植入物和通过负压下使组织去细胞化来制造植入物的方法

摘要

本发明提供一种从间质组织、结缔组织或支持组织制造植入物的方法，所述方法包含至少一个在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压基本上施加整个灌注时段。

权利要求

1.一种从间质组织、结缔组织或支持组织制造植入物的方法，所述方法包含至少一个在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压施加基本上整个灌注时段，所述方法还包含在所述或每一灌注步骤后的洗涤步骤，其中，整个方法是在不大于5kPa的负压下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述或每一去细胞化介质包含清洁剂和/或酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含至少一个包含清洁剂去细胞化介质的灌注步骤，和至少一个包含核酸酶去细胞化介质的灌注步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其包含每一灌注步骤之间的洗涤步骤和最后一个灌注步骤后的洗涤步骤。

5.根据权利要求3所述的方法，其包括包含清洁剂去细胞化介质的第一灌注步骤、包含核酸酶去细胞化介质的第二灌注步骤以及包含核酸酶去细胞化介质的第三灌注步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述或每一灌注步骤在25℃与40℃之间的温度下进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中进行每一灌注步骤在1小时与96小时之间。

8.根据权利要求1所述的方法，其中执行每一洗涤步骤在15分钟与96小时之间。

9.根据权利要求1所述的方法，其中每一灌注步骤或所述整个方法在不超过0.1kPa下进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含用细胞再接种所述植入物的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞包含自体细胞和/或同种异体细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织选自气管、气管的一部分或气管组织；骨骼；肌腱；韧带；骨-肌腱；软骨；喉、喉的一部分或喉组织；大血管或其一部分；以及神经组织。

13.一种基本上去细胞化组织植入物，其通过权利要求1中所述的方法制得。

14.根据权利要求13所述的植入物，其中所述植入物包含展示其所源自的所述组织的原始纤维架构和分子超微结构的胶原纤维。

15.根据权利要求13所述的植入物，其基本上不含软骨细胞。

16.根据权利要求13所述的植入物，其中所述组织为气管、气管的一部分或气管组织，其基本上不含内腔上皮细胞(粘膜)、粘膜下腺体、气管肌以及外膜内的细胞核。

17.根据权利要求13所述的植入物，其中所述植入物包含从原始组织中保留的细胞外基质葡萄糖胺聚糖。

说明书

植入物和通过负压下使组织去细胞化来制造植入物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植入物和制造植入物的方法。本发明尤其适用于制造源自如气管、肌腱以及骨骼的软骨或钙化组织的植入物。

背景技术

[0002] 包含生物源支架的植入物已成为各种不同疾病和病状的治疗中组织/器官修复和再生的重要选择。持续并且主要的障碍是需要从组织去除抗原呈递细胞材料，所述组织接着成为支架。具体来说，当将相对致密的间质组织、结缔组织或支持组织，包括软骨组织，如气管组织去细胞化时，如果有可能的话，极难从组织去除基本上所有的抗原呈递细胞。

[0003] 间质组织、结缔组织以及支持组织损伤，包括长气管病变，其对外科医生仍是挑战。举例来说，由先天性缺陷、损害超过4.5cm到6cm或超过30％的儿童总气管长度的外伤或肿瘤产生的损伤不可经由一期缝合治疗。因此，很少将这些患者视为可以手术方式治愈并且使用源自气管组织的植入物为所需替代方案。气管管道重建将扩大手术使用范围并且改善生活质量。

[0004] 再生医学领域的最新进展尤其在关于组织工程改造的更换气管支架上大有前途。理想更换应尽可能接近天然结构，从而提供稳定性和非免疫原性特征。为满足这些准则，大量研究资源指向针对使用生物材料作为起始点。使用同种异体或异种材料制备用于再生目的的支架需要将其所有的抗原性完全去除，同时保留细胞外基质以能够支持细胞连接并且为空气通风提供足够刚性。

[0005] 已知去细胞化技术使用不同化学和生物试剂以洗掉抗原呈递细胞和细胞粒子。使气管组织去细胞化的一个现有方案为基于清洁剂-酶促法，其中通过用各种清洁剂、酶以及其它试剂灌注而从气管组织去除细胞。尽管出于同情在少数病例中提供已成功移植合适的支架，但尚未达到标准临床实践。一个原因是花费约3周的冗长支架制备和由时间延迟所导致的对患者的并发风险。

[0006] 用于临床使用的标准化“现成”支架不仅需要适当结构、功能以及生物力学特征，而且需要在适合时间范围准备好的可行性。为改善组织的去细胞化，可利用不同方法，涵盖酶和清洁剂的不同组合。因为已知这些试剂大部分会改变细胞外基质，所以仍所需已知技术的不同方法以减缓或防止细胞外基质改变。

[0007] 因为间质组织、结缔组织以及支持组织，如软骨为特别致密的组织，所以需要一种方法在相对较短的时间内将去细胞化药剂深度传递到组织中，并且不会影响细胞外基质的组织超微结构，在制备气管植入物时尤其如此。

[0008] 因此本发明提供一种制造用于组织/器官修复的植入物的改进方法，尤其基于间质组织、结缔组织或支持组织，包括软骨组织，如气管。其中植入物可以在相对较短的时段内制成，同时维持基本上完整的细胞外基质并且去除基本上所有的抗原呈递细胞。

发明内容

[0009] 根据本发明的第一方面，提供一种从组织制造植入物的方法，所述方法包括至少一个在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压施加基本上(substantially)整个灌注时段。

[0010] 根据本发明的第二方面，提供一种从间质组织、结缔组织或支持组织制造植入物的方法，所述方法包含在负压下用至少一种去细胞化介质灌注所述组织的步骤，所述负压施加基本上整个灌注时段。

[0011] 适合的间质组织、结缔组织或支持组织包括软骨、纤维软骨以及钙化软骨组织，如气管、喉以及软骨本身、骨骼、肌腱、韧带、骨骼-肌腱、骨骼-韧带、神经组织、大血管(如动脉和静脉)以及滑膜。

[0012] 可用于本发明方法的非间质组织、结缔组织或支持组织包括大脑、食管、肠(小肠和大肠)、胰腺、脾、肝、肺、肾、淋巴管、小血管。

[0013] “负压”包括低于环境的压力或部分或基本上完全真空。

[0014] 所得支架为组织的修复和再生提供极佳植入物。

[0015] 去细胞化过程除了去细胞化介质灌注步骤以外还可以包含一个或多个洗涤步骤。优选地，所述或每一洗涤步骤也在负压下进行基本上整个所述或每一洗涤步骤时段。

[0016] 在一些具体实施方式中，基本上整个植入物制造方法在负压下进行。

[0017] 去细胞化介质经选择以便从组织中消耗细胞和细胞组分，同时使对细胞外基质(extracellular matrix；ECM)蛋白的损伤降到最低，从而获得ECM结构和功能尽可能得以保留的支架。

[0018] 合适的去细胞化介质包括清洁剂，如十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate；SDS)、去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate；SOC)；包含亲水性聚氧乙烯氧化物和疏水性烃部分的清洁剂，如Triton X-100(RTM)；酶，如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)和核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶，如DNA酶I，和核糖核酸酶，如RNA酶)以及其组合。在一个或多个去细胞化介质中还可以包括正磷酸三丁酯(Trisbutyl-n-phosphate；TBnP)。TBnP为破坏蛋白质-蛋白质相互作用的溶剂。

[0019] 所述方法优选地包含用一种以上去细胞化介质灌注组织。适当地，所述方法包含用至少一种清洁剂和至少一种核酸酶灌注组织。在一些具体实施方式中，所述方法包含用清洁剂灌注组织和用核酸酶灌注组织的单独的步骤，并且清洁剂灌注步骤可以在核酸酶灌注步骤之前进行。在一些具体实施方式中，每一清洁剂灌注步骤在负压下进行，而在一些其他具体实施方式中，清洁剂灌注与核酸酶灌注步骤皆在负压下进行。

[0020] 每一灌注步骤可以在15℃与45℃之间或30℃与40℃之间的温度下进行。在一些具体实施方式中，灌注步骤在约37℃下进行，在灌注步骤包括核酸酶物质时这样尤其有利。当灌注步骤为清洁剂灌注步骤时，其可以在15℃与40℃之间的温度，如约环境或室温下进行。

[0021] 在一些具体实施方式中，所述方法可以包含在每一灌注步骤之间的洗涤步骤。举例来说，洗涤步骤可以使用任何适合的洗涤介质，如磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline；PBS)、汉克斯平衡盐溶液或无菌水。洗涤步骤可以在1℃与8℃之间或2℃与6℃之间的温度下进行。或者，所述或每一洗涤步骤可以在15℃与40℃之间的温度，如约37℃，或约环境或室温下进行。在灌注步骤之间进行的每一洗涤步骤可以在负压下进行，并且在一些具体实施方式中，所有洗涤步骤均在负压下进行。洗涤步骤可以包含在洗涤介质上培育所述组织。

[0022] 灌注和/或洗涤可以在抗生素和/或抗霉菌素存在下进行。

[0023] 所述方法可以包含通过一系列步骤灌注组织，所述步骤包含：至少两个用核酸酶灌注的步骤，随后至少一个用清洁剂或清洁剂混合物灌注的步骤，在每一步骤之间用洗涤介质洗涤。在一些具体实施方式中，一系列的步骤包含两个用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的混合物灌注的步骤，随后用离子型和非离子型清洁剂的混合物灌注，在每一步骤之间用生理盐水溶液洗涤。在优选的具体实施方式中，清洁剂的混合物包含去氧胆酸钠和Triton X-100(RTM)，脱氧核糖核酸酶为DNA酶I，并且核糖核酸酶为RNA酶。

[0024] 适当地，进行每一灌注步骤在1小时与96小时之间，更优选地在18小时与84小时之间，并且最优选地在24小时与72小时之间。当灌注步骤包含清洁剂物质的灌注时，所述步骤至少可以进行12小时、18小时或24小时。当灌注步骤包含核酸酶的灌注时，所述步骤至少可以进行1小时、18小时或24小时。

[0025] 适当地，每一洗涤步骤可以进行在15分钟与96小时之间，如在12小时与96小时之间，更优选地在18小时与72小时之间，或在24小时与72小时之间。在每一灌注步骤之间或之后可以存在多个洗涤步骤，并且多个洗涤步骤中的每一者可以独立地进行在15分钟与96小时之间。

[0026] 所述方法可以包含将去细胞化组织存储在适合介质中，如生理盐水溶液中。生理盐水溶液可以包含至少一种抗生素和/或抗霉菌素物质。生理盐水溶液可以包含磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)溶液或汉克斯平衡盐溶液(可选地具有酸性Ca和/或Mg)并且可以包含抗生素与抗霉菌素物质。优选地存储于1℃与6℃之间，如约4℃的温度下。

[0027] 一个或多个灌注步骤在负压下进行。对于包含间质组织、结缔组织或支持组织的方法，在环境温度下所述压力优选地不超过10kPa、5kPa、2kPa、1kPa或0.5kPa。在一些具体实施方式中，所述压力不超过1kPa、不超过0.2kPa或不超过0.1kPa。人们认为，与原本不使用负压将会发生的情况相比，在此类减压下用去细胞化剂灌注组织不仅提高组织吸收灌注溶液和去细胞化介质的速度，而且能够使去细胞化介质更深地渗透到组织中，因此确保所有组织均用介质灌注，以能够基本上在相对较短时段内完全去细胞化。此外，当洗涤步骤在负压下进行时，去细胞化效应得以维持并加强。对于涉及除了间质组织、结缔组织或支持组织外的组织(例如食管、肠、肝、胰腺、肾、脾、肺以及小血管)的方法，所述压力可以不超过80kPa、70kPa、60kPa、50kPa、40kPa、30kPa、20kPa、10kPa、5kPa、2kPa或1kPa。一般来说，用于非间质组织、结缔组织或支持组织的压力高于用于间质组织、结缔组织或支持组织的压力。

[0028] 在一些具体实施方式中，所述方法包含以下步骤：

[0029] a)用核酸酶介质灌注组织1小时与36小时之间；

[0030] b)洗涤组织12小时与72小时之间；

[0031] c)用清洁剂介质灌注组织12小时与36小时之间；和

[0032] d)再用核酸酶介质灌注组织12小时至36小时。

[0033] 组织可以为如上文所述的间质组织、结缔组织或支持组织，或如上文所述的非间质组织、结缔组织或支持组织。

[0034] 步骤a)和d)中的核酸酶介质优选地为相同的核酸酶介质，并且可以包含DNA酶I和RNA酶。

[0035] 举例来说，步骤c)的清洁剂介质可以包含非离子型和离子型清洁剂的混合物，如去氧胆酸钠和Triton X-100(RTM)的混合物。

[0036] 灌注步骤a)、c)以及d)可以在30℃与40℃之间，如在约37℃下进行。洗涤步骤可以在2℃与6℃之间，如约4℃下，或在15℃与40℃之间，如在约37℃或约环境或室温下进行。

[0037] 在步骤d)之后可存在步骤e)，其是将去细胞化组织在1℃与6℃之间，如在约4℃下存储于生理盐水溶液中。生理盐水溶液可以包括抗生素和/或抗霉菌素。

[0038] 步骤a)、c)以及d)均在环境温度下在负压下进行，所述负压可以不超过10kPa、5kPa、2kPa、1kPa或0.5kPa，并且对于间质组织、结缔组织或支持组织优选地不超过0.2kPa，或更优选地不超过0.1kPa，或对于任何其它合适的组织不超过80kPa、50kPa、30kPa或
10kPa。

[0039] 步骤a)到d)中的每一者优选地在环境温度下在负压下进行，所述负压可以不超过10kPa、5kPa、2kPa、1kPa或0.5kPa，并且对于间质组织、结缔组织或支持组织优选地不超过
0.2kPa或更优选地不超过0.1kPa，或对于任何其它合适的组织不超过80kPa、50kPa、30kPa或10kPa。

[0040] 在步骤a)到d)中的任一者之间和/或在步骤d)之后可存在15分钟与72小时之间的其它洗涤步骤。

[0041] 可选地，本发明的第一或第二方面的方法可以包含使所处理的组织交联的步骤。可以使用任何适合的交联剂，例如亚己基二异氰酸酯(hexamethylenediisocyanate；
HMDI)、京尼平(genipin)、槲皮素或肝素中的一者或多者。典型地，在所述方法包括交联步骤的情况下，这一步骤在组织去细胞化之后进行。

[0042] 在植入物由气管制造的情况下，交联特别有用，这是因为其有助于防范气管软化。

[0043] 可以使用所述方法提供基本上去除细胞的基本上去细胞化的支架，所述支架去除足够细胞材料和相关组分以使得在体内不会观测到不良组织反应性或免疫反应。可以通过皮下植入观测到反应性。如通过显微术在40倍放大倍数下可见，基本上去细胞化支架适当地不含细胞。

[0044] 当使用软骨组织时，本发明的方法导致软骨组织去细胞化，以使得去除陷窝内的基本上所有软骨细胞。此外，当软骨材料为气管时，去除了内腔上皮细胞(粘膜)、粘膜下腺体、气管肌以及外膜内的基本上所有细胞核。

[0045] 在组织和整个器官去细胞化方法的当前综述中(克拉波等人(2011)《生物材料》32:3233-3243(Crapo et al.(2011)Biomaterials 32:3233-3243))，提出除了不具有不良体内响应外，以下最低准则足以满足细胞外基质(ECM)去细胞化的要求：每毫克ECM(干重)小于50ng的dsDNA；片段长度<200bp；和在用DAPI或H&E染色的组织切片中不具有可见的细胞核材料。

[0046] 由本发明方法制造的去细胞化组织满足这些准则。

[0047] 保留支架包含ECM，特别是胶原蛋白。优选地，在支架中ECM的结构至少部分得以保留并且优选地基本上得以保留。因此，支架可以包含展示其所源自的天然组织材料的原始纤维架构和分子超微结构的胶原蛋白纤维。优选地，基本上保留这些纤维组织蛋白质的天然三维结构，但在不影响支架完整性结构完整性的情况下可接受一些松开或展开。

[0048] 已经知道的是，仅当去细胞化组织或器官内的纤维的聚合物架构保持至少部分完整时，对支架的来源和/或其植入位置具有特异性的细胞组分将引起ECM的适当构造重塑。因此，与任何合成基质相比，ECM更适于引发功能性再生重塑，并且为组织生长提供成功的支架。

[0049] 功能性ECM蛋白质的保留对于维持支架的生物活性、结构完整性、耐久性以及物理-化学特性也是重要的。维持并且保留从蛋白质和葡糖胺聚糖(GAG)的分子结构到组织的宏观超微结构的结构系统对于固有物理-机械特性是重要的，并且对于组织功能也为重要的。在去细胞化和组织加工过程中保留三维结构又会改善组织的最终细胞重建以及细胞和组织特异性功能的再生。

[0050] 本发明优选地保留ECM源/位GAG，但基本上去除细胞相关GAG。因此，去细胞化过程一般导致总GAG减少，而优选地ECM相关GAG大大地保留。这十分重要，因为ECM GAG与不同细胞类型之间存在“交叉干扰”，从而有助于引导细胞运输和细胞分化。ECM GAG又充当生长因子的存储器或接收器，其有助于在支架/植入物植入之后引导组织再生。

[0051] 一个或多个灌注步骤可以使用包含真空泵或包含与真空产生设备连接的泵装置的装置来进行。所述装置可以包含灌注环路，其可以包括例如经排列以传递去细胞化介质的管、软管、管道等，并且，在包括一个或多个洗涤步骤的本发明方法的具体实施方式中，其还可以用以传递任何洗涤介质。

[0052] 可以提供培育腔室以容纳组织并且可以泵吸去细胞化介质通过培育腔室。

[0053] 根据本发明的第三方面，提供一种根据本发明的第一或第二方面或本文所述的任何方法制造的植入物。

[0054] 根据本发明的第四方面，提供一种根据本发明的第一或第二方面使用如上文所述的装置制造植入物的方法。

[0055] 根据本发明的第五方面，提供一种治疗方法，其包含将如本文所述的植入物以手术方式植入到患者中。

[0056] 根据本发明的第六方面，提供本文所述的植入物在手术中的用途。

[0057] 根据本发明的第七方面，提供一种本文所述的植入物，其用于手术中。

[0058] 根据本发明的第八方面，提供本文所述的植入物的用途，其用于制造用于手术的产品。

附图说明

[0059] 为了可以更清晰地理解本发明及其具体实施方式，现将参考附图仅仅举例描述，其中：

[0060] 图1为展示使用本发明方法的人类气管的(A)对照(非去细胞化)和(B)去细胞化片的宏观外观的照片；

[0061] 图2为展示在去细胞化过程期间使用和不使用真空的去细胞化猪气管的组织学评估的显微照片，其中图像A和D展示存在具有细胞核的完整细胞的正常对照组织(*)，B和E展示在灌注期间不使用负压去细胞化的组织(注意软骨内陷窝的完整软骨细胞(*))，并且C和F展示使用本发明方法进行去细胞化(不存在完整细胞核，并且软骨陷窝为空的(°))；

[0062] 图3展示对照猪组织以及使用和不使用本发明方法去细胞化的猪组织的DNA定量化的结果的条形图，和人类气管对照组织和使用本发明方法去细胞化的组织的DNA定量化的结果的条形图；

[0063] 图4为展示使用本发明方法使人类气管去细胞化的显微照片，其中图像A和C展示正常对照组织(注意完整软骨细胞(*)和外部结缔组织中的细胞核材料(**))并且B和C展示使用本发明方法制备的去细胞化组织(注意软骨陷窝是空的(°))；

[0064] 图5为展示PSR-ME弹性蛋白染色的切片的显微照片，其中图像A到H为在明视场显微光下获取的猪(A和B、E和F)和人类(C和D、G和H)气管组织的图像，I到L(I和J猪，K和L人类)在偏振光下获取，并且其中图像A和E和I、C和G和K中的K对照组织与图像B和F和J、D和H和L中的通过本发明方法制备的去细胞化组织相当。箭头标记展示守恒弹性纤维(e)和胶原蛋白纤维(c)；

[0065] 图6为展示猪和人类气管的对照组织和去细胞化组织的胶原含量的结果的条形图。对于猪组织，包括无真空下去细胞化初始数据(n＝2)。两种物种均展示对照组织与去细胞化气管样品之间无显著差异；

[0066] 图7：为气管组织的一系列SEM图像，其中A、C、E为对照组织，并且图像B、D、F展示使用本发明方法制备的去细胞化气管组织。胶原蛋白束，A到D为猪气管并且E和F为人类气管。标记“*”的箭头展示对照组织中的细胞(图像C)。标记“f”的箭头指向胶原纤维；

[0067] 图8为与根据本发明制造的去细胞化猪(B和F)和人类气管(D和H)相比，猪气管的对照组织(A和E)、人类气管的对照组织(C和G)的爱尔斯蓝(Alcian Blue)染色的显微照片；

[0068] 图9为展示比较对照组织和去细胞化(使用和不使用本发明方法制造的)组织样本，猪和人体组织的定量GAG分析的条形图；

[0069] 图10为用于气管样品的生物力学测试的装置的示意性说明；

[0070] 图11为展示猪对照(A)和根据本发明制造的去细胞化的(C)气管以及人类对照(B)和根据本发明制造的去细胞化的(D)气管组织的MHC-I的免疫染色的图像的显微照片。标记“*”的箭头展示细胞膜的阳性染色，并且标记“°”的箭头标记其中在阳性染色的情况下已预期MHC-I染色的区域。用HLA-1染色的非去细胞化的人类气管示于(E)中。用HLA-1染色的非去细胞化的人类气管示于(F)中。在整个切片中可以看到HLA-1阳性染色；上皮细胞展示强阳性。(G)展示根据本发明制造的去细胞化的人类气管的HLA-1染色(用曙红相反染色)，其展示软骨和胶原非阳性。(H)展示用HLA-1染色过夜和用曙红相反染色的去细胞化人类气管IHC；

[0071] 图12：为展示生物相容性实验的宏观图像的一系列照片。图像A，箭头“t”展示在史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rat)中植入根据本发明制造的人类去细胞化气管样品。图像B展示植入区域(注意箭头“I”)，并且图像C，箭头“s”展示2周后外植入的组织样本；

[0072] 图13：为异种动物模型中，植入根据本发明制造的外植入人类去细胞化气管组织2周之后的H&E染色的显微照片。图片A包括指示下层肌肉(m)和植入的支架(s)的箭头。B和C展示外植入后的图像，并且区域展示具有新血管生成的组织(v)和具有与轻微急性发炎对应的一些嗜中性白细胞的薄纤维胶囊(*)的集成；

[0073] 图14为在植入根据本发明制造的去细胞化人类气管支架到大鼠中2周之后的PSR-ME染色图像的显微照片。箭头展示保留的具有软骨部分(*)和胶原纤维(c)的支架的细胞外基质结构；

[0074] 图15为展示与至多1kba的对照标记相比，根据本发明制备的去细胞化猪和人类气管组织样品的DNA含量的DNA凝胶电泳；

[0075] 图16为根据本发明制造的猪去细胞化肌腱组织的H&E染色的显微照片；

[0076] 图17为在去细胞化过程中不使用负压制造的对照猪去细胞化肌腱组织的H&E染色的显微照片；和

[0077] 图18为H&E染色猪骨骼样品的显微照片。(a)对照样品(在去细胞化过程不施加负压)，放大倍数40倍。(b)对照样品，放大倍数200倍。(c)1％SDS，36hr低渗溶液，真空样品，放大倍数40倍。(d)1％SDS，36hr低渗溶液，真空样品，放大倍数200倍。关键字-(AD)脂肪细胞；(HSC)造血干细胞。(OC)；骨小梁骨骼的陷窝内的骨细胞；(TB)粉红染色的骨小梁骨骼。

具体实施方式

[0078] 实施例

[0079] 实施例1

[0080] 根据本发明制造去细胞化气管支架和对照

[0081] 所有动物的手术和处理在瑙斯韦克公园医学研究协会(Northwick Park Institute for Medical Research；NPIMR)伦理批准后之后根据1986年的英国动物住所管理(United Kingdom Home Office Animals)(科学程序(Scientific Procedures))进行。在标准实验室条件下，从来自不相关研究的长白/兰德瑞斯(Landrace)杂交猪收集气管。在通过麻醉剂过量安乐死之后，收集气管并且新鲜(对照)使用或进行去细胞化。对于去细胞化，去除所有结缔组织并且用汉克斯平衡盐溶液(西格玛-阿尔德里奇(Sigma-Aldrich))冲洗气管。接着将组织存储在-20℃下最少24小时。从英国国民医疗保健署血液和移植司(NHS Blood and Transplant；NHSBT)获得人类气管。从2个无已知气管疾病的供体取得尸体气管。初始转移和存储在-80℃下在汉克斯缓冲溶液中进行。对于去细胞化，接着将两个气管转移到-20℃。根据本发明的去细胞化和对照去细胞化

[0082] 将总共十一(11)个猪气管去细胞化；将七(7)个使用本发明方法去细胞化，而将四(4)个使用完全相同的去细胞化方案但在正常大气压力而不是负压下去细胞化。将两个人类器官使用本发明方法去细胞化。对于每一去细胞化过程，使用最大长度5cm的气管。

[0083] 整个去细胞化过程使用小干燥器(英国西格玛阿尔德里奇)进行。为产生真空(负压)，将干燥器与装备有数字真空计(英国彭德尔制冷批发有限公司(Pendle Refrigeration Wholesale Ltd，UK))的特尔斯达真空泵2F-10(Telstar Vacuum Pump 2F-
10)(英国彭德尔制冷批发有限公司)连接。产生水平为1500微米的真空(读取真空计1500微米等于<1KPa abs)。接着根据方案内所需的温度将干燥器放置于4℃或37℃下的振荡培育器(设定100rpm)中。去细胞化过程期间所用的所有溶液含有1％青霉素/链霉素(英国西格玛-阿尔德里奇)。

[0084] 将组织解冻到室温维持1到2小时，并且接着在37℃下于PBS中含有0.25％Triton X-100(英国西格玛-阿尔德里奇)、0.25％去氧胆酸钠(福鲁卡(Fluka)的清洁剂溶液中培育24小时。接着在4℃到6℃下用汉克斯平衡盐溶液冲洗组织两次持续15分钟。在洗涤之后，在
4℃到6℃下用汉克斯平衡盐溶液培育组织24小时，随后在37℃下与2000KU(孔尼茨单位(Kunitz Unit))/l DNA酶(西格玛-阿尔德里奇)和0.1g/l RNA酶(罗奇)一起培育24小时，以溶解细胞核内含物并且降解DNA。在4℃到6℃下用汉克斯平衡盐溶液再冲洗(两次)之后，培育器官24小时，在4℃下用汉克斯平衡盐溶液洗涤。接着将器官存储在4℃到6℃下的含有
1％抗生素和抗霉菌素溶液的汉克斯平衡盐溶液中，或视进一步分析需要进行处理。总去细胞化过程在负压下进行并且花费4到5天之间，比使用已知去细胞化技术时长基本上更短。

[0085] 植入物/支架分析

[0086] 组织学和免疫组织化学评估：将样品在室温下固定于10％中性缓冲福马林溶液中最少24小时。其用递级醇脱水，包埋于石蜡中并且在切成5μm。用苏木精和曙红染色剂(Haematoxylin and eosin stain；H&E)、爱尔斯蓝、苦天狼星红(Picro-sirius red)以及米勒氏弹性蛋白染色剂(Miller's elastin stains)染色切片。

[0087] 对于免疫组织化学分析，针对包埋的MHC-I免疫染色测试石蜡与冷冻切片，将5μm石蜡切片安置在涂布有(3-胺丙基)三乙氧基硅烷(英国西格玛-阿尔德里奇)的载片之上。用冰冷丙酮固定新鲜冷冻切片10分钟。将石蜡切片脱蜡并且经更换两次二甲苯复水，随后用递减梯度醇冲洗并且用冷自来水冲洗。将载片放置于加湿腔室中，并且在室温下使用含
3％过氧化氢酶的甲醇(英国西格玛-阿尔德里奇)阻断内源性过氧化酶30分钟。对于石蜡切片，在37℃下使用胰蛋白酶进行抗原修复40分钟。在室温下用2.5％马血清(英国彼得伯勒的向量实验室有限公司(Vector Laboratories Ltd.,Peterborough,UK))阻断非特异性结合位点30分钟。在室温下使人体组织切片经历与用磷酸盐缓冲盐水以1:150稀释的单株初级抗体一起培育(用兔/EP1395Y(ab52922)制造的抗人类MHC I类抗体，阿布凯姆，英国(Abcam,UK))1小时。在4℃下将猪组织切片与用磷酸盐缓冲盐水溶液以1:100稀释的初级抗体(抗猪MHCI，H17A，动物健康研究公司,普爾曼，美国(VMRD Inc.Pullman USA))培育过夜。

[0088] 在用PBS洗涤3次，每次洗3分钟之后，在室温下将切片与二次抗体(Impress抗小鼠或Impress抗兔免疫球蛋白G/过氧化酶套组，向量实验室)(Impress anti-mouse or Impress anti-rabbit immunoglobulin G/peroxidase kit,Vector Laboratories)一起培育30分钟。再用PBS洗涤3次，每次洗3分钟之后，在室温下将显色底物二氨基联苯胺(Impact过氧化酶底物，向量实验室)涂覆于切片3分钟。在洗涤之后，用哈里斯苏木精将切片对比染色30秒，之后脱水、清洁、涂覆盖玻片。对于阴性对照，应用相同的方案，然而省去初级抗体，并且使用磷酸盐缓冲盐水溶液。作为阳性对照，使用猪或人类脾。

[0089] 扫描电子显微法(Scanning electron Microscopy；SEM)

[0090] 为定性评估去细胞化基质结构，用含3％(v/v)戊二醛(西格玛-阿尔德里奇)的0.1M磷酸盐缓冲液固定组织样本。

[0091] 接着用蒸馏水洗涤片段，并且用乙醇梯度脱水且在临界点干燥。接着将样本安置于粘附于扫描电子显微法端头并且涂布有金合金的双侧胶带之上，之后获取照片。

[0092] 分子分析

[0093] DNA分析：为了DNA提取和定量化，根据制造商的说明书使用GenElute哺乳动物基因组DNA小规模纯化套组(英国西格玛-阿尔德里奇)。简单来说，将25mg剁碎的新鲜或去细胞化气管组织(人类和猪)的湿组织放置于具有蛋白酶K的微量离心管中，并且于水浴中在55℃下在30分钟时间间隔的涡流下培育4小时。宏观上确定完全消化，并且接着在室温下使样品经历核糖核酸酶A溶液2分钟。在70℃下使样品与来自DNA提取分析套组的溶胞试剂一起培育10分钟。将溶胞物加载到制备型管柱中以结合DNA。在若干个洗涤步骤以移除污染物之后，最终用200μl三乙二胺四乙酸溶液洗脱DNA。使用自动掩蔽石英微量比色管和分光光度计(Heliosα,英国拉夫伯勒的赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific,
Loughborough,UK))在260nm和280nm下读取吸光度并且计算每毫克组织的DNA的绝对量。

[0094] 通过进行DNA 0.8％琼脂糖凝胶电泳确定所提取的DNA的大小、质量以及纯度。在0.5X乙二胺四乙酸三硼酸盐缓冲液中在电极之间在4到5V/cm下运作0.8％琼脂糖凝胶。将相等体积的DNA(2μl)加载到每一孔中。通过用溴化乙锭染色实现显色并且经由紫外线透照法针对1-kb DNA阶梯(Q-Step 4定量DNA阶梯，英国约克郡的约克生物科学有限公司(Yorkshire Bioscience Ltd.,York,UK))测量DNA。

[0095] GAG定量化：使用Blyscan GAG分析套组(生物色彩公司(Biocolor))定量化新鲜和去细胞化的人类和猪气管样品的硫酸化葡糖胺聚糖(sGAG)含量。简单来说，将50mg剁碎的湿组织放置于微量离心管中并且在65℃下与1ml番木瓜酶消化缓冲液一起培育18小时。使每一样品的等分试样与1,9-二甲基-亚甲基蓝染料和来自GAG分析套组的试剂混合。用分光光度计测量656nm下的吸光度，并且通过与由牛气管硫酸软骨素-4制成的标准物的曲线比较计算绝对GAG含量。

[0096] 胶原定量化：用Sircol胶原分析套组(北爱尔兰喀里福古的生物色彩公司(Biocolor,Carrickfergus,Northern Ireland))定量新鲜的和去细胞化的人类和猪气管的胶原含量。简单来说，将50mg剁碎的湿组织放置于具有1.5ml酸-胃蛋白酶提取介质(于0.5mol/l乙酸中的0.1mg/ml胃蛋白酶)的微量离心管中。在4℃下使每一样品的等分试样与酸中和试剂和胶原分离试剂一起培育过夜。接着使样品用来自胶原分析套组的天狼星红染料染色。用分光光度计测量555nm下的吸光度。通过比较由I型牛皮肤胶原蛋白制成的标准物的曲线，计算绝对胶原含量。

[0097] 生物力学测试

[0098] 使样本经历单轴向拉伸直到失效，通过组织中负载损失和裂缝的外观来确定。所述过程示于图10的示意图中。

[0099] 对于每一测试，使用一个打开的气管环(猪或人类，新鲜或去细胞化)。将气管样本(2)打开以形成最大长度33mm的平坦长方形片段(4)，夹持于固持器(8、8')中的夹具(6、6')中并且以100mm/min的恒定拉伸速率和500N的最大力加负载。在室温下用英斯特朗In-Spec 2200台式可携测试仪(Instron In-Spec 2200Benchtop Portable Tester)在施加单轴向拉伸下进行测试。

[0100] 拉伸测试器实时记录组织所经历的负载和伸长率。记录参数，如最大力(N)、断裂力(N)、最大负载下的延伸(厘米)。用弹性材料的硬度测量值计算应力应变比率(杨氏模量(Young's modulus))。

[0101] 去细胞化支架的生物相容性

[0102] 所有手术和动物处理是根据1986的动物(科学程序)法(Animals(Scientific Procedures)Act)和住所管理实务守则(Home Office Code of Practice)进行。寻找相关伦理批准并且被瑙斯韦克公园医学研究协准许。

[0103] 在植入之前，使用紫外光杀菌对每一支架进一步杀菌；使样品暴露于紫外光20min的时段2次。使用总计6只史泊格多利大鼠。在全身麻醉和使用无菌技术下，在腹壁上沿中线切开并且在中线两侧在皮肤与肌肉之间创建小囊袋。接着每一囊袋接收1cm×1cm的去细胞化或非去细胞化气管片。两周后，通过致命剂量的苯巴比妥(penotbarbitone)终结每一动物。将植入的组织外植入并且进行处理以用于组织学评估。

[0104] 统计分析

[0105] 数据计算为平均值+/-标准误差，并且通过进行双尾史都登氏t-检验(2-tailed Student's t-tests)和正常单向方差分析(Ordinary one-way-ANOVA)和邦弗朗尼(邦弗朗尼)事后检验确定显著性(Prism6：加利福尼亚拉荷亚的格拉夫帕德软件公司(Graphpad Software,La Jolla,California))。将p值<0.05视为显著。

[0106] 结果

[0107] 从11个猪和2个人类供体收集气管组织，并且用根据本发明的去细胞化(在下文中“DC”)方法处理。

[0108] DNA分析：

[0109] 在去细胞化之后，宏观上组织呈现无色，这可能是因为去除了红细胞(见图1)。

[0110] 在有和无真空下使猪气管去细胞化以有助于溶液渗透到组织中。对于组织学H&E染色载片，已经历真空辅助去细胞化的组织中完全清除了内腔上皮细胞(粘膜)、粘膜下腺体、气管肌肉以及外膜内的所有完整细胞核，所述真空辅助去细胞化为根据本发明的方法。在软骨内，从陷窝内有效去除所有软骨细胞。然而，不经历真空辅助去细胞化的组织在一些而非所有陷窝内展示完整软骨细胞(图2)。这一观察结果由分子DNA定量化支持，其展示与对照组织相比时有和无真空下去细胞化之后留下的DNA的量显著降低。此外，在非真空与真空辅助方案之间观察到DNA非显著减少(图3：对照n＝7，300.4±27.05ng/mg对无真空去细胞化；n＝3，109.8±37.45ng/mg对真空去细胞化n＝6，36.14±7.834ng/mg，p<0.05)。

[0111] 从组织学上(图4)和用分子DNA分析所有均已经历真空去细胞化的人类气管又展示完全清除整个组织中的所有细胞核材料(对照n＝2，304.4±8.268ng/mg对去细胞化n＝7，50.04±6.003ng/mg，p<0.05，参见图3)。图15又指示去除基本上所有的DNA。

[0112] 胶原评估

[0113] 通过苦天狼星红和米勒弹性蛋白评估来自两个物种的组织展示软骨和胶原的良好保留和形态(图5，A到D)。另外，又保留小微动脉和微静脉内的细小弹性蛋白(图5，E到H)。当在偏振光下观看切片时(图5，I到L)，所有胶原蛋白双折射表示胶原蛋白的良好结构完整性的亮红色-橙色-黄色。

[0114] 关于胶原降解的分子分析，在对照与非真空辅助猪样品之间存在显著减少。在猪对照与通过本发明方法制备的样品未观察到胶原降解减少，根据本发明制造的人类去细胞化组织与对照组织之间也未注意到有任何差异。(猪：对照n＝9，27.8±8.829μg/mg，无真空去细胞化：n＝2，6.774±0.067μg/mg，真空去细胞化：n＝49，23.03±3.897μg/mg，人类：对照n＝3，12.86±3.657μg/mg，去细胞化n＝9，8.186±2.322μg/mg，见图6)。

[0115] 又使用SEM评定胶原超微结构，与对照猪组织相比，根据本发明制造的猪去细胞化组织内的胶原纤维呈现更松散地结合。在人体组织也注意到了相似外观(图7)。

[0116] 支架GAG评估

[0117] 使用爱尔斯蓝组织学染色(图8)和定量分子测试评定保留于来自两种类型的去细胞化支架上的GAG的量的评估。然而，在有真空和无真空的去细胞化过程期间的猪支架损失超过70％的其GAG含量(对照n＝14，488.3±75.61ng/mg对无真空去细胞化n＝10，59.12±11.54ng/mg对真空去细胞化n＝8，47.37±3.921，p<0.05)，人体组织并未展示有大的差异(对照n＝2，44.03±0.89对去细胞化/n＝7，57.64±3.12)

[0118] 生物力学

[0119] 如图10中所示，又对两种类型进行对照与去细胞化(仅根据本发明制备)的生物力学分析。样品如下来制备：获取一个软骨环(2)、将其割开以及去除隔膜部产生均匀长方形组织片(4)，接着将其夹持于样品固持器(8、8')的磨砂纸之间。以下参数中的任一者均未显示有显著差异；拉伸强度、断裂力、断裂伸长率以及杨氏模量，每一者的数据呈现于表1中。

[0120] 表1

[0121]

[0122] 表1：生物力学测试的结果，比较来自猪与人类的对照和去细胞化气管组织(使用本发明的方法)的拉伸强度、断裂力、断裂伸长率以及杨氏模量。

[0123] 生物相容性

[0124] 在进行体内生物相容性研究之前，将来自两物种的去细胞化样品IHC染色以评定其在植入时是否能够引发宿主潜在的免疫响应。将样品染色MHC I/HLA-1。在两物种中在重叠筋膜/外膜中用MHC染色的切片展示阳性。软骨环中可见极少到无染色(如图11中所示)。用MHC1/HLA-1染色的人类切片在软骨、胶原或重叠筋膜中未显示阳性(如图11中所示)。

[0125] 将去细胞化气管小片皮下植入到大鼠中并且保留2周。对于外植入(如图12所示)，仍可以对每一植入样品加以鉴别。如图13中所示，来自植入的去细胞化人类气管的所有组织学切片展示微小发炎性反应-急性并略带慢性(嗜中性白细胞、少量嗜酸性细胞、中等量的巨噬细胞，偶有淋巴细胞的合胞体)。另外，如图14中所示，存在良好新血管形成和良好集成并且细胞外基质呈现为完整的。

[0126] 实施例2

[0127] 制造根据本发明的去细胞化骨骼和肌腱支架和对照

[0128] 组织样本获自不相关的研究中终结的猪。猪均为雌性的，约5个月龄并且重50kg。骨骼样品来自猪跟骨。肌腱样品来自趾长屈肌肌腱。在死后取出样品并且于塑料样品袋中存储在-20℃的冷冻器中，直到需要用于方案中。

[0129] 进行与上文针对气管植入物制造所述类似的方案以在负压条件下使用SDS、TnBP(磷酸三正丁酯)、Triton X-100、DNA酶以及RNA酶作为去细胞化剂制造骨骼和肌腱植入物。又使用不使用负压下通过去细胞化剂灌注的骨骼和肌腱样品对照样品，并且从组织学上分析所得组织。

[0130] 所用方案示于以下表2中并且对于使用本发明方法灌注的组织，所有步骤在0.2kPa的负压下进行，或对于对照组织样品，在环境压力下进行。在表2中所示的每一步骤之间，用去离子水进行三次15分钟洗涤。

[0131] 表2

[0132]

[0133] 表2-骨骼和肌腱组织样品的去细胞化方案步骤。

[0134] 在去细胞化之后，进行苏木精和曙红(H&E)染色以确定是否存在任何剩余细胞核材料。进行苦天狼星红和米勒氏弹性蛋白(P&M)染色以评定ECM内胶原和弹性蛋白纤维的状况。通过光学显微镜在40倍和200倍的放大倍数下获取所有样品的代表性照片。通过非经偏振和偏振光对所有P&M载片进行拍照以有助于突显胶原和弹性蛋白纤维的状况。图16和17展示根据本发明制备的肌腱组织(图16)和对照肌腱组织(图17)的H&E染色的结果。图18展示根据本发明的骨骼组织的H&E染色的结果。

[0135] 在负压条件下根据本发明方法实现从肌腱组织中去除细胞核材料的全去细胞化(图16)，而在环境压力下制备的对照肌腱样品中仍可见细胞核材料(图17)。同样地，可见根据本发明在负压下去细胞化制备的骨骼组织样品基本上不存在细胞核材料，从而留下看得见地空陷窝，如图18的H&E染色样品中所示。

[0136] 实施例3

[0137] 根据本发明制造的去细胞化喉

[0138] 组织样品获自人类尸体并且于塑料袋中存储在-20℃下。

[0139] 使用DNA酶、RNA酶、Triton X-100以及去氧胆酸钠(SOC)作为去细胞化剂对喉样品进行与实施例1中所述类似的方案。所述方法的所有步骤在<1kPa的负压条件下使用如实施例1所述的干燥器和特尔斯达真空泵2F-10，在1500微米下进行。

[0140] 下文所述方案的组分并且所述方案示于以下表3中：

[0141] 溶液制备

[0142] 红海海绵素B(latrunculin B；Lat B)粉末形式-1mg Lat B 395,51g/mol。

[0143] 向这一物质中添加25ml高葡萄糖DMEM，由此制造100μM储备溶液，等分到25个1ml管中并且存储在-20℃的冷冻器中。

[0144] 1.在高葡萄糖DMEM(4500mg葡萄糖)中的50nM红海海绵素B(Lat B)-在100ml高葡萄糖DMEM(达尔伯克氏改良的伊格氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))中的50μl Lat B。

[0145] 2.0.25％Triton X和0.25％SOC-向1升PBS中加入2.5g去氧胆酸钠溶液(SOC)和2.5ml Triton X。

[0146] 3.PBS-将5个PBS片剂加入到1升去离子水中。

[0147] 4.加入到有钙和镁的汉克斯平衡盐溶液-来自西格玛阿尔德里奇H6648。

[0148] 5.0.6M氯化钾(KCl)-向1升PBS中加入44.73g KCl

[0149] 6.1M碘化钾(KI)-向1升PBS中加入166g KI

[0150] 7.培育缓冲液-向1升PBS中加入0.5g氯化镁(MgCl2)、0.055g氯化钙(CaCl2)，在即将使用之前将DNA酶添加到所需体积的培育缓冲液中。

[0151] 8.DNA酶-将1小瓶含有2000ku酶的DNA酶混入1升去离子水中。将5ml水放置于DNA酶小瓶中并且等分到5个1ml Eppdorff管中。将1ml所制备的酶溶液用于200ml培育缓冲液中。

[0152] 9.RNA酶-使100ml培育缓冲液与0.01g RNA酶混合。

[0153] 表3

[0154]

[0155] 制造全去细胞化和去除细胞核材料的去细胞化喉组织的方案的结果。

[0156] 以上具体实施方式仅举例来描述。在不脱离如随附申请专利范围所定义的本发明的范围的情况下，许多改变均为可能的。