疗性干预、受试者的特发症以及投予途径。
[0066] 可适当调整剂量以达成所需的局部或全身芋螺毒素肽含量。典型地，本发明的芋螺毒素肽在0.001mg/kg到250mg/kg芋螺毒素肽，优选地在0.01mg/kg到100mg/kg芋螺毒素
肽，更优选在0.05mg/kg到75mg/kg芋螺毒素肽剂量范围内显示其作用。适合剂量可以每天
多个子剂量投予。通常，剂量或子剂量可在每单位剂型中含有0.1mg到500mg芋螺毒素肽。更
优选的剂量将含有每单位剂型中0.5mg到100mg芋螺毒素肽。
肽，更优选在0.05mg/kg到75mg/kg芋螺毒素肽剂量范围内显示其作用。适合剂量可以每天
多个子剂量投予。通常，剂量或子剂量可在每单位剂型中含有0.1mg到500mg芋螺毒素肽。更
优选的剂量将含有每单位剂型中0.5mg到100mg芋螺毒素肽。
[0067] 额外适用剂量通常可在0.1μg/kg到5μg/kg或0.5μg/kg到1μg/kg的范围内。在其它实例中，剂量可包括1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/
kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85
μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、
450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μ
g/kg、900μg/kg、950μg/kg、1000μg/kg、0.1mg/kg到5mg/kg或0.5mg/kg到1mg/kg。在其它实
例中，剂量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、
40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/
kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、
450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、
850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg或1000mg/kg以上。
kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85
μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、
450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μ
g/kg、900μg/kg、950μg/kg、1000μg/kg、0.1mg/kg到5mg/kg或0.5mg/kg到1mg/kg。在其它实
例中，剂量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、
40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/
kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、
450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、
850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg或1000mg/kg以上。
[0068] 在特定实施例中，剂量可以较低程度起始且增加直到达到所需效果。在受试者在所述剂量下的反应不足的情况下，可在受试者耐受性允许的程序内使用甚至较高的剂量
(或通过不同且更局部的传递途径的较高有效剂量)。预期例如24小时连续给药或每天多次
给药达到芋螺毒素肽的适当全身含量。
(或通过不同且更局部的传递途径的较高有效剂量)。预期例如24小时连续给药或每天多次
给药达到芋螺毒素肽的适当全身含量。
[0069] 可通过在治疗方案的过程期间(例如每天、每两天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每两周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、
每9个月、每10个月、每11个月或每年)投予单个或多个剂量达到治疗有效量。
每9个月、每10个月、每11个月或每年)投予单个或多个剂量达到治疗有效量。
[0070] 可使用多种投予途径。所选特定模式可视所传递的特定芋螺毒素肽，所治疗的疼痛、炎症性病况或癌症的严重程度，以及提供治疗有效量所要的剂量而定。可使用医学上可
接受的任何投予模式，意思是根据可靠的医学判断，提供治疗有效量的芋螺毒素肽且不引
起临床上不可接受的副作用超过投予益处的任何方式。示范性投予途径包括静脉内投予、
皮内投予、动脉内投予、肠内投予、鼻内投予、结节内投予、淋巴内投予、腹膜内投予、病灶内
投予、前列腺内投予、阴道内投予、直肠内投予、局部投予、鞘内投予、瘤内投予、肌肉内投
予、囊泡内投予、口服投予、皮下投予和/或舌下投予，且更特定地通过静脉内注射、皮内注
射、动脉内注射、肠内注射、鼻内注射、结节内注射、淋巴内注射、腹膜内注射、病灶内注射、
前列腺内注射、阴道内注射、直肠内注射、局部注射、鞘内注射、瘤内注射、肌肉内注射、囊泡
内注射、口服注入、皮下注射和/或舌下注射。
接受的任何投予模式，意思是根据可靠的医学判断，提供治疗有效量的芋螺毒素肽且不引
起临床上不可接受的副作用超过投予益处的任何方式。示范性投予途径包括静脉内投予、
皮内投予、动脉内投予、肠内投予、鼻内投予、结节内投予、淋巴内投予、腹膜内投予、病灶内
投予、前列腺内投予、阴道内投予、直肠内投予、局部投予、鞘内投予、瘤内投予、肌肉内投
予、囊泡内投予、口服投予、皮下投予和/或舌下投予，且更特定地通过静脉内注射、皮内注
射、动脉内注射、肠内注射、鼻内注射、结节内注射、淋巴内注射、腹膜内注射、病灶内注射、
前列腺内注射、阴道内注射、直肠内注射、局部注射、鞘内注射、瘤内注射、肌肉内注射、囊泡
内注射、口服注入、皮下注射和/或舌下注射。
[0071] 在一个实施例中，芋螺毒素肽直接传递到中枢神经系统(CNS)，优选传递到脑室、脑实质、鞘内空间或其它适合CNS位置。
[0072] 或者，目标疗法可用于通过使用靶向系统(例如抗体或细胞特异性配体)将芋螺毒素肽更特异性地传递到特定类型的细胞。
[0073] 芋螺毒素肽还可经在基于细胞的传递系统中投予，其中编码芋螺毒素肽的DNA序列引入到经设计以植入受试者体内的细胞中。在特定实施例中，这一传递方法可用于脊髓
区域。适合传递系统描述于美国专利第5,550,050号和公开的PCT申请案第WO 92/19195号、
第WO 94/25503号、第WO 95/01203号、第WO 95/05452号、第WO 96/02286号、第WO 96/02646
号、第WO 96/40871号、第WO 96/40959号以及第WO 97/12635号中。
区域。适合传递系统描述于美国专利第5,550,050号和公开的PCT申请案第WO 92/19195号、
第WO 94/25503号、第WO 95/01203号、第WO 95/05452号、第WO 96/02286号、第WO 96/02646
号、第WO 96/40871号、第WO 96/40959号以及第WO 97/12635号中。
[0074] 各芋螺毒素肽的适合DNA序列可基于所披露的序列和已知遗传编码以合成方式制备。简单来说，术语“基因”指的是编码芋螺毒素肽的核酸序列。这一定义包括多种序列多形
现象、突变和/或序列变异体，其中所述改变不影响所编码的芋螺毒素肽的功能。术语“基
因”不仅可包括编码序列，而且还包括调节区(例如启动子、增强子)和终止区。所述术语进
一步可包括所有内含子和从mRNA转录剪接的其它DNA序列，以及因替代剪接位点所导致的
变异体。编码芋螺毒素肽的核酸序列可为引导芋螺毒素肽的表达的DNA或RNA。这些核酸序
列可为经转录到RNA中的DNA股序列或转译成蛋白质的RNA序列。核酸序列同时包括全长核
酸序列以及源自全长蛋白质的非全长序列。序列还可包括可引入以在特定细胞类型中提供
密码子偏好的天然序列的简并密码子。本文所披露的编码芋螺毒素肽的基因序列可在可公
开获得的数据库和出版物中获得。
现象、突变和/或序列变异体，其中所述改变不影响所编码的芋螺毒素肽的功能。术语“基
因”不仅可包括编码序列，而且还包括调节区(例如启动子、增强子)和终止区。所述术语进
一步可包括所有内含子和从mRNA转录剪接的其它DNA序列，以及因替代剪接位点所导致的
变异体。编码芋螺毒素肽的核酸序列可为引导芋螺毒素肽的表达的DNA或RNA。这些核酸序
列可为经转录到RNA中的DNA股序列或转译成蛋白质的RNA序列。核酸序列同时包括全长核
酸序列以及源自全长蛋白质的非全长序列。序列还可包括可引入以在特定细胞类型中提供
密码子偏好的天然序列的简并密码子。本文所披露的编码芋螺毒素肽的基因序列可在可公
开获得的数据库和出版物中获得。
[0075] 在一些实施例中，聚核苷酸包括质体、cDNA或mRNA，其可包括例如表达芋螺毒素肽的序列(例如基因)。适合质体包括可用于将基因转移到细胞的标准质体载剂和微环质体。
聚核苷酸(例如微环质体)可进一步包括任何额外序列信息以促进遗传物质(例如编码芋螺
毒素肽的序列)向细胞的转移。举例来说，聚核苷酸可包括启动子，例如一般启动子、组织特
异性启动子、细胞特异性激活子和/或对核或细胞质特异的启动子。启动子和质体(例如微
环质体)通常为所属领域中众所周知的，且可使用常规技术制备。如本文进一步描述，聚核
苷酸可用于转染细胞。除非另作规定，否则术语转染(transfect、transfected或
transfecting)可用于指示细胞中外源聚核苷酸或由其表达的多肽的存在。如所属领域中
所已知，已知许多载剂能够介导基因向细胞的转移。
聚核苷酸(例如微环质体)可进一步包括任何额外序列信息以促进遗传物质(例如编码芋螺
毒素肽的序列)向细胞的转移。举例来说，聚核苷酸可包括启动子，例如一般启动子、组织特
异性启动子、细胞特异性激活子和/或对核或细胞质特异的启动子。启动子和质体(例如微
环质体)通常为所属领域中众所周知的，且可使用常规技术制备。如本文进一步描述，聚核
苷酸可用于转染细胞。除非另作规定，否则术语转染(transfect、transfected或
transfecting)可用于指示细胞中外源聚核苷酸或由其表达的多肽的存在。如所属领域中
所已知，已知许多载剂能够介导基因向细胞的转移。
[0076] B.识别候选药物的方法
[0077] 本文所披露的芋螺毒素肽还适用于识别用以治疗与nAChR的α9α10亚型相关的病况的候选药物的方法中。这些方法包括根据候选药物阻断nAChR的α9α10亚型活性的能力筛
选候选药物。
选候选药物。
[0078] “候选药物”指的是可阻断或干扰目标(即α9α10亚型)的活性的任何肽、蛋白质(包括抗体或抗体片段)或化合物(小分子或其它)。小分子可属于怀疑与蛋白质复合物相互作
用且预期为医药学上可接受的任何化学类别。候选药物可发现于自然界，由组合化学方法
合成和/或经合理药物设计形成。
用且预期为医药学上可接受的任何化学类别。候选药物可发现于自然界，由组合化学方法
合成和/或经合理药物设计形成。
[0079] 可如本文其它处所述测量阻断，但候选药物可与本文所披露的芋螺毒素肽而非RgIA对比或除RgIA之外与本文所披露的芋螺毒素肽对比。芋螺毒素肽适用于识别模拟芋螺
毒素肽的治疗活性的候选药物的方法中。所述方法包括以下步骤：(a)对候选药物进行生物
分析以判定其治疗活性；和(b)将从候选药物的生物分析所得结果与从本文所披露的芋螺
毒素肽的生物分析所得结果对比。
毒素肽的治疗活性的候选药物的方法中。所述方法包括以下步骤：(a)对候选药物进行生物
分析以判定其治疗活性；和(b)将从候选药物的生物分析所得结果与从本文所披露的芋螺
毒素肽的生物分析所得结果对比。
[0080] 候选药物还可通过与聚核苷酸(例如DNA和/或RNA)和/或酶相互作用来干扰α9α10亚型的活性。所述候选药物可为已知或潜在DNA修饰剂，包括DNA损伤剂(例如干扰核酸结构
的嵌入剂)、DNA弯曲剂、错配结合蛋白和/或烷基化剂。
的嵌入剂)、DNA弯曲剂、错配结合蛋白和/或烷基化剂。
[0081] 合理药物设计的一个目标为识别候选药物，所述候选药物例如为芋螺毒素肽的更具活性或更稳定的形式，或例如提高或干扰体内肽功能。用于合理药物设计的若干方法包
括三维结构分析、丙氨酸扫描、分子建模以及抗id抗体的使用。所述技术可包括提供界定由
芋螺毒素肽和nAChR的α9α10亚型形成的蛋白质复合物的三维结构的原子配位，以及基于所
述原子配位设计或选择能够干扰芋螺毒素肽与nAChR的α9α10亚型之间的相互作用的候选
药物。
括三维结构分析、丙氨酸扫描、分子建模以及抗id抗体的使用。所述技术可包括提供界定由
芋螺毒素肽和nAChR的α9α10亚型形成的蛋白质复合物的三维结构的原子配位，以及基于所
述原子配位设计或选择能够干扰芋螺毒素肽与nAChR的α9α10亚型之间的相互作用的候选
药物。
[0082] 模拟或改良芋螺毒素肽的作用的候选药物设计为基于“前导”芋螺毒素肽开发药物的已知方法。在特定芋螺毒素肽的合成为困难或昂贵的情况下，或在不适于特定投予方
法(例如将纯肽用作为口服组合物的活性剂可能具有挑战性，因为纯肽容易被消化道中的
蛋白酶快速降解)的情况下，这一方法可为合意的。模拟设计、合成以及测试也用于避免针
对目标特性随机筛选大量分子。
法(例如将纯肽用作为口服组合物的活性剂可能具有挑战性，因为纯肽容易被消化道中的
蛋白酶快速降解)的情况下，这一方法可为合意的。模拟设计、合成以及测试也用于避免针
对目标特性随机筛选大量分子。
[0083] 一旦选择候选药物用于进一步研究或开发，那么可使用来自一定范围来源的数据(例如光谱技术、x‑射线绕射数据以及NMR)，根据候选药物的物理特性(例如立体化学、结
合、大小和/或电荷)对候选药物的结构建模。计算分析、相似度映射(其模拟候选药物的电
荷和/或体积，而非原子间的键结)和其它技术可用于此建模过程。
合、大小和/或电荷)对候选药物的结构建模。计算分析、相似度映射(其模拟候选药物的电
荷和/或体积，而非原子间的键结)和其它技术可用于此建模过程。
[0084] 当选择候选药物时，可评估其它化学基团的连接。可选择化学基团，以使候选药物容易合成、可能药理学上可接受且不在体内降解，在一些实施例中，保留或提高前导芋螺毒
素肽的生物活性。或者，在候选药物基于肽的情况下，可通过将肽环化实现较高稳定性，增
加肽的刚性。连接有化学基团的候选药物可经进一步筛选以确保候选药物保留目标特性。
随后可进行进一步优化或修饰，以得到一或多个最终候选药物用于体内或临床测试。
素肽的生物活性。或者，在候选药物基于肽的情况下，可通过将肽环化实现较高稳定性，增
加肽的刚性。连接有化学基团的候选药物可经进一步筛选以确保候选药物保留目标特性。
随后可进行进一步优化或修饰，以得到一或多个最终候选药物用于体内或临床测试。
[0085] 候选药物的选择和优化之后，所选择和优化的候选药物可制造和/或用于医药组合物中以向受试者投予。
[0086] III.医药组合物
[0087] 芋螺毒素肽可配制于医药组合物中。“医药组合物”意思是适用于医学投予的物理离散相干单元。“单位剂型的医药组合物”意思是适用于医学投予的物理离散相干单元，各
单元含有治疗有效量，或治疗有效量的倍数(高达四倍)或分数(低至四十分之一)的芋螺毒
素肽与药学上可接受的载剂。医药组合物是否含有每日剂量、或例如每日剂量的一半、三分
之一或四分之一，将视所述医药组合物分别是每天一次、例如两次、三次或四次投予而定。
单元含有治疗有效量，或治疗有效量的倍数(高达四倍)或分数(低至四十分之一)的芋螺毒
素肽与药学上可接受的载剂。医药组合物是否含有每日剂量、或例如每日剂量的一半、三分
之一或四分之一，将视所述医药组合物分别是每天一次、例如两次、三次或四次投予而定。
[0088] 医药组合物中芋螺毒素肽的量和浓度以及医药组合物的量可基于临床相关因素、医药组合物中芋螺毒素肽的溶解度、芋螺毒素肽的效能和活性以及医药组合物的投予方式
而选择。仅需使芋螺毒素肽构成治疗有效量，也就是使得适合有效剂量将与单个或多个单
位剂量所使用的剂型一致。
而选择。仅需使芋螺毒素肽构成治疗有效量，也就是使得适合有效剂量将与单个或多个单
位剂量所使用的剂型一致。
[0089] 医药组合物通常将含有以全部组合物的重量计0.0001‑99重量％，优选为0.001‑50重量％，更佳为0.01‑10重量％芋螺毒素肽。除芋螺毒素肽之外，医药组合物还可含有其
它药物或试剂。其它药物或试剂的实例包括临床医学的所有主要领域中的镇痛剂、细胞激
素和治疗剂。当与其它药物或试剂一同使用时，芋螺毒素肽可以药物混合剂的形式传递。混
合剂为芋螺毒素肽中的任一者与另一药物或试剂的混合物。在这一实施例中，常见投予媒
剂(例如丸剂、片剂、植入物、泵、可注射溶液等)将含有芋螺毒素肽与其它药物或试剂的组
合。混合剂的个别组分可各自以治疗有效量投予，或其投予的组合可产生治疗有效量。
它药物或试剂。其它药物或试剂的实例包括临床医学的所有主要领域中的镇痛剂、细胞激
素和治疗剂。当与其它药物或试剂一同使用时，芋螺毒素肽可以药物混合剂的形式传递。混
合剂为芋螺毒素肽中的任一者与另一药物或试剂的混合物。在这一实施例中，常见投予媒
剂(例如丸剂、片剂、植入物、泵、可注射溶液等)将含有芋螺毒素肽与其它药物或试剂的组
合。混合剂的个别组分可各自以治疗有效量投予，或其投予的组合可产生治疗有效量。
[0090] 医药组合物包括药学上可接受的载剂，所述载剂包括，对研究性治疗、预防性治疗和/或治疗性治疗不产生超过投予益处的显著负面反应、过敏性反应或其它不良反应的载
剂。示范性药学上可接受的载剂和配方披露于雷明顿(Remington),2005中。此外，医药组合
物可经制备以满足具有生物标准的美国食品药物管理(FDA)局(U.S.Food and Drug
Administration(FDA)Office of Biological Standards)和/或其它相关外国管制机关所
要求的无菌、发热性和/或通用安全和纯度标准。
剂。示范性药学上可接受的载剂和配方披露于雷明顿(Remington),2005中。此外，医药组合
物可经制备以满足具有生物标准的美国食品药物管理(FDA)局(U.S.Food and Drug
Administration(FDA)Office of Biological Standards)和/或其它相关外国管制机关所
要求的无菌、发热性和/或通用安全和纯度标准。
[0091] 通常，芋螺毒素肽将与一或多种针对所选投予模式选择的药学上可接受的载剂混合。传递方法的实例参见美国专利第5,844,077号。
[0092] 通常使用的示范性药学上可接受的载剂包括任何和所有膨化剂、填充剂、溶剂、共溶剂、分散介质、包衣、表面活化剂、抗氧化剂、防腐剂、等张剂、释放剂、吸收延迟剂、盐、稳
定剂、缓冲剂、螯合剂、凝胶、粘合剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、调味剂、甜味
剂和芳香剂。
定剂、缓冲剂、螯合剂、凝胶、粘合剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、调味剂、甜味
剂和芳香剂。
[0093] 示范性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、反丁烯二酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲
剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐。
剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐。
[0094] 示范性防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苯甲基铵、苯扎卤铵、氯化六甲铵、对羟基苯甲酸烷基酯、对羟基苯甲
酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3‑戊醇。
酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3‑戊醇。
[0095] 示范性等张剂包括多羟糖醇、三羟基糖醇或较高级糖醇，例如丙三醇、丁四醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
[0096] 示范性稳定剂包括有机糖、多羟糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物和多醣。
[0097] 示范性抗氧化剂包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、半胱氨酸盐酸盐、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、油溶性抗氧化剂、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基甲氧苯
(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α‑生育酚、金属螯合剂、柠檬酸、乙二
胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α‑生育酚、金属螯合剂、柠檬酸、乙二
胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
[0098] 示范性润滑剂包括月桂基硫酸钠和硬脂酸镁。
[0099] 示范性药学上可接受的盐包括用无机或有机酸和/或碱形成的酸性和/或碱性盐，优选为碱性盐。尽管药学上可接受的盐尤其在将芋螺毒素肽用作药剂时为优选的，但例如
其它盐在处理这些芋螺毒素肽时或在预期非药剂类型用途的情况下具有效用。这些芋螺毒
素肽的盐可通过所属领域中所公认的技术制备。
其它盐在处理这些芋螺毒素肽时或在预期非药剂类型用途的情况下具有效用。这些芋螺毒
素肽的盐可通过所属领域中所公认的技术制备。
[0100] 示范性药学上可接受的盐包括无机和有机加成盐、例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、反丁烯二
酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐(isothionate)、茶碱乙酸盐和水杨酸盐。也
可使用较低碳数烷基四级铵盐。
酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐(isothionate)、茶碱乙酸盐和水杨酸盐。也
可使用较低碳数烷基四级铵盐。
[0101] 对于口服投予，芋螺毒素肽可配制成固体或液体制剂，例如胶囊、丸剂、片剂、口含锭、熔融物(melt)、散剂、悬浮液或乳液。将组合物制备成口服剂型时，可采用一般药学上可
接受的载剂中的任一者，在口服固体制剂(例如散剂、胶囊和片剂)的情况下，例如淀粉、糖、
稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩散剂等；或在口服液体制剂(例如悬浮液、酏剂或溶液)
的情况下，例如水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等的载剂。由于片剂和胶囊
容易投予，因此其可代表有利的口服单位剂型，所述情况下，显然采用固体医药载剂。如果
需要，那么片剂可通过标准技术经糖衣包覆或经肠溶衣包覆。芋螺毒素肽可经囊封，以使其
稳定地通过胃肠道，且同时，在某些实施例中，允许通过血脑屏障。参见例如WO 96/11698。
接受的载剂中的任一者，在口服固体制剂(例如散剂、胶囊和片剂)的情况下，例如淀粉、糖、
稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩散剂等；或在口服液体制剂(例如悬浮液、酏剂或溶液)
的情况下，例如水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等的载剂。由于片剂和胶囊
容易投予，因此其可代表有利的口服单位剂型，所述情况下，显然采用固体医药载剂。如果
需要，那么片剂可通过标准技术经糖衣包覆或经肠溶衣包覆。芋螺毒素肽可经囊封，以使其
稳定地通过胃肠道，且同时，在某些实施例中，允许通过血脑屏障。参见例如WO 96/11698。
[0102] 对于肠胃外投予，芋螺毒素肽可溶解于药学上可接受的载剂中且以溶液或悬浮液形式投予。示范性药学上可接受的载剂包括水、盐水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇或动物
油、植物油或合成来源的油。载剂还可含有其它成分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂
等。
油、植物油或合成来源的油。载剂还可含有其它成分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂
等。
[0103] 芋螺毒素可为散剂形式，用于在传递时在适当药学上可接受的载剂中复原。在另一实施例中，芋螺毒素的单位剂型在无菌、气密封的安瓿或无菌注射器中可为芋螺毒素肽
或其药学上可接受的盐在适合稀释剂中的溶液。
或其药学上可接受的盐在适合稀释剂中的溶液。
[0104] 芋螺毒素肽还可配制成药物储槽制剂。药物储槽制剂可使用适合聚合材料或疏水性材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制而成，或配制成微溶衍生物
(例如配制成微溶盐)。
(例如配制成微溶盐)。
[0105] 此外，芋螺毒素肽可利用含有至少一种化合物的固体聚合物的半透性基质配制成持续释放系统。多种持续释放材料已由一般技术人员形成且为其所熟知。持续释放系统可
视其化学性质而定在投予后释放芋螺毒素肽达数周至超过100天。
视其化学性质而定在投予后释放芋螺毒素肽达数周至超过100天。
[0106] 芋螺毒素肽的投予也可使用泵(参见例如鲁尔(Luer)等人,(1993)；齐姆(Zimm)等人,(1984)和埃廷格(Ettinger)等人,(1978))、微胶囊化(参见例如美国专利第4,352,883
号、第4,353,888号和第5,084,350号)、连续释放聚合物植入物(参见例如美国专利第4,
883,666号)和大型胶囊化(参见例如美国专利第5,284,761号、第5,158,881号、第4,976,
859号和第4,968,733号，以及公开的PCT专利申请案WO92/19195、WO 95/05452)实现。
号、第4,353,888号和第5,084,350号)、连续释放聚合物植入物(参见例如美国专利第4,
883,666号)和大型胶囊化(参见例如美国专利第5,284,761号、第5,158,881号、第4,976,
859号和第4,968,733号，以及公开的PCT专利申请案WO92/19195、WO 95/05452)实现。
[0107] 当芋螺毒素肽经鞘内投予时，其也可溶解于脑脊髓液中。还可使用移植到CNS的裸露或未未囊封细胞。参见例如美国专利第5,082,670号和第5,618,531号。
[0108] 示范性实施例
[0109] 1.一种芋螺毒素肽，其包括式SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37。
[0110] 2.如实施例1的芋螺毒素肽，其包括式SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29。
[0111] 3.如实施例1或2的芋螺毒素肽，其包括以下式：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID
NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID
NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21。
NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID
NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21。
[0112] 4.如实施例1到3中任一项的芋螺毒素肽，其中所述芋螺毒素肽的C‑末端为羧酸基。
[0113] 5.如4的芋螺毒素肽，其中Tyr、碘‑Tyr或荧光标签添加到羧酸基。
[0114] 6.如实施例1到5中任一项的芋螺毒素肽，其具有添加到芋螺毒素肽的N‑末端的Tyr、碘‑Tyr、焦谷氨酸盐或荧光标签。
[0115] 7.如实施例1到6中任一项的芋螺毒素肽，其中所述芋螺毒素肽包括酰胺环化主链。
[0116] 8.一种医药组合物，其包括如实施例1到7中任一项的芋螺毒素肽或其盐以及药学上可接受的载剂。
[0117] 9.一种为有需要的受试者治疗与烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9α10亚型相关的至少一种病况的方法，所述方法包括向受试者投予治疗有效量的如实施例1到7的芋螺毒
素肽或如实施例8的医药组合物，从而治疗所述病况。
素肽或如实施例8的医药组合物，从而治疗所述病况。
[0118] 10.如实施例9的方法，其中所述至少一种病况为疼痛。
[0119] 11.如实施例10的方法，其中所述疼痛为一般疼痛、慢性疼痛、神经痛、伤害性疼痛、炎症性疼痛、与末梢神经或疼痛感受器损伤相关和/或由其诱发的疼痛、与炎症性病症
相关和/或由其诱发的疼痛、与代谢失调相关和/由其诱发的疼痛、与病毒感染相关和/或由
其诱发的疼痛、与癌症相关和/或由其诱发的疼痛、与化学治疗剂相关和/或由其诱发的疼
痛、与外科手术相关和/或其后诱发的疼痛和/或与烧伤和/或其它身体组织损伤相关和/或
由其诱发的疼痛。
相关和/或由其诱发的疼痛、与代谢失调相关和/由其诱发的疼痛、与病毒感染相关和/或由
其诱发的疼痛、与癌症相关和/或由其诱发的疼痛、与化学治疗剂相关和/或由其诱发的疼
痛、与外科手术相关和/或其后诱发的疼痛和/或与烧伤和/或其它身体组织损伤相关和/或
由其诱发的疼痛。
[0120] 12.如实施例10中任一项的方法，其中所述疼痛为化学疗法诱发的神经痛。
[0121] 13.如实施例10中任一项的方法，其中所述疼痛为与烧伤或其它组织热损伤相关的慢性疼痛和/或神经病变。
[0122] 14.如实施例10的方法，其中所述疼痛为手术或其它身体组织损伤后所诱发的疼痛和/或神经病变。
[0123] 15.如实施例9的方法，其中至少一种病况为炎症性病况。
[0124] 16.如实施例15的方法，其中所述炎症性病况为炎症、慢性炎症、风湿性疾病、败血症、纤维肌痛、炎症性肠病、类肉瘤病、子宫内膜异位、子宫肌瘤、炎症性皮肤病、肺炎症性病
况、与神经系统炎症相关的疾病、牙周病和/或心血管疾病。
况、与神经系统炎症相关的疾病、牙周病和/或心血管疾病。
[0125] 17.如实施例16的方法，其中所述风湿性疾病为以下中的一或多者：关节炎、狼疮、僵直性脊椎炎、纤维肌痛、肌腱炎、滑囊炎、硬皮病或痛风。
[0126] 18.如实施例16的方法，其中所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
[0127] 19.如实施例16的方法，其中所述炎症性皮肤病为牛皮癣或伤口愈合不良。
[0128] 20.如实施例16的方法，其中所述肺炎症性病况为哮喘或慢性阻塞性肺病。
[0129] 21.如实施例16的方法，其中所述神经系统的炎症为帕金森氏病或阿兹海默氏病。
[0130] 22.如实施例9的方法，其中所述至少一种病况为疼痛和炎症。
[0131] 23.如实施例9和15到21中任一者的方法，其中所述至少一种病况为炎症和神经病变。
[0132] 24.如实施例15到20中任一者的方法，其中所述炎症由免疫细胞介导。
[0133] 25.如实施例9和15到21中任一者的方法，其中所述至少一种病况为损伤后的长期炎症和末梢神经病变。
[0134] 26.如实施例9的方法，其中所述至少一种病况为癌症相关的慢性疼痛和神经病变。
[0135] 27.如实施例9的方法，其中所述至少一种病况为癌症。
[0136] 28.如实施例27的方法，其中所述癌症为乳癌。
[0137] 29.如实施例10或11的方法，其中所述疼痛为化学疗法相关的慢性疼痛和/或化学疗法相关的神经病变。
[0138] 包括以下实例以示范特定实施例。一般技术人员根据本发明应认识到可在不悖离本发明的精神和范围的情况下对本文所披露的特定实施例做出许多改变，并且仍获得相同
或相似的结果。
或相似的结果。
[0139] 实例
[0140] 实例1.RgIA的临床前优化。在体外表征研究和动物疼痛模型中评估前导芋螺毒素肽类似物，以选择用于临床前研发的前导芋螺毒素肽。
[0141] 表1.肽
[0142] 类似物编号 SEQ ID NO. 序列 1 GCCSDPRCRYRCR
2 19 GCCTDPRCX2X3QCR
3 3 GCCTDPRCX2X3QCY
4 4 GCCTDPRCX2X3QCRRR
5 5 GCCTDPRCX2X3QCYRR
6 6 GCCTDPRCX2X3QCRRY
7 7 GCCTDPRCX2X3QCF
8 8 GCCTDPRCX2X3QCW
9 9 GCCTDPRCX2X3QCYY
10 10 GCCTDPRCX2X3QCYR
11 11 GCCTDPRCRX3QCY
12 12 GCCTDPRCRX3QCRRR
13 13 GCCTDPRCRX3QCYRR
14 14 GCCTDPRCRX3QCRRY
1 15 GCCTDPRCRX3QCF
16 16 GCCTDPRCRX3QCW
17 17 GCCTDPRCRX3QCYY
18 18 GCCTDPRCRX3QCYR
20 GX4X4TDPRCX2X3QCR
21 GCCSDPRCRX3RCR
2 19 GCCTDPRCX2X3QCR
3 3 GCCTDPRCX2X3QCY
4 4 GCCTDPRCX2X3QCRRR
5 5 GCCTDPRCX2X3QCYRR
6 6 GCCTDPRCX2X3QCRRY
7 7 GCCTDPRCX2X3QCF
8 8 GCCTDPRCX2X3QCW
9 9 GCCTDPRCX2X3QCYY
10 10 GCCTDPRCX2X3QCYR
11 11 GCCTDPRCRX3QCY
12 12 GCCTDPRCRX3QCRRR
13 13 GCCTDPRCRX3QCYRR
14 14 GCCTDPRCRX3QCRRY
1 15 GCCTDPRCRX3QCF
16 16 GCCTDPRCRX3QCW
17 17 GCCTDPRCRX3QCYY
18 18 GCCTDPRCRX3QCYR
20 GX4X4TDPRCX2X3QCR
21 GCCSDPRCRX3RCR
[0143] X2＝瓜氨酸
[0144] X3＝单碘‑酪氨酸
[0145] X4＝硒代半胱氨酸
[0146] 表2.肽的活性
[0147]
[0148]
[0149] Sel＝硒代半胱氨酸
[0150] IC50 hα9α10：对爪蟾卵母细胞中所表达的人类α9α10 nAChR的IC50(以nM为单位)。
[0151] 表2中的IC50值使用具有C‑末端COOH的类似物X‑Y计算。
[0152] 亲本肽RgIA对于人类α9α10 nAChR的IC50为494nM(阿扎姆等人,2012)。因此，这些芋螺毒素肽类似物对于人类α9α10 nAChR的效力比亲本肽高80‑1100倍。
[0153] 实例2.nAChR亚型特异性和效能分析.测试芋螺毒素肽类似物对于非洲爪蟾卵母细胞中异源表达的选殖nAChR的功能活性。常规采用完成此举的方法(麦金托什等人,
2005)。卵母细胞系统具有的优势为提供关于拮抗剂活性对于促效剂活性的实时信息，并且
可通过异位机制检测芋螺毒素肽类似物的作用。对α9α10受体具有活性的化合物将针对α7
和α1β1δεnAChR经反向筛选，所述两种亚型与α9α10最密切相关。经选择以用于进一步研发
的芋螺毒素肽类似物将展示出：对于α9α10受体的IC50≤100nM且Imax≥80％，且对于α9α10
的选择性相较于α7或α1β1δε≥200倍。不符合这些准则的芋螺毒素肽类似物将被丢弃，不作
进一步评估，其余类似物则将针对nAChR子单元的所有可表达的逐对和同源组合进行详细
测试，以判定其亚型特异性。将取得各亚型组合的剂量‑反应曲线和动力学常数(包括缔合
和解离常数)。由于使用卵母细胞代表功能性分析，因此也可分析芋螺毒素肽类似物的其它
更细微特征，例如其对反转电位的影响和电压与其阻断的相关性。
2005)。卵母细胞系统具有的优势为提供关于拮抗剂活性对于促效剂活性的实时信息，并且
可通过异位机制检测芋螺毒素肽类似物的作用。对α9α10受体具有活性的化合物将针对α7
和α1β1δεnAChR经反向筛选，所述两种亚型与α9α10最密切相关。经选择以用于进一步研发
的芋螺毒素肽类似物将展示出：对于α9α10受体的IC50≤100nM且Imax≥80％，且对于α9α10
的选择性相较于α7或α1β1δε≥200倍。不符合这些准则的芋螺毒素肽类似物将被丢弃，不作
进一步评估，其余类似物则将针对nAChR子单元的所有可表达的逐对和同源组合进行详细
测试，以判定其亚型特异性。将取得各亚型组合的剂量‑反应曲线和动力学常数(包括缔合
和解离常数)。由于使用卵母细胞代表功能性分析，因此也可分析芋螺毒素肽类似物的其它
更细微特征，例如其对反转电位的影响和电压与其阻断的相关性。
[0154] 类似物2(SEQ ID NO:4)已证实可接受的效能和选择性。此芋螺毒素肽类似物对α9α10 nAChR具有强力的拮抗剂活性(约8nM IC50，图2)，而其对所有其它亚型的IC50均大于10
μM(n＝3‑5)。因此，类似物2(SEQ ID NO:4)对α9α10 nAChR的IC50与对其它主要亚型的IC50
相差1000倍，所述其它主要亚型包括肌肉nAChR(α1β1γδ)和神经元nAChR(α2β2、α2β4、α3β
2、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β2、α6β4和α7)。
μM(n＝3‑5)。因此，类似物2(SEQ ID NO:4)对α9α10 nAChR的IC50与对其它主要亚型的IC50
相差1000倍，所述其它主要亚型包括肌肉nAChR(α1β1γδ)和神经元nAChR(α2β2、α2β4、α3β
2、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β2、α6β4和α7)。
[0155] 对其它受体亚型测试前导芋螺毒素肽类似物，所述受体亚型包括结构相关的5‑HT3和GABAA受体。还检验更通用的止痛相关目标，包括类鸦片、GABAB、蕈毒碱和去甲肾上腺
素运输蛋白和受体。
素运输蛋白和受体。
[0156] 实例3.稳定表达α9α10n AChR的细胞株的产生.先前已形成稳定表达nAChR的各种亚型的细胞株。然而，尚未研发出稳定表达最近识别的α9α10亚型的细胞株。且不会天然表
达nAChR的人类胎肾(HEK)细胞已成功用于表达许多nAChR亚型(卡佩利(Capelli)等人,
2011；阿卜杜拉赫曼诺夫(Abdrakhmanova)等人,2010；肖(Xiao)等人,2009；克菈昆
(Kracun)等人,2008；肖等人,1998)。这些细胞的优势在于不会天然表达nAChR。使用HEK293
细胞构建表达α9α10 nAChR的稳定纯系。主要表达构筑体含有由脑心肌炎病毒内部核糖体
进入序列(IRES)分隔的α9和α10的编码序列。观测到RNA(紫苜蓿嵌纹病毒的RNA4的5'UTR
(未转译区)‑α9编码序列‑α9的部分3'UTR序列)和RNA(紫苜蓿嵌纹病毒的RNA4的5'UTR‑α10
编码序列‑α10的部分3'UTR序列)的混合物导致爪蟾卵母细胞在过渡性转染后高度表达α9α
10受体。这两个表达卡匣选殖到细胞巨大病毒启动子下游的pIRES载体中，并且可选择标记
置换为(绿色荧光蛋白(GFP)：匀霉素(zeocin)基因(班尼特等人,1998)，以允许通过基于
GFP荧光和基于匀霉素的选择的纯系识别。
达nAChR的人类胎肾(HEK)细胞已成功用于表达许多nAChR亚型(卡佩利(Capelli)等人,
2011；阿卜杜拉赫曼诺夫(Abdrakhmanova)等人,2010；肖(Xiao)等人,2009；克菈昆
(Kracun)等人,2008；肖等人,1998)。这些细胞的优势在于不会天然表达nAChR。使用HEK293
细胞构建表达α9α10 nAChR的稳定纯系。主要表达构筑体含有由脑心肌炎病毒内部核糖体
进入序列(IRES)分隔的α9和α10的编码序列。观测到RNA(紫苜蓿嵌纹病毒的RNA4的5'UTR
(未转译区)‑α9编码序列‑α9的部分3'UTR序列)和RNA(紫苜蓿嵌纹病毒的RNA4的5'UTR‑α10
编码序列‑α10的部分3'UTR序列)的混合物导致爪蟾卵母细胞在过渡性转染后高度表达α9α
10受体。这两个表达卡匣选殖到细胞巨大病毒启动子下游的pIRES载体中，并且可选择标记
置换为(绿色荧光蛋白(GFP)：匀霉素(zeocin)基因(班尼特等人,1998)，以允许通过基于
GFP荧光和基于匀霉素的选择的纯系识别。
[0157] 使用例如 HD转染试剂(罗氏应用科学部(Roche Applied Science))的试剂，用DNA从表达载剂转染HEK293细胞。使用荧光活化细胞分选(FACS)识别GFP表达纯系，
并且使用基于荧光显微术的胞内钙分析识别表达功能性α9α10受体的纯系(卡佩利等人,
2011；克菈昆等人,2008；泰歇特(Teichert)等人,2012)。转染四十八小时后，通过FACS分离
GFP表达细胞并且将其接种到完全培养基中。接种二十四小时后，一部分细胞(约50,000个)
重新接种到聚赖氨酸涂覆的24孔板上，用于钙成像研究。通过将细胞暴露于钙敏感的荧光
染料荧光‑4‑乙酰氧基甲酯(Fura‑2‑AM，Invitrogen)进行钙成像。Fura‑2‑AM进入细胞，且
与钙结合后激发光谱发生改变(巴雷托‑常(Barreto‑Chang)和多尔梅奇(Dolmetsch)，
2009)。由于胞内钙含量与α9α10受体表达成正比升高，因此此分析可识别高度表达的殖株。
将使用用于Fura‑2‑AM的标准比例成像视讯显微术。将监测促效剂和拮抗剂对荧光发射的
作用。未经转染的细胞将用作阴性对照，且形成的α3β4 nAChR细胞株将用作阳性对照。稳定
表达受体的纯系将于选择下生长且根据标准方法冷藏。最终细胞株将使用膜片箝制电生理
技术进行分析，以确认所表达受体的药理学和功能。
并且使用基于荧光显微术的胞内钙分析识别表达功能性α9α10受体的纯系(卡佩利等人,
2011；克菈昆等人,2008；泰歇特(Teichert)等人,2012)。转染四十八小时后，通过FACS分离
GFP表达细胞并且将其接种到完全培养基中。接种二十四小时后，一部分细胞(约50,000个)
重新接种到聚赖氨酸涂覆的24孔板上，用于钙成像研究。通过将细胞暴露于钙敏感的荧光
染料荧光‑4‑乙酰氧基甲酯(Fura‑2‑AM，Invitrogen)进行钙成像。Fura‑2‑AM进入细胞，且
与钙结合后激发光谱发生改变(巴雷托‑常(Barreto‑Chang)和多尔梅奇(Dolmetsch)，
2009)。由于胞内钙含量与α9α10受体表达成正比升高，因此此分析可识别高度表达的殖株。
将使用用于Fura‑2‑AM的标准比例成像视讯显微术。将监测促效剂和拮抗剂对荧光发射的
作用。未经转染的细胞将用作阴性对照，且形成的α3β4 nAChR细胞株将用作阳性对照。稳定
表达受体的纯系将于选择下生长且根据标准方法冷藏。最终细胞株将使用膜片箝制电生理
技术进行分析，以确认所表达受体的药理学和功能。
[0158] 用于产生充分表达α9α10亚型的细胞株的替代系统包括：(1)将内源5'‑UTR和内源3'‑UTR从α9基因和α10基因选殖到双向载剂pBi(Clontech)，以获得：(5'α9UTR‑α9编码序
列‑3'α9UTR)‑双向启动子‑(5'α10UTR‑α10编码序列‑3'α10UTR)，和如前所述将可选择标记
置换为GFP：匀霉素；和(2)将cDNA编码α9α10与其内源UTR一起插入pTRE3G‑hyg载体(四环素
诱导双向载体)，和将选择标记置换为GFP：匀霉素，以产生用于表达的四环素诱导系统。对
于替代性系统#2，HEK293 细胞(Clontech)经转染，且基因表达将通过向培养基添
加多西环素(doxycycline)开始。
列‑3'α9UTR)‑双向启动子‑(5'α10UTR‑α10编码序列‑3'α10UTR)，和如前所述将可选择标记
置换为GFP：匀霉素；和(2)将cDNA编码α9α10与其内源UTR一起插入pTRE3G‑hyg载体(四环素
诱导双向载体)，和将选择标记置换为GFP：匀霉素，以产生用于表达的四环素诱导系统。对
于替代性系统#2，HEK293 细胞(Clontech)经转染，且基因表达将通过向培养基添
加多西环素(doxycycline)开始。
[0159] 实例4.用于评定芋螺毒素肽效能的体内疼痛模型。全皮层热损伤模型：热损伤之前使用含4％异氟醚的氧气将史泊格多利大白鼠(Sprague Dawley rat)麻醉。使用配备有
斜置烙铁头(RX‑80HRT‑5.4D)(固特(Goot),广岛市(Hiroshima),日本)的温控超焊台引发
损伤。这一程序导致全皮层热损伤。使用苏木素(hematoxylin)和曙红(eosin)的皮肤组织
学确认这一损伤的深度和重复性。为防止感染，每天一次向后爪上受伤部位或未受伤部位
施用磺胺嘧啶银(1％)软膏，直到受伤动物形成疤痕组织(损伤后7天)。为检验芋螺毒素肽
对热损伤诱发的疼痛的功效和效能，损伤后分析机械性异常疼痛和热痛觉过敏持续高达21
天。
斜置烙铁头(RX‑80HRT‑5.4D)(固特(Goot),广岛市(Hiroshima),日本)的温控超焊台引发
损伤。这一程序导致全皮层热损伤。使用苏木素(hematoxylin)和曙红(eosin)的皮肤组织
学确认这一损伤的深度和重复性。为防止感染，每天一次向后爪上受伤部位或未受伤部位
施用磺胺嘧啶银(1％)软膏，直到受伤动物形成疤痕组织(损伤后7天)。为检验芋螺毒素肽
对热损伤诱发的疼痛的功效和效能，损伤后分析机械性异常疼痛和热痛觉过敏持续高达21
天。
[0160] 脊髓神经结扎模型(SNL)：SNL涉及通过L5脊髓神经的结扎的部分传入神经阻滞，使其它邻近神经保持完整且允许对大鼠后爪进行行为测试。在受影响的神经退化期间，邻
近的未受损神经暴露于化学炎症性介体的环境中，所述环境与临床中创伤性损伤中所见相
似。SNL模型为实验性神经痛的广泛接受模型，其在结扎的1到2天内可靠地产生热痛觉过敏
和机械性异常疼痛，具有低变异性且不存在运动协调缺陷(金姆(Kim)等人,1992)。
近的未受损神经暴露于化学炎症性介体的环境中，所述环境与临床中创伤性损伤中所见相
似。SNL模型为实验性神经痛的广泛接受模型，其在结扎的1到2天内可靠地产生热痛觉过敏
和机械性异常疼痛，具有低变异性且不存在运动协调缺陷(金姆(Kim)等人,1992)。
[0161] 使用含4％异氟烷的氧气对史泊格多利大白鼠实施麻醉，且随后使用经鼻锥传递的约2‑2.5％的异氟烷进行维持。将大鼠毛发剪除，且使用2％聚维酮碘和70％乙醇水溶液
交互处理消毒手术部位。手术在解剖显微镜帮助下进行。在自动物的中线向外侧0.8cm处制
造约2cm的纵向切口。切口暴露脊椎旁肌肉，所述脊椎旁肌肉与相邻的结缔组织一起从L5脊
椎突的位准移到荐骨。L6横突移动到非常靠近脊椎，允许接入L4和L5脊神经。将6‑0丝线置
放于L5神经下方，且将所述神经紧扎。对于假手术组动物，将线置放于L5神经下方，但去除
且不结扎。无可见出血存在的情况下，伤口逐层闭合。使用3‑0丝线缝合筋膜，且使用金属创
缘夹使皮肤闭合。中断麻醉，且将动物送回其笼子。给予两剂0.05mg/kg丁基原啡因皮下注
射；一剂紧随手术之后，且一剂在术后8小时。这一止痛法因手术的侵袭力而为必需的，且不
影响随后对芋螺毒素肽的镇痛活性的测量。对术后具有明显运动缺陷的动物实施安乐死且
从行为研究中排除。
交互处理消毒手术部位。手术在解剖显微镜帮助下进行。在自动物的中线向外侧0.8cm处制
造约2cm的纵向切口。切口暴露脊椎旁肌肉，所述脊椎旁肌肉与相邻的结缔组织一起从L5脊
椎突的位准移到荐骨。L6横突移动到非常靠近脊椎，允许接入L4和L5脊神经。将6‑0丝线置
放于L5神经下方，且将所述神经紧扎。对于假手术组动物，将线置放于L5神经下方，但去除
且不结扎。无可见出血存在的情况下，伤口逐层闭合。使用3‑0丝线缝合筋膜，且使用金属创
缘夹使皮肤闭合。中断麻醉，且将动物送回其笼子。给予两剂0.05mg/kg丁基原啡因皮下注
射；一剂紧随手术之后，且一剂在术后8小时。这一止痛法因手术的侵袭力而为必需的，且不
影响随后对芋螺毒素肽的镇痛活性的测量。对术后具有明显运动缺陷的动物实施安乐死且
从行为研究中排除。
[0162] 机械性异常疼痛测试：通过使用电子von Frey触觉测量仪(皮彻(Pitcher)等人,1999)识别产生机械性异常疼痛(其为正常情况下不导致疼痛的刺激所导致的疼痛)的受伤
大鼠。所述程序开始之前使大鼠适应测试室环境20分钟。装置向后爪的足底中部区域传递
压力持续15秒(增量为2g/s)。测试的上限临限值为30克。比较受伤大鼠从刺激移开爪子时
的压力(缩足临限值)与受伤前大鼠移开爪子时的压力(基线临限值)。随后评估芋螺毒素肽
处理对于缩足临限值的作用。经假手术操作且用媒剂处理的动物充当对照组。各时间点对
每只动物进行三次重复测量。
大鼠。所述程序开始之前使大鼠适应测试室环境20分钟。装置向后爪的足底中部区域传递
压力持续15秒(增量为2g/s)。测试的上限临限值为30克。比较受伤大鼠从刺激移开爪子时
的压力(缩足临限值)与受伤前大鼠移开爪子时的压力(基线临限值)。随后评估芋螺毒素肽
处理对于缩足临限值的作用。经假手术操作且用媒剂处理的动物充当对照组。各时间点对
每只动物进行三次重复测量。
[0163] 热痛觉过敏测试：热痛觉过敏为对痛性热或冷的夸大反应，所述夸大反应有时由损伤导致。测试动物对热的反应以确定使用芋螺毒素肽的处理是否缓解此痛觉过敏。如机
械性异常疼痛测试一样，动物在受伤前经测试形成基线反应。为确定热缩足临限值，使用足
底测试(哈格里夫法(Hargreaves method))(哈格里夫(Hargreaves)等人,1988)。将动物置
放在位于架高温控玻璃板上的丙烯酸封闭区中。辐射热源(可见光)聚焦在后爪的足底表面
上，且当爪从热源撤回时识别出热临限值。
械性异常疼痛测试一样，动物在受伤前经测试形成基线反应。为确定热缩足临限值，使用足
底测试(哈格里夫法(Hargreaves method))(哈格里夫(Hargreaves)等人,1988)。将动物置
放在位于架高温控玻璃板上的丙烯酸封闭区中。辐射热源(可见光)聚焦在后爪的足底表面
上，且当爪从热源撤回时识别出热临限值。
[0164] 免疫组织化学研究：对从每个测试组中的受试者获得的组织进行免疫组织化学分析以判定测试芋螺毒素肽是否影响痛感的分子介体的活化和/或表达。所获得的组织包括
脊髓的背角以及其它神经系统组分。针对p38MAPK、磷酸化p38MAPK、OX‑42、c‑Fos、抑钙素基
因相关肽(CGRP)、物质P、μ‑型类鸦片受体、神经元核抗原和其它分子产生的抗体按需要用
于这些分析。为获得组织，使用戊巴比妥钠麻醉大鼠且随后通过使用4％三聚甲醛的放血‑
灌注使其安乐死。组织在4％三聚甲醛中后固定24小时且随后储存在30％蔗糖中直到切片。
在低温控制器上将组织以30μm直接冷冻切片到经处理载玻片上。使用PBS清洗载玻片且使
用特定一级抗体培育，以标记相关分子。经荧光标记或生物素结合的二级抗体用作检测试
剂，且所得载玻片通过荧光显微镜或亮视野显微镜目测。
脊髓的背角以及其它神经系统组分。针对p38MAPK、磷酸化p38MAPK、OX‑42、c‑Fos、抑钙素基
因相关肽(CGRP)、物质P、μ‑型类鸦片受体、神经元核抗原和其它分子产生的抗体按需要用
于这些分析。为获得组织，使用戊巴比妥钠麻醉大鼠且随后通过使用4％三聚甲醛的放血‑
灌注使其安乐死。组织在4％三聚甲醛中后固定24小时且随后储存在30％蔗糖中直到切片。
在低温控制器上将组织以30μm直接冷冻切片到经处理载玻片上。使用PBS清洗载玻片且使
用特定一级抗体培育，以标记相关分子。经荧光标记或生物素结合的二级抗体用作检测试
剂，且所得载玻片通过荧光显微镜或亮视野显微镜目测。
[0165] 啮齿动物疼痛模型中药物功效的类似物筛选：在初步筛选实验中，使用每天33μg/kg的皮下剂量在SNL和FTB疼痛模型中评估类似物。这一剂量与先前RgIA实验的最大剂量的
大约一半相一致，且预期产生最大血清浓度约为各类似物对α9α10受体的IC50。芋螺毒素肽
或媒剂对照处理从损伤之日开始且持续21天。在第7天，第14天和第21天对动物进行评定。
测试在即将剂量投予之前(最后一次剂量后24小时)和测试当天的剂量投予后30分钟时进
行。研究终点包括机械性缩足临限值和热缩足临限值、每日临床观测和每周的体重。此初始
研究可用于选择用于剂量‑反应研究的两种最有效类似物。
大约一半相一致，且预期产生最大血清浓度约为各类似物对α9α10受体的IC50。芋螺毒素肽
或媒剂对照处理从损伤之日开始且持续21天。在第7天，第14天和第21天对动物进行评定。
测试在即将剂量投予之前(最后一次剂量后24小时)和测试当天的剂量投予后30分钟时进
行。研究终点包括机械性缩足临限值和热缩足临限值、每日临床观测和每周的体重。此初始
研究可用于选择用于剂量‑反应研究的两种最有效类似物。
[0166] 芋螺毒素肽对从脊髓释放的促避害肽的作用：热损伤和脊髓神经结扎引起脊髓的感觉背角中促炎症肽释放增强，所述促炎症肽包括CGRP和物质P(图3)。如果芋螺毒素肽对
于热损伤后的疼痛为有效止痛剂，那么如减少的疼痛信号传导所测量，在脊髓中应观测到
CGRP和物质P的表达相应减少。为测试这一假设，大鼠经受右后爪的热损伤，且其后24小时
开始每天皮下投予芋螺毒素肽或媒剂。各组动物(n＝5/组)于24小时、1周和2周时处死，且
其组织通过灌注固定而固定。将采出的组织冷冻且切片到载玻片上。在缓冲剂中冲洗载玻
片，使用针对CGRP的一级抗体(1:10,000；Immunostar)或针对物质P的一级抗体(1:50,000；
Immunostar)培育24小时，且使用适当二级抗体和镍增强的二氨基联苯胺显色。
于热损伤后的疼痛为有效止痛剂，那么如减少的疼痛信号传导所测量，在脊髓中应观测到
CGRP和物质P的表达相应减少。为测试这一假设，大鼠经受右后爪的热损伤，且其后24小时
开始每天皮下投予芋螺毒素肽或媒剂。各组动物(n＝5/组)于24小时、1周和2周时处死，且
其组织通过灌注固定而固定。将采出的组织冷冻且切片到载玻片上。在缓冲剂中冲洗载玻
片，使用针对CGRP的一级抗体(1:10,000；Immunostar)或针对物质P的一级抗体(1:50,000；
Immunostar)培育24小时，且使用适当二级抗体和镍增强的二氨基联苯胺显色。
[0167] 还使用与这一研究相同的大鼠评估RgIA处理对烧伤病理学和对伤口愈合的作用。收集固定的后爪且切片以用于H&E染色和荧光免疫组织化学，以便对比经RgIA处理的大鼠
和经媒剂处理的大鼠。荧光免疫组织化学用以检测神经纤维神经支配的变化、各种炎症性
介体的表达、瘢痕形成的分子决定因素、细胞增殖标记和基质重塑所涉及的蛋白质。
和经媒剂处理的大鼠。荧光免疫组织化学用以检测神经纤维神经支配的变化、各种炎症性
介体的表达、瘢痕形成的分子决定因素、细胞增殖标记和基质重塑所涉及的蛋白质。
[0168] 实例5.化学疗法诱发的神经痛中的功效.
[0169] 使用化学疗法诱发的神经痛(CINP)的已建立体内模型评估RgIA投予对于奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)(常用的铂盐化学治疗剂)引起的末梢疼痛的作用。啮齿动物中的OXA
CINP为神经痛(NPP)的高度相关且广泛使用的模型(奥捷(Authier)等人,2009)。长期使用
OXA处理的大鼠产生末梢NPP，包括机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛和热异常疼痛(图4A到
4J)。在这一模型中，RgIA的每日投予在第14天和第21天具有显著镇痛作用(图4A、4B、4E、4F
和4I)。这些数据用作RgIA可预防化学疗法诱发的末梢NPP的概念的证据。使用相同模型评
估芋螺毒素肽的体内镇痛潜力。图4C、4D、4G、4H和4J展示表明类似物3(也称为CSP‑4；SEQ
ID NO:3)在此预防性处理范例中的镇痛作用的数据。
CINP为神经痛(NPP)的高度相关且广泛使用的模型(奥捷(Authier)等人,2009)。长期使用
OXA处理的大鼠产生末梢NPP，包括机械性痛觉过敏、机械性异常疼痛和热异常疼痛(图4A到
4J)。在这一模型中，RgIA的每日投予在第14天和第21天具有显著镇痛作用(图4A、4B、4E、4F
和4I)。这些数据用作RgIA可预防化学疗法诱发的末梢NPP的概念的证据。使用相同模型评
估芋螺毒素肽的体内镇痛潜力。图4C、4D、4G、4H和4J展示表明类似物3(也称为CSP‑4；SEQ
ID NO:3)在此预防性处理范例中的镇痛作用的数据。
[0170] RgIA和芋螺毒素肽可在OXA CINP模型的预防性处理范例和治疗性处理范例中测试。在两个范例中，将通过剂量反应研究判断最小有效剂量，研究中最少五分之三处理剂量
被试验。在额外研究中，芋螺毒素肽经测试且其功效与按低效剂量投予时的功效相比较。
被试验。在额外研究中，芋螺毒素肽经测试且其功效与按低效剂量投予时的功效相比较。
[0171] 在OXA诱发的CINP模型中，用2.4mg/kg的OXA处理雄性史泊格多利大白鼠(约250g)，每周连续腹膜内(i.p.)投予5天，持续3周(15次注射)。OXA溶解于5％葡萄糖水溶液
中。从给定实验的指定日期开始，每天将RgIA和芋螺毒素肽、阳性对照药物或阴性对照媒剂
肌肉内(i.m.)投予或皮下(s.c.)投予(班尼特(Bennett),2003)。阳性对照药物的实例包括
加巴喷丁(gabapentin)/普瑞巴林(pregabalin)和吗啡(morphine)。对于预防模式的处理，
大鼠自OXA注射的前一天开始接收RgIA或芋螺毒素肽持续21天。对于治疗性处理，药物投予
从NPP开始后开始，这对OXA CINP来说通常为14天。
中。从给定实验的指定日期开始，每天将RgIA和芋螺毒素肽、阳性对照药物或阴性对照媒剂
肌肉内(i.m.)投予或皮下(s.c.)投予(班尼特(Bennett),2003)。阳性对照药物的实例包括
加巴喷丁(gabapentin)/普瑞巴林(pregabalin)和吗啡(morphine)。对于预防模式的处理，
大鼠自OXA注射的前一天开始接收RgIA或芋螺毒素肽持续21天。对于治疗性处理，药物投予
从NPP开始后开始，这对OXA CINP来说通常为14天。
[0172] 机械性痛觉过敏通过兰德尔‑塞利特(Randall‑Selitto)测试测量(迪塞萨雷(Di Cesare),2012)。可使用von Frey测试和由如卓别林(Chaplan)等人,1994所述的上/下方法
产生的机械性异常疼痛。冷异常疼痛使用如下所述的冷板测试测量。所有测试的测量在第0
天(基线)、第7天、第14天和第21天进行，从治疗后30分钟和/或治疗后24小时开始。
产生的机械性异常疼痛。冷异常疼痛使用如下所述的冷板测试测量。所有测试的测量在第0
天(基线)、第7天、第14天和第21天进行，从治疗后30分钟和/或治疗后24小时开始。
[0173] 此外，在这些研究中从处理的动物采集血浆、背根节(DRG)和脊髓，以分析炎症性介体的表达的变化。通过RT‑qPCR且在DRG和脊髓组织中通过免疫组织化学法测量所述标记
的基因表达程度。
的基因表达程度。
[0174] 用2.4mg/kg溶解于5％葡萄糖水溶液中的OXA(红杉研究产品(Sequoia Research Products),潘博恩(Pangbourne),英国)处理雄性史泊格多利大白鼠，每周连续腹膜内投予
5天，持续3周(15次腹膜内注射)。在OXA投予的第一天开始，按三个剂量水平(0.89nmol/kg、
2.67nmol/kg和8.0nmol/kg)将RgIA或CSP‑4替代性地肌肉内注射入右侧和左侧外股肌。如
图4所指示，从处理后30分钟和/或处理后24小时开始，在第0天、第7天、第14天和第21天进
行测量。通过兰德尔‑塞利特测试测量机械性痛觉过敏。如本文所述使用von Frey测试测量
机械性异常疼痛。使用冷板测试测量冷异常疼痛，其中冷板保持在4℃下且直到测量到第一
个疼痛相关行为(包括举起和/或舔舐与冷板接触的爪子)的迹象。
5天，持续3周(15次腹膜内注射)。在OXA投予的第一天开始，按三个剂量水平(0.89nmol/kg、
2.67nmol/kg和8.0nmol/kg)将RgIA或CSP‑4替代性地肌肉内注射入右侧和左侧外股肌。如
图4所指示，从处理后30分钟和/或处理后24小时开始，在第0天、第7天、第14天和第21天进
行测量。通过兰德尔‑塞利特测试测量机械性痛觉过敏。如本文所述使用von Frey测试测量
机械性异常疼痛。使用冷板测试测量冷异常疼痛，其中冷板保持在4℃下且直到测量到第一
个疼痛相关行为(包括举起和/或舔舐与冷板接触的爪子)的迹象。
[0175] 机械性痛觉过敏.RgIA和CSP‑4在所测试的三个剂量(0.89nmol kg‑1、2.67nmol ‑1 ‑1
kg 和8.0nmol kg )下显著预防OXA诱发的痛觉过敏(图4A到D)。注射30分钟后测量时，
‑1
RgIA和CSP‑4使疼痛临限值急剧增大。24小时后疗效仍显著。普瑞巴林展示与0.89nmol kg
(所测试的最低剂量)给药的芋螺毒素肽相似的特征曲线。
kg 和8.0nmol kg )下显著预防OXA诱发的痛觉过敏(图4A到D)。注射30分钟后测量时，
‑1
RgIA和CSP‑4使疼痛临限值急剧增大。24小时后疗效仍显著。普瑞巴林展示与0.89nmol kg
(所测试的最低剂量)给药的芋螺毒素肽相似的特征曲线。
[0176] 机械性异常疼痛.机械性异常疼痛的Von Frey测试测量值报告且展示于图4E到H‑1 ‑1
中。在第7天，OXA处理诱发的疼痛临限值减少在2.67nmol kg 和8.0nmol kg 的RgIA和
CSP‑4投予30分钟后恢复；24小时后未观测到镇痛作用。普瑞巴林展示相似作用。在第14天
和第21天，RgIA和CSP‑4(所有剂量)和普瑞巴林在注射30分钟和24小时后均具活性，表明
RgIA和CSP‑4的长期镇痛作用。
中。在第7天，OXA处理诱发的疼痛临限值减少在2.67nmol kg 和8.0nmol kg 的RgIA和
CSP‑4投予30分钟后恢复；24小时后未观测到镇痛作用。普瑞巴林展示相似作用。在第14天
和第21天，RgIA和CSP‑4(所有剂量)和普瑞巴林在注射30分钟和24小时后均具活性，表明
RgIA和CSP‑4的长期镇痛作用。
[0177] 热异常疼痛.通过冷板测试评估热异常疼痛，且结果展示于图4I和图4J中。RgIA和‑1 ‑1
CSP‑4的重复投予(第7天为2.67nmol kg 和8.0nmol kg ，且第14天和第21天的所有剂量)
能够预防OXA诱发的冷异常疼痛。
CSP‑4的重复投予(第7天为2.67nmol kg 和8.0nmol kg ，且第14天和第21天的所有剂量)
能够预防OXA诱发的冷异常疼痛。
[0178] 实例6.全皮层损伤(烧伤)疼痛模型中的功效.
[0179] 烧伤涉及神经性组分和炎症性组分。大鼠中烧伤的体内模型，例如实例4中所述的模型(全皮层热损伤模型；FTTI)已展示烧伤诱发的机械性异常疼痛和热痛觉过敏。
[0180] 已显示，使用RgIA的急性处理有效减轻FTTI模型中的热痛觉过敏和机械性异常疼痛。芋螺毒素肽相较于RgIA对人类α9α10 nAChR通道展示较高效能，评估芋螺毒素肽减轻烧
伤诱发的疼痛的能力，如通过以下一或多者的减轻来测量：机械性异常疼痛、热痛觉过敏
和/或炎症性标记的表达。
伤诱发的疼痛的能力，如通过以下一或多者的减轻来测量：机械性异常疼痛、热痛觉过敏
和/或炎症性标记的表达。
[0181] 具有单侧后爪FTTI的大鼠每天接收单次芋螺毒素肽注射，持续14天，或接受等剂量阴性对照盐水注射。为研究剂量依赖性作用，测试至少3个剂量的芋螺毒素肽。药物的注
射可通过包括皮下或肌肉内的途径投予。
射可通过包括皮下或肌肉内的途径投予。
[0182] 在第1天、第4天、第7天和第14天的损伤后/处理后时间段内测量类似物的镇痛作用。如上文所述，机械性异常疼痛通过von Frey方法测量，且热痛觉过敏通过哈格里夫方法
测量。此外，在源自相同动物的血浆、爪组织、DRG和脊髓样品中测量炎症性标记的含量。通
过qPCR测量的炎症性介体包括物质P、CGRP、TGF‑β、TNF‑α、IL‑6和IL‑1β。DRG和脊髓中的选
择性标记通过免疫组织化学法使用巨噬细胞标记特异性抗体和T细胞标记特异性抗体分
析。
测量。此外，在源自相同动物的血浆、爪组织、DRG和脊髓样品中测量炎症性标记的含量。通
过qPCR测量的炎症性介体包括物质P、CGRP、TGF‑β、TNF‑α、IL‑6和IL‑1β。DRG和脊髓中的选
择性标记通过免疫组织化学法使用巨噬细胞标记特异性抗体和T细胞标记特异性抗体分
析。
[0183] 源自一个所进行的所述研究的资料展示于图5A和5B中。RgIA(图5A)和类似物11(也称为CSP‑7；SEQ ID NO:11)(图5B)显著减轻烧伤诱发的热痛觉过敏，如通过哈格雷夫斯
方法以全部三个测试剂量(4mcg/Kg、20mcg/Kg和100mcg/Kg)所测量。
方法以全部三个测试剂量(4mcg/Kg、20mcg/Kg和100mcg/Kg)所测量。
[0184] 统计分析.结果以平均值±S.E.M.的方式表示，且通过ANOVA进行方差分析。将邓尼特(Dunnet)的显著差异程序用作事后比较(post‑hoc comparison)。小于0.05或0.01的P
值将视为显著。
值将视为显著。
[0185] 实例7.术后神经痛模型中的功效.
[0186] 手术后疼痛的爪子切口模型经设计以仿真手术后所经历的疼痛。所述模型涉及在一只爪子的足底表面制造1cm的切口，以产生与患者所报告相似的疼痛和敏感性。如下所
述，采取对机械敏感性和机械性痛觉过敏的手术前测量，以便为芋螺毒素肽对减轻机械性
异常疼痛和痛觉过敏的功效的评估提供基线值。
述，采取对机械敏感性和机械性痛觉过敏的手术前测量，以便为芋螺毒素肽对减轻机械性
异常疼痛和痛觉过敏的功效的评估提供基线值。
[0187] 大鼠每天接受单次芋螺毒素肽注射，持续7天，或等剂量的阴性对照盐水注射或阳性对照吗啡注射。芋螺毒素肽的剂量相关作用可通过按多个剂量水平给药而测试。注射可
通过包括皮下或肌肉内的途径投予。
通过包括皮下或肌肉内的途径投予。
[0188] 机械性异常疼痛通过von Frey方法测量。测量在手术前(第3天和第0天)，术后约2小时(第0天)和术后第1、2、4、7天芋螺毒素肽给药后约30分钟进行。使用电子von Frey装置
(eVF,IITC Life 伍德兰希尔斯(Woodland Hills),加拿大(CA))测量机械敏感
性的值。动物置放在个别丙烯酸室中的金属筛网表面上，且在测试前允许动物用最少15分
钟适应环境。刺激以与爪子的足底表面垂直的方式存在，且逐渐施加压力。当注意到正面响
应(爪子骤然缩回)或爪子举离筛网表面时记录爪子缩足临限值。每个时间点每只后爪测量
三个eVF临限值。取3个值的平均值作为那一时间点的爪子缩足临限值。刺激经设计以测量
反应临限值，其为可免除的，且不对动物造成伤害。
(eVF,IITC Life 伍德兰希尔斯(Woodland Hills),加拿大(CA))测量机械敏感
性的值。动物置放在个别丙烯酸室中的金属筛网表面上，且在测试前允许动物用最少15分
钟适应环境。刺激以与爪子的足底表面垂直的方式存在，且逐渐施加压力。当注意到正面响
应(爪子骤然缩回)或爪子举离筛网表面时记录爪子缩足临限值。每个时间点每只后爪测量
三个eVF临限值。取3个值的平均值作为那一时间点的爪子缩足临限值。刺激经设计以测量
反应临限值，其为可免除的，且不对动物造成伤害。
[0189] 机械性痛觉过敏通过数字兰德尔‑塞利特爪子压力测试测量。测量于手术前(第3天)进行和术后第1、2、4和7天给药后约2小时进行。测试前，允许动物用最少15分钟适应测
试室。动物置于将动物悬起的约束吊带上，保持后肢可用于测试。通过锥形尖端向后爪的足
底表面施加刺激，且在约10秒内逐渐施加压力。第一次观测到疼痛反应行为(嘶叫、挣扎或
缩足)时记录爪子压迫临限值。每只爪采取一次读数，且使用300g的最大刺激截断值，以防
止伤害动物。刺激源经设计以测量反应临限值，刺激源可经免除，且不对动物造成伤害。
试室。动物置于将动物悬起的约束吊带上，保持后肢可用于测试。通过锥形尖端向后爪的足
底表面施加刺激，且在约10秒内逐渐施加压力。第一次观测到疼痛反应行为(嘶叫、挣扎或
缩足)时记录爪子压迫临限值。每只爪采取一次读数，且使用300g的最大刺激截断值，以防
止伤害动物。刺激源经设计以测量反应临限值，刺激源可经免除，且不对动物造成伤害。
[0190] 除非另作指示，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的习知技术，所述技术在所属领域范
围内。参见例如马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,分子克隆(Molecular Cloning)(冷泉港实验
室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽
约,1982)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆,第2版(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽
约,1989)；萨姆布鲁克和拉塞尔(Russell),分子克隆,第3版(冷泉港实验室出版社,冷泉
港,纽约,2001)；奥苏贝尔(Ausubel)等人,分子生物学实验指南(Current Protocols in
Molecular Biology)(约翰·威利父子(John Wiley&Sons),更新到2005)；格洛弗
(Glover),DNA克隆(DNA Cloning)(IRL出版社(IRL Press),牛津,1985)；安纳德,分析复杂
基因组的技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes),(学术出版社,纽
约,1992)；格思里(Guthrie)和芬克(Fink),酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology)(学术出版社,纽约,1991)；哈洛(Harlow)和莱
恩(Lane),抗体(Antibodies),(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1998)；雅各比
(Jakoby)和派斯坦(Pastan),1979；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.哈梅斯
(B.D.Hames)和S.J.希金斯(S.J.Higgins)编1984)；转录和转译(Transcription And
Translation)(B.D.哈梅斯和S.J.希金斯编1984)；动物细胞培养(Culture Of Animal
Cells)(R.I.费舍尼(R.I.Freshney),艾伦·R·利斯公司(Alan R.Liss,Inc.),1987)；固
定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社(IRL Press),1986)；B.旁巴
(B.Perbal),分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；酶
学方法论文(the treatise,Methods In Enzymology)(学术出版社公司(Academic Press,
Inc.),纽约(N.Y.))；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors For
Mammalian Cells)(J.H.米勒(J.H.Miller)和M.P.卡洛斯(M.P.Calos)编,1987,冷泉港实
验室)；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology)(迈尔(Mayer)和沃克(Walker)编,学术出版社,伦敦,1987)；实验免疫
学手册(Handbook Of Experimental Immunology),第I卷‑第IV卷(D.M.魏尔(D.M.Weir)和
C.C.布莱克威尔(C.C.Blackwell)编,1986)；瑞特(Riott),基础免疫学(Essential
Immunology),第6版(布莱克威尔科学出版(Blackwell Scientific Publications),牛津
(Oxford),1988)；霍根(Hogan)等人,操纵小鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo),
(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1986)；韦斯特,M(Westerfield,M.),斑马鱼手册(The
zebrafish book).实验室使用斑马鱼指南(A guide for the laboratory use of
zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio)),第4版(俄勒冈大学出版社(Univ.of Oregon Press),
尤金(Eugene),俄勒冈州(Oregon),2000)。
围内。参见例如马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,分子克隆(Molecular Cloning)(冷泉港实验
室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽
约,1982)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆,第2版(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽
约,1989)；萨姆布鲁克和拉塞尔(Russell),分子克隆,第3版(冷泉港实验室出版社,冷泉
港,纽约,2001)；奥苏贝尔(Ausubel)等人,分子生物学实验指南(Current Protocols in
Molecular Biology)(约翰·威利父子(John Wiley&Sons),更新到2005)；格洛弗
(Glover),DNA克隆(DNA Cloning)(IRL出版社(IRL Press),牛津,1985)；安纳德,分析复杂
基因组的技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes),(学术出版社,纽
约,1992)；格思里(Guthrie)和芬克(Fink),酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology)(学术出版社,纽约,1991)；哈洛(Harlow)和莱
恩(Lane),抗体(Antibodies),(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1998)；雅各比
(Jakoby)和派斯坦(Pastan),1979；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.哈梅斯
(B.D.Hames)和S.J.希金斯(S.J.Higgins)编1984)；转录和转译(Transcription And
Translation)(B.D.哈梅斯和S.J.希金斯编1984)；动物细胞培养(Culture Of Animal
Cells)(R.I.费舍尼(R.I.Freshney),艾伦·R·利斯公司(Alan R.Liss,Inc.),1987)；固
定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社(IRL Press),1986)；B.旁巴
(B.Perbal),分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；酶
学方法论文(the treatise,Methods In Enzymology)(学术出版社公司(Academic Press,
Inc.),纽约(N.Y.))；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors For
Mammalian Cells)(J.H.米勒(J.H.Miller)和M.P.卡洛斯(M.P.Calos)编,1987,冷泉港实
验室)；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology)(迈尔(Mayer)和沃克(Walker)编,学术出版社,伦敦,1987)；实验免疫
学手册(Handbook Of Experimental Immunology),第I卷‑第IV卷(D.M.魏尔(D.M.Weir)和
C.C.布莱克威尔(C.C.Blackwell)编,1986)；瑞特(Riott),基础免疫学(Essential
Immunology),第6版(布莱克威尔科学出版(Blackwell Scientific Publications),牛津
(Oxford),1988)；霍根(Hogan)等人,操纵小鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo),
(冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1986)；韦斯特,M(Westerfield,M.),斑马鱼手册(The
zebrafish book).实验室使用斑马鱼指南(A guide for the laboratory use of
zebrafish)(斑马鱼(Danio rerio)),第4版(俄勒冈大学出版社(Univ.of Oregon Press),
尤金(Eugene),俄勒冈州(Oregon),2000)。
[0191] 一般技术者应了解，本文所披露的各实施例可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：所述实施例的特定阐述组件、步骤、成分或组分。因此，术语“包括(include、
including)”应理解成以下叙述：“包含、由…组成、或基本上由…组成”。如本文所使用，过
渡术语“包含(comprise、comprises)”意思是包括但不限于，且允许包括以下各者：未指定
的组件、步骤、成分或组分，即使大量时也如此。过渡用语“由…组成”排除任何未指定的组
件、步骤、成分或组分。过渡用语“基本上由…组成”将实施例的范围限制为指定组件、步骤、
成分或组分，以及不会显著影响实施例的那些。如本文所使用，材料作用将导致本文所披露
的芋螺毒素肽阻断nAChR的α9/α10亚型的能力相较于RgIA统计学上显著降低。
including)”应理解成以下叙述：“包含、由…组成、或基本上由…组成”。如本文所使用，过
渡术语“包含(comprise、comprises)”意思是包括但不限于，且允许包括以下各者：未指定
的组件、步骤、成分或组分，即使大量时也如此。过渡用语“由…组成”排除任何未指定的组
件、步骤、成分或组分。过渡用语“基本上由…组成”将实施例的范围限制为指定组件、步骤、
成分或组分，以及不会显著影响实施例的那些。如本文所使用，材料作用将导致本文所披露
的芋螺毒素肽阻断nAChR的α9/α10亚型的能力相较于RgIA统计学上显著降低。
[0192] 除非另有指示，否则说明书和权利要求书中所用的全部数字都理解成在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指出为相反，否则在本说明书和所附权利要求书中所阐述的
数值参数为可视本发明设法获得的所要特性而改变的近似值。至少且不试图限制将等同原
则应用于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报告的有效位的数值且通过应用一
般舍入技术解释。当需要进一步明确时，术语“约”在与所述数值或范围结合使用时具有由
所属领域的技术人员合理归于其的含义，也就是指示比所述值或范围略多或略少，在所述
值的±20％；所述值的±19％；所述值的±18％；所述值的±17％；所述值的±16％；所述值
的±15％；所述值的±14％；所述值的±13％；所述值的±12％；所述值的±11％；所述值的
±10％；所述值的±9％；所述值的±8％；所述值的±7％；所述值的±6％；所述值的±5％；
所述值的±4％；所述值的±3％；所述值的±2％；或所述值的±1％的范围内。
数值参数为可视本发明设法获得的所要特性而改变的近似值。至少且不试图限制将等同原
则应用于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报告的有效位的数值且通过应用一
般舍入技术解释。当需要进一步明确时，术语“约”在与所述数值或范围结合使用时具有由
所属领域的技术人员合理归于其的含义，也就是指示比所述值或范围略多或略少，在所述
值的±20％；所述值的±19％；所述值的±18％；所述值的±17％；所述值的±16％；所述值
的±15％；所述值的±14％；所述值的±13％；所述值的±12％；所述值的±11％；所述值的
±10％；所述值的±9％；所述值的±8％；所述值的±7％；所述值的±6％；所述值的±5％；
所述值的±4％；所述值的±3％；所述值的±2％；或所述值的±1％的范围内。
[0193] 尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但已尽可能精确地报告特定实例中所述的数值。然而，任何数值固有地含有由其各别测试测量中所发现的标准偏
差必然产生的某些误差。
差必然产生的某些误差。
[0194] 除非本文中另外指示或上下文明显矛盾，否则描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求书的上下文中)所使用的术语“一”、“所述”和类似指示物将解释为涵盖单数和
复数。本文中值的范围的叙述仅打算作为个别提到属于所述范围的每一各别值的速记法。
除非本文中另作指示，否则每个个别值并入说明书中，就像所述值在本文中个别陈述一样。
除非本文中另作指示或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何适合次序
执行。使用本文所提供的任何和所有实例或示范性语言(例如“例如”)仅打算优选地阐明本
发明，且不对另外主张的本发明的范围作出限制。本说明书中的任何语言都不应解释为表
示实施本发明所必需的任何非主张要素。
复数。本文中值的范围的叙述仅打算作为个别提到属于所述范围的每一各别值的速记法。
除非本文中另作指示，否则每个个别值并入说明书中，就像所述值在本文中个别陈述一样。
除非本文中另作指示或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何适合次序
执行。使用本文所提供的任何和所有实例或示范性语言(例如“例如”)仅打算优选地阐明本
发明，且不对另外主张的本发明的范围作出限制。本说明书中的任何语言都不应解释为表
示实施本发明所必需的任何非主张要素。
[0195] 本文所披露的本发明的替代性组件或实施例的分组不应解释为限制。各群组成员可个别地或与群组的其它成员或其中发现的其它元素的任何组合形式提到和要求。预期一
或多个群组成员可出于便利性和/或专利性原因而包括于群组中或从群组中删除。当任何
所述包含或删除发生时，认为说明书含有所修正的群组，因而实现所附权利要求书中所使
用的所有马库西群组(Markush group)的书面描述。
或多个群组成员可出于便利性和/或专利性原因而包括于群组中或从群组中删除。当任何
所述包含或删除发生时，认为说明书含有所修正的群组，因而实现所附权利要求书中所使
用的所有马库西群组(Markush group)的书面描述。
[0196] 本文描述本发明的某些实施例，其包括发明者已知用于进行本发明的最佳方式。当然，阅读前述描述后，这些所述的实施例的变化对所属领域的技术人员来说将显而易知。
发明者期望所属领域技术人员在适当时使用所述变化，且发明者预期不按本文所具体描述
的方式实施本发明。因此，如果适用法律允许，那么本发明包括随附于本文的权利要求书中
所陈述的目标物的所有修正和等效物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，
否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
发明者期望所属领域技术人员在适当时使用所述变化，且发明者预期不按本文所具体描述
的方式实施本发明。因此，如果适用法律允许，那么本发明包括随附于本文的权利要求书中
所陈述的目标物的所有修正和等效物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，
否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
[0197] 此外，本说明书全文大量引用公开案、专利和/或专利申请案(统称为“参考文献”)。引用的参考文献中的每一个通过对其特定叙述的教示的引用而个别并入本文中。
[0198] 最后，应了解，本文所披露的本发明的实施例对本发明的原理为说明性的。可使用的其它修正属于本发明的范围内。因此，例如但不限制，可根据本文中的教示使用本发明的
替代组态。因此，本发明不限于展示和描述的确切内容。
替代组态。因此，本发明不限于展示和描述的确切内容。
[0199] 本文所展示的细节为举例方式，且仅出于说明性论述本发明的优选实施例的目的，且为了提供相信本发明的各种实施例的原理和概念态样的最有用以及容易理解的描述
而呈现。就此来说，不试图展示比基本理解本发明所必须的细节更详细的本发明的结构细
节，结合图式和/或实例所作的描述使所属领域的技术人员显而易知可如何具体实施本发
明的若干形式。
而呈现。就此来说，不试图展示比基本理解本发明所必须的细节更详细的本发明的结构细
节，结合图式和/或实例所作的描述使所属领域的技术人员显而易知可如何具体实施本发
明的若干形式。
[0200] 除非实例中明确且毫无疑问地修正或当所述含义的应用使任何构造无意义或实质上无意义时，本发明中所使用的定义和解释打算并且预期控制任何未来构造。在术语的
构造将导致其无意义或基本上无意义的情况下，定义应取自于韦氏词典(Webster's
Dictionary),第3版或所属领域的技术人员已知的的字典，例如生物化学与分子生物学牛
津字典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)(安东尼·史密
斯(Anthony Smith)编,牛津大学出版社(Oxford University Press),牛津(Oxford),
2004)。
构造将导致其无意义或基本上无意义的情况下，定义应取自于韦氏词典(Webster's
Dictionary),第3版或所属领域的技术人员已知的的字典，例如生物化学与分子生物学牛
津字典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)(安东尼·史密
斯(Anthony Smith)编,牛津大学出版社(Oxford University Press),牛津(Oxford),
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