2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和肝纤维化防治中的应用

摘要

本发明属于医药领域，涉及2‑苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和肝纤维化防治中的应用，通过对I型胶原蛋白α1基因COL1A1启动子活性的抑制作用、对TGFβ1诱导人肝星状细胞LX2中纤维化相关基因和/或蛋白表达的抑制作用、对化学诱导剂所致肝损伤的保护作用、对胆总管结扎(BDL)模型组大鼠血清生化指标、肝脏病理结构、肝脏组织羟脯氨酸含量、肝纤维化相关基因和/或蛋白表达的影响等研究结果表明，2‑苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物具有良好的肝损伤保护作用和抗肝纤维化活性，安全性较高，有望发展成为肝损伤保护、肝纤维化防治的有效药物。

权利要求

1.2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在制备肝损伤保护和肝纤维化防治药物中的应用；

所述2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物为N-（3,4,5-三氯苯基）-2-（3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺、N-（2,4-二氯苯基）-2-（3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺或N-（2,4-二氯苯基）-2-（3-三氟甲氧基苯磺酰胺基）苯甲酰胺。

2.根据权利要求1所述化合物为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备肝损伤保护和肝纤维化防治药物中的应用。

3.根据权利要求1所述化合物为主要原料在制备肝损伤保护和肝纤维化预防保健品中的应用。

4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征是，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物制成口服剂型和非口服剂型；所述口服剂型为片剂、胶囊、散剂或颗粒，所述非口服剂型为注射液针剂。

5.根据权利要求1、2或3 所述的应用，其特征是，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物给药剂量根据病情轻重、患者年龄、给药方式及疗程因素调整改变。

说明书

2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和肝纤维化防

治中的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于医药领域，涉及2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝病防治中的应用。背景技术：

[0002] 慢性肝病是威胁人类健康的一个重要问题，每年死于慢性肝病的人数接近80万。急慢性肝损伤都会导致肝纤维化(Liver fibrosis)的产生。肝纤维化是肝脏内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，特别是Ⅰ型胶原α1过度沉积的病理过程，其细胞学基础是肝星状细胞的活化。肝纤维化是机体对肝损伤的一种修复反应。这种自我修复并不完美，肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化、肝功能衰竭及门脉高压，并最终需要肝移植来延续生命。著名的肝病专家Rogking在对肝纤维化进行深入研究后提出，人典型的肝纤维化是可以逆转的，而一旦发展到中晚期肝硬化则无法逆转。由于肝纤维化是各种慢性肝病的共有病理改变，也是肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，因此，研究如何控制纤维化进程，在各种慢性肝病、肝硬化甚至肝癌的治疗和预防中具有重要的意义。随着对肝纤维化产生机制及病理过程研究的深入，发现了越来越多抗肝纤维化的潜在作用靶点，如TGFβ1及其受体、TIMP1、TLR4、整合素αv、大麻素受体(cannabioniod receptor)、内皮素A受体(endothelin A receptor)、Smad7、IL-1/4/6、PDGF、FGF、VEGF、Toll样受体(TLR)、AT1R、mTOR等。但是，目前除针对病因治疗外，仅有中国批准了两种中药——复方鳖甲软肝片和扶正化瘀胶囊用于其治疗，其中复方鳖甲软肝片正在进行Ⅳ期临床试验，而扶正化瘀胶囊已在国内完成Ⅳ期临床试验，目前已经通过美国FDA的临床II期实验。除此之外，国际上尚无其它药物被批准用于肝纤维化的治疗。我国是一个肝病高发国家，现有1.2亿HBsAg携带者,
3000万慢性HBV患者需要治疗。慢性HBV病人经过5～20年后约有12％可发展为肝硬化。此外丙肝、酒精肝、脂肪肝和药物性肝炎等的发病率也在逐年上升。因此，肝损伤保护和肝纤维化新药的研发迫在眉睫。

[0003] 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物，是课题组王菊仙副研究员等以Baringhaus等人筛选的ASBT抑制剂S-1647为先导化合物，经结构改造得到的一系列新型苯磺酰胺基苯甲酰胺类衍生物。目前，据文献报道，该类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗胆固醇等活性。近年来，本实验室利用已构建的基于Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子药物筛选靶标的抗肝纤维化药物细胞筛选模型，对2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物抗纤维化活性进行研究，发现该类化合物对COL1A1启动子具有不同程度的抑制作用，表明该类化合物具有潜在的抗肝纤维化活性。本实验室以N-(3,4,5-三氯苯基)-2-(3-硝基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(16-4)、N-(2,4-二氯苯基)-2-(3-硝基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(16-5)和N-(3,4-二氯苯基)-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(17-15)为代表化合物，对其体外抗肝纤维化作用进行了深入地研究，并在考察化合物安全性的基础上，从体内动物模型中进一步验证了化合物16-4和16-5对化学诱导剂α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)所致肝损伤的保护作用以及16-4抗胆管结扎肝纤维化作用。本实验研究所述2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物的肝损伤保护作用和抗纤维化活性，迄今尚未见有国内外的相关报道。发明内容：

[0004] 本发明提供了2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和制备抗肝纤维化药物或保健品中的应用。

[0005] 本发明以Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子作为药物筛选靶标，将本实验室构建的COL1A1荧光素酶质粒pGL4.17-COL1A1与Renailla质粒共转染人肝星状细胞LX2，利用双荧光素酶报告系统发现2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物对COL1A1启动子均具有不同程度的抑制作用。为确定该类化合物的体外抗肝纤维化作用，本发明以N-(3,4,5-三氯苯基)-2-(3-硝基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(16-4)、N-(2,4-二氯苯基)-2-(3-硝基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(16-5)和N-(3,4-二氯苯基)-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基)苯甲酰胺(17-15)为代表化合物，在人肝星状细胞LX2上进行体外抗肝纤维化实验研究。利用Real-time PCR、Western Blot实验证明，三个化合物均能显著地抑制经TGFβ1诱导活化的LX2细胞中肝纤维化主要标志物mRNA水平和蛋白水平的表达。为进一步评价化合物体内药效，本发明首先采用2000mg/kg剂量水平进行急性毒性试验评估药物毒性，结果显示，给药14天后各组小鼠体重无明显下降，并且无中毒迹象及死亡发生，表明药物安全性较高，这不仅为化合物体内药效学评价提供了依据，也为该类化合物开发成为药物或保健品奠定了基础。本发明体内药效学实验，首先是利用化学诱导剂α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)肝损伤模型，评价16-4和16-5的肝损伤保护作用。肝组织病理切片染色结果表明，16-4和16-5均能缓解ANIT诱导的肝损伤。与此同时本发明还利用胆总管结扎(BDL)肝纤维化模型，系统分析了16-4给药后对模型组动物肝功能、肝组织病理改变、肝组织纤维化程度、胶原纤维含量及肝纤维化相关标志物的影响，结果显示，16-4能改善模型组大鼠肝功能和肝脏病理改变，降低肝纤维化的程度，延缓肝纤维化的发生和发展。

[0006] 本发明用于肝损伤保护和肝纤维化防治时，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物口服或非口服给药均属安全有效的。口服用药可以制成任何常规剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒等；非口服用药，可制成注射液针剂等。

[0007] 本发明所述2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物给药剂量，可根据给药方式、患病程度、患者年龄，有无既往病史等因素综合考虑进行调整。

[0008] 本发明用于肝损伤保护和制备抗肝纤维化药物或保健品时，其辅料及制备方法可选用药学上可接受的任何形式。附图说明：

[0009] 图1-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性的抑制作用

[0010] 其中：*p<0.05，**p<0.01与对照组(给药浓度为零)相比。

[0011] 图2-Real-time PCR检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对肝纤维化主要标志物mRNA水平的影响

[0012] 其中：*p<0.05，**p<0.01与对照组(未诱导活化的LX2细胞)相比，#p<0.05，##p<0.01与TGFβ1诱导组(给药浓度为零)相比。

[0013] 图3-Western Blot检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对肝纤维化主要标志物蛋白水平的影响

[0014] 图4-小鼠急性毒性试验评价2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、17-15安全性[0015] 其中：A图为16-4给药组小鼠体重变化情况；B图为17-15给药组小鼠体重变化情况；相对体重＝第14天体重/第1天体重。

[0016] 图5-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5对α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)所致肝损伤的保护作用

[0017] 其中：A为对照组(未加ANIT)小鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为ANIT模型组小鼠肝脏组织切片HE染色结果；C为16-4给药组小鼠肝脏组织切片HE染色结果；D为16-5给药组小鼠肝脏组织切片HE染色结果。

[0018] 图6-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠肝脏病理变化的影响[0019] 其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；C为16-4给药组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；D为对所有动物组织HE染色双盲评分的统计图；**p<0.01与假手术组相比；##p<0.01与BDL模型组相比。

[0020] 图7-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠肝纤维化程度的影响[0021] 其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片Masson染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织切片Masson染色结果；C为16-4给药组大鼠肝脏组织切片Masson染色结果；D为对所有动物组织Masson染色双盲评分的统计图；**p<0.01与假手术组相比；##p<0.01与BDL模型组相比。

[0022] 图8-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响[0023] 其中：**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05与BDL模型组相比。

[0024] 图9-Real-time PCR检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织中肝纤维化相关基因表达的影响

[0025] 其中：**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05，##p<0.01与BDL模型组相比。图10-Western Blot检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织中肝纤维化主要蛋白表达的影响具体实施方式：

[0026] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。

[0027] 《实施例1》双荧光素酶报告系统检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15抑制Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性试验

[0028] 在37℃，5％CO2条件下，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)培养人肝星状细胞LX2。待细胞汇合度约95％后，以每孔2×104个细胞铺于96孔白板。待细胞汇合度约90％，换成不含胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)无血清培养24h，用Lipo2000将pGL4.17-COL1A1与Renailla质粒共转染LX2细胞，转染6h后加TGFβ1(2ng/ml)诱导，同时加入不同浓度的16-4、16-5、17-15，浓度分别为1μmol.L-1、5μmol.L-1、10μmol.L-1，每组实验设至少3个复孔，继续培养24h。按照Dual-GloTM Luciferase Assay System说明书操作步骤，吸弃培养基，PBS漂洗一遍。加入1x PLB 20μL/孔，裂解细胞(15min内)，加入荧光素酶底物50μL/孔进行检测，加入终止反应液50μL/孔进行检测。结果显示，随着16-4、16-5、17-15浓度的升高，荧光强度明显减弱。表明，16-4、16-5、17-15可以剂量依赖性地抑制COL1A1启动子的活性(图1)。

[0029] 《实施例2》2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15体外抗肝纤维化活性试验

[0030] 2.1 TGFβ1诱导LX2细胞，在含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基，37℃，5％CO2条件下培养LX2细胞。按照每孔1×105个细胞铺于6孔板，培养24小时后，弃去原培养基，PBS漂洗一遍，加入不含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基。饥饿培养24h后，加入TGFβ1(2ng/ml)和不同浓度的16-4、16-5、17-15，浓度分别为1μmmol/L、5μmmol/L、10μmmol/L，同时设置对照组(不加入TGFβ1诱导)和TGFβ1诱导组(仅加入TGFβ1)，继续培养24小时后收取不同处理样品。

[0031] 2.2  Real-time PCR，按照TRizol法提取LX2细胞总RNA，并根据Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作步骤将LX2总RNA逆转录为cDNA。将所得的cDNA、无菌水、Roche FastStart Universal Probe Master(Rox)以及ABI TaqMan probes(COL1A1,TGFβ1,MMP2)配制成20μL反应体系，使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行检测。结果显示，16-4、16-5、17-15可以明显抑制COL1A1、TGFβ1、MMP2mRNA水平的表达(图2)。

[0032] 2.3 Western blot，RAPI裂解液(含1％PMSF)提取LX2细胞蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。以20μg/20μL上样，经聚丙酰胺凝胶电泳、转膜、5％脱脂牛奶封闭、一抗孵育、PBST漂洗、二抗孵育，使用ChemiImager 5500 imaging system显影。结果显示，16-4、16-5、17-15可以明显抑制COL1A1、TGFβ1、MMP2、α-SMA蛋白的表达(图3)。

[0033] 《实施例3》昆明小鼠急性毒性试验

[0034] 将昆明小鼠(体重在18-22g)随机分为对照组、16-4给药组、17-15给药组，每组4只，给药剂量为0mg/kg、50mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg。实验第一天，16-4、17-15给药组灌胃给药后(对照组给生理盐水)，每天记录小鼠体重，身体状况(如呼吸是否急促、皮肤是否出现出血点等)以及是否有死亡。连续观察14天后，处死小鼠。结果显示，给药
14天各组小鼠体重无明显下降(图4)，且无中毒迹象及死亡发生，表明药物安全性较高。

[0035] 《实施例4》α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)肝损伤模型[0036] 将昆明雌性小鼠(体重在22-25g)随机分为对照组、ANIT诱导组、16-4(400mg/kg)给药组、16-5(400mg/kg)给药组，每组10支。对16-4、16-5给药组灌胃给药5天后(对照组、ANIT诱导组给生理盐水)，饥饿处理12h后，ANIT诱导组，16-4给药组、16-5给药组进行ANIT诱导(75mg/kg灌胃)，同时对照组灌胃玉米油。在给药2天，即ANIT诱导48时后收取肝组织，进行病理切片HE染色。结果显示，16-4、16-5给药组与ANIT诱导组相比，肝损伤程度得到改善(图5)。表明，16-4、16-5具有肝损伤保护作用。

[0037] 《实施例5》SD大鼠胆总管结扎肝纤维化模型的制备及16-4给药处理

[0038] 将SD雄性大鼠(体重在180-200g)随机分为假手术组、BDL模型组、16-4(100mg/kg)给药组，其中假手术组5只，BDL模型组9只，16-4给药组9只。动物手术前禁食12h，用异氟烷麻醉后，在无菌操作条件下，开腹，抬高肝缘，拉开十二指肠，分离总胆管2-3cm。在近十二指肠处和近肝门处用000号丝线各结扎两道，从两结扎位置中间剪断胆总管，将肝恢复原样后缝合切口。假手术组仅开腹，然后缝合。动物麻醉清醒后，正常饮食，自由饮水。手术后第2天腹腔注射16-4(100mg/kg)，假手术组和BDL模型组腹腔注射生理盐水，每天1次，给药14天后，禁食12h后收取尿液，血液，胆汁，肝，肾，回肠等样品。

[0039] 《实施例6》16-4对BDL大鼠血清肝功能的影响。

[0040] 取样前禁食12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置1h，3000rpm离心5min，取血清进行血清生化指标检测。结果显示，16-4能够降低谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)的活性(表1)，表明16-4能够改善BDL大鼠肝功能。

[0041] 表1. 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠血清肝功能的影响[0042]

[0043] 其中：**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05与BDL模型组相比。

[0044] 《实施例7》16-4对BDL大鼠肝脏病理结构改变的影响

[0045] 取样前禁食12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放入4％中性甲醛溶液中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。利用苏木素-伊红(HE)染色液进行染色，观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示，假手术组大鼠肝脏组织肝细胞规则排列，肝小叶完整，无炎性细胞浸润和胆管增生情况；BDL后大鼠肝脏组织病理结构发生明显改变，胆管增生十分明显，组织坏死明显增多；16-4给药组大鼠肝组织结构得到明显改善，胆管增生情况得到显著抑制，组织坏死程度明显降低(图6)。表明，16-4能够明显改善BDL大鼠肝脏组织病理结构的改变。

[0046] 《实施例8》16-4对BDL模型大鼠肝纤维化的抑制作用

[0047] 8.1 Masson染色是胶原纤维特异性染色，将石蜡切片用Masson染色，观察大鼠肝脏组织纤维化情况。结果显示，BDL大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，16-4给药后，纤维化程度得到明显抑制(图7)。表明，16-4能够明显抑制肌原纤维的产生，抑制BDL大鼠肝纤维化。

[0048] 8.2 羟脯氨酸为胶原纤维中特有，羟脯氨酸含量可以反映肝纤维化的程度。取肝脏组织(80-100mg)，按照羟脯氨酸测试盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书进行肝脏组织中羟脯氨酸含量测定。结果显示，与假手术组相比，BDL模型大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显升高；16-4给药后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显降低(图8)。表明，16-4能够明显抑制BDL大鼠中胶原纤维的产生，抑制肝纤维化的发生。

[0049] 《实施例9》16-4对BDL大鼠肝脏组织肝纤维化相关标志物的抑制作用

[0050] 9.1 Real-time PCR法检测肝脏组织中肝纤维化相关基因的表达。取肝脏组织(80-100mg)，加入1mLTRizol于冰浴中进行组织匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清提取总RNA，并根据Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作步骤，将LX2总RNA逆转录为cDNA。将所得的cDNA、无菌水、Roche FastStart Universal Probe Master(Rox)以及ABI TaqMan probes配制成20μL反应体系，使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行检测。结果显示，与假手术组相比，BDL模型组大鼠肝脏组织中肝纤维化相关基因(Col1a1、Tgfβ1、Mmp2、α-smoothmuscleactin(Acta2)、Timp1、Timp2、Spp1)表达水平明显增加，16-4给药后可以明显降低肝纤维化相关基因的表达(图9)。

[0051] 9.2 Western blot检测肝脏组织中肝纤维化相关蛋白的表达。取肝脏组织(80-100mg)，加入1mLRAPI裂解液(含1％PMSF)于冰浴中进行组织匀浆，12000rpm，4℃离心
10min，取上清，并用BCA法测定蛋白浓度。以50μg/20μL上样，经聚丙酰胺凝胶电泳、转膜、
5％脱脂牛奶封闭、一抗孵育、PBST漂洗、二抗孵育，使用ChemiImager 5500 imaging system显影。结果显示，16-4可以明显抑制COL1A1、TGFβ1、MMP2、α-SMA蛋白的表达(图10)。
9.1和9.2实验表明，16-4具有良好的抗肝纤维化活性。