本发明提供了一种下式所示的岩藻聚糖硫酸酯以及其制备方法和用途。经体外实验证明，所述岩藻聚糖硫酸酯可显著抑制新生血管的生成，从而实现抗肿瘤活性。进一步研究表明，所述岩藻聚糖硫酸酯抗血管生成是通过与血管生成中关键细胞因子BMP4结合，抑制其信号通路而实现的。所述岩藻聚糖硫酸酯有望成为预防或治疗肿瘤的潜在多糖药物。
其中，a为17.6mol％，b为45.0mol％，c为16.6mol％，d为20.8mol％，R为结构式如下的基团：
其中，m为4，n为5，o为3，p为4，q为7，r为4，并且乙酰基的位置是α-L-1,3-Fucp4S的C2位或α-L-1,3-Fucp的C2位，其中，Fuc代表岩藻糖，GlcA代表葡萄糖醛酸，Man代表甘露糖，
其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量范围为10-350kD，以及
其中，所述岩藻聚糖硫酸酯含有甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基和乙酰基，它们的摩尔比为3.0:14.4:82.6:34.3:13.9。
2.根据权利要求1所述的岩藻聚糖硫酸酯，其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量范围为100-280kD。
3.根据权利要求1所述的岩藻聚糖硫酸酯，其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量范围为150-250kD。
4.权利要求1所述的岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于，所述岩藻聚糖硫酸酯是从海蕴中提取出的多糖。
5.一种制备根据权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯的方法，该方法包括以下步骤：a.多糖提取：干燥的海蕴经乙醇脱脂后用20℃-90℃水提取，提取液过滤后浓缩得到浓缩液，向浓缩液中加入乙醇至乙醇体积浓度为40％-90％得到沉淀，将沉淀干燥后得水提粗多糖；
b.多糖纯化：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1-
0.5M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤a为：干燥的海蕴经乙醇脱脂后用50℃-
80℃水提取，提取液过滤后浓缩得到浓缩液，向浓缩液中加入乙醇至乙醇体积浓度为80％得到沉淀，将沉淀干燥后得水提粗多糖。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1-0.4M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.15-0.3M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.2M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
10.根据权利要求5所述的方法，该方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的褐藻海蕴经乙醇脱脂，风干，用20℃-90℃去离子水提取，过滤，残渣再次用所述去离子水提取，如此反复提取4-20次，滤液合并，加热浓缩，透析，再浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为40％-90％，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇和无水丙酮依次洗涤后，真空干燥得水提粗多糖；
b.多糖纯化：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1-0.5M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述步骤a为：干燥的褐藻海蕴经乙醇脱脂，风干，用50℃-80℃去离子水提取，过滤，残渣再次用所述去离子水提取，如此反复提取4-20次，滤液合并，加热浓缩，透析，再浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇和无水丙酮依次洗涤后，真空干燥得水提粗多糖。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1-0.4M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.15-0.3M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述步骤b为：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.2M NaCl水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱纯化得到所述岩藻聚糖硫酸酯。
15.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备预防或治疗肿瘤的药物组合物或保健品中的用途。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯以及任选的辅料。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，所述辅料包括常规药物载体、赋形剂和/或填料。
18.一种保健品，其包含权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯以及任选的常规食品添加剂。
19.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制BMP4的表达的药物组合物或保健品中的用途。
20.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制Smad1/5/8的磷酸化的药物组合物或保健品中的用途。
21.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于阻断BMP4/Smad信号通路的药物组合物或保健品中的用途。
22.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制BMP4诱导的管腔形成的药物组合物或保健品中的用途。
23.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制表皮血管内皮细胞的生长和迁移的药物组合物或保健品中的用途。
24.权利要求1-3中任一项所述的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抗血管生成的药物组合物或保健品中的用途。
一种岩藻聚糖硫酸酯、其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及提取多糖，更具体地说，涉及一种岩藻聚糖硫酸酯、其制备方法及在制备用于预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤是威胁全世界人民健康的头号杀手。每年因肿瘤死亡的人数位居所有疾病之首。随着环境的恶化以及人民生活压力的增加，肿瘤的发病率有逐年升高的趋势。治疗肿瘤的策略有很多。抑制血管生成就是治疗肿瘤的一种有效的策略。自从1971年Folkman提出通过抑制新生血管生成来治疗肿瘤的思路后，人们对于肿瘤治疗的思路得到了极大的拓宽。目前已有一些小分子和生物大分子成为通过抗血管生成来治疗肿瘤的药物。
[0003] BMP(bone morphogenetic protein，骨形成蛋白)是一类属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的细胞因子。最初研究人员发现BMP能促进骨的形成，所以把这一类氨基酸序列同源性高、结构相似的生长因子称为骨形成蛋白。但是后续深入的研究表明，这一类蛋白不仅仅是与骨形成有关，它还与各种细胞的分化、器官形成有密切关系。通过抑制BMP4的信号通路，可以抑制新生血管生成，实现抗肿瘤的目的。
[0004] 多糖物质是海蕴藻体的重要组成部分，目前研究较少。现有的研究仅限于海蕴岩藻聚糖硫酸酯结构的初步表征，并不了解其详细结构，并且没有关于海蕴来源的岩藻聚糖硫酸酯的生物活性的报道。
发明内容
[0005] 本申请的发明人经过广泛深入的研究，利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，从海蕴(Nemacystus decipiens)提取获得了一种岩藻聚糖硫酸酯。药理实验表明，所述岩藻聚糖硫酸酯可以剂量依赖性地抑制HMEC-1细胞的迁移和管腔形成，其作用机制是与BMP4结合并抑制下游信号通路，同时下调BMP4的表达水平，具有潜在的预防或治疗肿瘤的作用。
[0006] 因此，本发明的一个方面是提供一种岩藻聚糖硫酸酯，其结构式如下：
[0007]
[0008] 其中，a为约17.6mol％，b为约45.0mol％，c为约16.6mol％，d为约20.8mol％，[0009] R为结构式如下的基团：
[0010]
[0011] 其中，m为4，n为5，o为3，p为4，q为7，r为4，并且乙酰基的位置可以是α-L-1,3-Fucp4S的C2位或α-L-1,3-Fucp的C2位，
[0012] 其中，Fuc代表岩藻糖，GlcA代表葡萄糖醛酸，Man代表甘露糖。
[0013] 图6显示了根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯的结构式的放大图。
[0014] 上式和图6中，α和β代表糖苷键连接的两种构型，D和L代表单糖的构型，p代表糖环是吡喃型，箭头代表一个化学键，箭头两边的数字代表糖苷键的成键位置。括号外面字母代表的数字是相应基团的摩尔比。
[0015] 其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量范围为约10-350kD，优选为约100-280kD，更优选为约150-250kD。
[0016] 所述岩藻聚糖硫酸酯含有甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基和乙酰基，它们的摩尔比为约3.0:14.4:82.6:34.3:13.9。
[0017] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图1中的主要伸缩振动吸收峰一致的红外图谱，其中，在所述岩藻聚糖硫酸酯的红外图谱中，3447.1cm-1附近为O-H伸缩振动吸收峰，-1 -12928.4cm 附近为C-H伸缩振动吸收峰，1000-1400cm 附近为C-O和糖环振动信号，
1256.4cm-1附近是O＝S＝O伸缩振动吸收峰。
[0018] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图2中的主要信号值一致的13C-NMR谱，其中，在所述岩藻聚糖硫酸酯的13C-NMR谱中，位于δ175.75的信号是葡糖糖醛酸的羧基碳信号，位于δ174.51的信号是岩藻糖上乙酰基的羰基碳信号，位于δ91-δ103的端基碳信号分别为末端岩藻糖、1,4-岩藻糖、1,3-岩藻糖、1,3,4-岩藻糖、1,2-甘露糖、1,2,3-甘露糖、1,2,4-甘露糖、1,2,6-甘露糖和末端甘露糖的C1信号；在δ16.29左右为岩藻糖甲基碳的信号峰；在δ21.29处为乙酰基甲基碳的信号峰。
[0019] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图3中的主要信号值一致的1H-NMR谱。其中，在所述岩藻聚糖硫酸酯的1H-NMR谱中，位于δ5.0-5.7的信号是异头氢的信号，位于δ3.25-4.65的信号是糖环上的氢的信号，位于δ2.28附近的信号是典型的乙酰基上甲基氢的信号，位于δ1.30附近的信号是岩藻糖H6的信号。根据δ2.28附近的信号和δ1.30附近的信号的积分面积比可知，乙酰基与岩藻糖的摩尔比为0.168:1。由于岩藻糖占总糖的摩尔分数是
82.6％。所以可以换算出乙酰基与总糖的摩尔比是0.139:1。从上述结果可以发现本发明的岩藻聚糖硫酸酯是一种乙酰化的岩藻聚糖硫酸酯。
[0020] 优选地，本发明的岩藻聚糖硫酸酯是从海蕴(Nemacystus decipiens)中提取出的多糖。
[0021] 本发明的另一方面是提供所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0022] a.多糖提取：干燥的海蕴经乙醇脱脂后用约20℃-90℃(优选约50℃-80℃，更优选约80℃)水提取，提取液过滤后浓缩得到浓缩液，向浓缩液中加入乙醇至乙醇浓度为约40％-90％(V/V)(优选约80％(V/V))得到沉淀，将沉淀干燥后得水提粗多糖；
[0023] b.多糖纯化：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱(例如，Q sepharose Fast Flow)进行分级纯化，依次用水和约0.1-0.5M NaCl(优选约0.1-0.4M，更优选约0.15-0.3M，最优选约0.2M NaCl)水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱(例如，Sephacryl S-300HR)纯化得到根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯。
[0024] 更具体地，本发明提供的岩藻聚糖硫酸酯的制备方法包括以下步骤：
[0025] a.多糖提取：干燥的褐藻海蕴经乙醇脱脂，风干，用约20℃-90℃(优选约50℃-80℃，更优选约80℃)去离子水提取，过滤，残渣再次用所述去离子水提取，如此反复提取4-20次，滤液合并，加热浓缩，透析，再浓缩，加入乙醇至乙醇浓度为约40％-90％(V/V)(优选约80％(V/V))，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇和无水丙酮依次洗涤后，真空干燥得水提粗多糖；
[0026] b.多糖纯化：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱(例如，Q sepharose Fast Flow)进行分级纯化，依次用水和约0.1-0.5M NaCl(优选约0.1-0.4M，更优选约0.15-0.3M，最优选约0.2M NaCl)水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化多糖再经凝胶色谱(例如，Sephacryl S-300HR)纯化得到根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯。
[0027] 根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯能与BMP4强烈结合，显著地抑制BMP4的表达，并且通过显著地抑制Smad1/5/8的磷酸化而阻断BMP4/Smad信号通路，从而抑制BMP4诱导的管腔形成，由此能够抑制表皮血管内皮细胞的生长和迁移，具有抗血管生成活性，进而能够用于预防或治疗肿瘤。
[0028] 因此，本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制BMP4的表达的药物组合物或保健品中的用途。
[0029] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制Smad1/5/8的磷酸化的药物组合物或保健品中的用途。
[0030] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于阻断BMP4/Smad信号通路的药物组合物或保健品中的用途。
[0031] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制BMP4诱导的管腔形成的药物组合物或保健品中的用途。
[0032] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制表皮血管内皮细胞的生长和迁移的药物组合物或保健品中的用途。
[0033] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抗血管生成的药物组合物或保健品中的用途。
[0034] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备预防或治疗肿瘤的药物组合物或保健品中的用途。
[0035] 本发明的再一方面是提供一种药物组合物，其包含上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯以及任选的常规药物载体、赋形剂、填料和/或辅料等。
[0036] 本发明的再一方面是提供一种保健品，其包含上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯以及任选的常规食品添加剂。
[0037] 本发明的又一方面是提供一种预防或治疗肿瘤的方法，其包括给具有该需要的对象服用上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯或者根据本发明的药物组合物。附图说明：
[0038] 图1为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01的IR谱图；
[0039] 图2为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01的13C-NMR谱图；
[0040] 图3为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01的1H-NMR谱图；
[0041] 图4A为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制HMEC-1细胞在基质胶上的管腔形成的代表图，图4B为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01对HMEC-1细胞存活率影响的曲线图，图4C为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制HMEC-1细胞的划痕愈合，图4D为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01对HMEC-1细胞迁移率影响的柱状图；
[0042] 图5A为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01与BMP4结合的传感图，图5B为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制HMEC-1细胞中BMP4的mRNA表达量的电泳图及蛋白水平表达量的免疫印迹图，图5C为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制HMEC-1细胞中BMP4诱导的管腔形成的代表图，图5D为根据本发明实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制HMEC-1细胞中BMP4诱导的Smad1/5/8磷酸化的免疫印迹图。
[0043] 图6为根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯的结构式的放大图。
具体实施方式
[0044] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。
[0045] 海蕴新鲜藻体购自华昱海藻食品有限公司，本专利申请所用试剂如无特殊表明，均来自国药集团，AR级别纯度。
[0046] 实施例1：岩藻聚糖硫酸酯NDH01的制备
[0047] a.多糖提取：
[0048] 干燥的海蕴，用三倍体积95％的乙醇脱脂一周，每两天换一次乙醇，然后海蕴在室温自然干燥。干燥后的海蕴750g粉碎后，用80℃热水(去离子水)10升提取10次，每次4h，提取时一直机械搅拌。硫酸-苯酚检测至无明显反应，过滤，将每次的提取液合并后加热浓缩至3升，在搅拌下加入95％乙醇16L，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀用2倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离，沉淀再用两倍体积的无水丙酮洗涤，离心，沉淀置40℃下真空干燥，得水提岩藻聚糖硫酸酯NDH 22.3g。
[0049] b.多糖纯化：
[0050] 将步骤a得到的水提岩藻聚糖硫酸酯NDH 5g搅拌溶解，离心取上清液，上清液用Q sepharose Fast Flow强阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.2M NaCl洗脱，以硫酸-苯酚检测洗脱曲线，收集0.2M NaCl洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥得纯化多糖NDH01.87g。NDH01.6g溶解后再经Sephacryl S-300HR凝胶色谱纯化，以硫酸-苯酚检测洗脱曲线，收集主要组份，得到均一的岩藻聚糖硫酸酯NDH011.04g。
[0051] c.多糖结构鉴定和解析：
[0052] 经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定岩藻聚糖硫酸酯NDH01多糖相对分子质量为216kDa。
[0053] 将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入GC分析。单糖组成分析结果显示，岩藻聚糖硫酸酯NDH01主要含甘露糖(3.0％)、葡萄糖醛酸(14.4％)和岩藻糖(82.6％)。
[0054] 通过氯化钡-明胶法测定发现NDH01是高度硫酸化的岩藻聚糖。
[0055] 结合红外和核磁共振分析(参见图1、2和3)，确定NDH01为带有乙酰基的岩藻聚糖硫酸酯。
[0056] 硫酸基含量测试表明硫酸基与总糖的摩尔比例是0.343:1。
[0057] 红外图谱显示，3447.1cm-1附近为O-H伸缩振动吸收峰，2928.4cm-1附近为C-H伸缩振动吸收峰，1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1256.4cm-1附近是O＝S＝O伸缩振动吸收峰(图1)。
[0058] 13C-NMR谱中(图2)，位于δ175.75的信号是葡糖糖醛酸的羧基碳信号，位于δ174.51的信号是岩藻糖上乙酰基的羰基碳信号，位于δ91-δ103的端基碳信号，分别为末端岩藻糖、1,4-岩藻糖、1,3-岩藻糖、1,3,4-岩藻糖、1,2-甘露糖、1,2,3-甘露糖、1,2,4-甘露糖、1,2,
6-甘露糖和末端甘露糖的C1信号；在δ16.29左右为岩藻糖甲基碳的信号峰；在δ21.29处为乙酰基甲基碳的信号峰。
[0059] 1H-NMR谱中(图3)，位于δ5.0-5.7的信号是NDH01中异头氢的信号，位于δ3.25-4.65的信号是糖环上的氢的信号，位于δ2.28附近的信号是典型的乙酰基上甲基氢的信号，位于δ1.30附近的信号是岩藻糖H6的信号。根据δ2.28附近的信号和δ1.30附近的信号的积分面积比可知乙酰基与岩藻糖的摩尔比为0.168:1。由于岩藻糖占总糖的摩尔分数是
82.6％。所以可以换算出乙酰基与总糖的摩尔比是0.139:1。从上述结果可以发现NDH01是乙酰化的岩藻聚糖硫酸酯。
[0060] 实施例2.岩藻聚糖硫酸酯NDH01具有抗血管生成活性
[0061] a.岩藻聚糖硫酸酯NDH01抑制人源表皮血管内皮细胞HMEC-1细胞在基质胶上的管腔形成：
[0062] 人源表皮血管内皮细胞HMEC-1细胞培养于含有15％四季青胎牛血清(购自浙江天航生物科技有限公司)、2mM L-谷氨酰胺、10ng/mL EGF和抗生素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的MCDB131培养基(购自美国Gibco公司)中。4℃化冻的基质胶(50μL)加入到4℃预冷的96孔板中在37℃固化30分钟。每孔分别加入含有0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000μg/mL的NDH01及HMEC-1细胞(5×104个)的MCDB131培养基(100μL)中，在培养箱中继续培养12h。结果用倒置显微镜(购自日本奥林巴斯公司)拍摄记录，放大倍数为200倍。结果如图4A所示，岩藻聚糖硫酸酯NDH01能浓度依赖地抑制HMEC-1细胞在基质胶上的管腔形成。
[0063] b.MTT实验检测岩藻聚糖硫酸酯NDH01对HMEC-1细胞生长的影响：
[0064] 对数生长期的HMEC-1细胞(5×103个/孔)种入96孔板中，设三复孔，于培养箱中培养24h；吸去细胞上清液，加入终浓度分别为0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000μg/mL的NDH01，继续培养24、48或72h后，毎孔加入5mg/ml的MTT溶液10μL(购自美国sigma公司，PBS配制，经0.22μm微孔滤膜过滤)，继续培养4h后吸去上清液，加入150μL DMSO溶解形成的甲瓒，用酶标仪在490nm下采集吸光度。
[0065] 细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。
[0066] 结果如图4B所示，1000μg/mL的NDH01处理细胞48h或72h后，细胞的存活率分别为80.86％和63.33％，说明岩藻聚糖硫酸酯NDH01的抗血管生成活性与其抑制细胞生长有关。
[0067] c.划痕愈合实验检测岩藻聚糖硫酸酯NDH01对HMEC-1细胞迁移的影响：
[0068] HMEC-1(2.5×105个)种入12孔板当中培养24h后用黄枪头划一痕，PBS小心洗涤三次，加入含有0、250、500、1000μg/mL NDH01的培养基，置于细胞培养箱继续培养12h。刚划痕及划痕后12h用倒置显微镜拍摄记录细胞愈合情况，放大倍数为40倍。实验结果利用Image-Pro Plus软件统计迁移情况。
[0069] 如图4C和4D所示，0μg/mL NDH01组，迁移率为57.7％，而250、500和1000μg/mL NDH01组的迁移率依次是43.4％、22.56％和16.7％，表明岩藻聚糖硫酸酯NDH01能显著抑制HMEC-1细胞的迁移能力。
[0070] d.表面等离子共振(SPR)技术检测岩藻聚糖硫酸酯NDH01与BMP4的结合能力：
[0071] 首先制备蛋白芯片。用Biacore T200控制软件Wizard中的氨基偶联方法将所需蛋白偶联到CM5芯片上。HBS-EP作为工作缓冲液，BMP4蛋白(购自Prospec公司)用pH 4.0的10mM NaAc稀释至25μg/mL。芯片表面用0.2M EDC和50mM NHS 1:1混合以10L/min的流速进样7分钟，然后注射BMP4溶液，以pH 8.5，1M乙醇胺进样7分钟，封闭活化的芯片表面。最终蛋白耦联量为4243.2Ru。
[0072] 然后进行样品的动力学测试。用HBS-EP缓冲液梯度稀释NDH01，离心后自动进样，检测不同浓度的NDH01(0.133、0.27、0.55、1.13、1.62和2.31μM)与BMP4蛋白的结合活性。样品与蛋白的相互作用分别用Biacore T200控制软件中的结合分析Wizard进行动力学实验。样品进样时，流速为5μL/min，进样2min，等待2.5min，然后分别用20mM NaOH和HBS-EP缓冲液以30μL/min的流速进样30s进行再生。得到的数据根据Biacore T200分析软件中的1∶
1Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。
[0073] 结果如图5A所示，响应值随着NDH01的浓度的递增而递增，表明岩藻聚糖硫酸酯NDH01能与BMP4强烈结合，解离常数为40.60nM。
[0074] e.RT-PCR实验和免疫印迹实验检测岩藻聚糖硫酸酯NDH01对HMEC-1细胞中BMP4在mRNA水平和蛋白水平表达的影响：
[0075] HMEC-1细胞以5×105个/孔的密度种于6孔板中，培养24h后，加入500μg/mL的NDH01处理。分别培养0、12、24和36小时后，弃上清，用预冷的PBS漂洗细胞。对于mRNA水平的检测，用Trizol(购自美国Invitrogen公司)提取细胞中的总RNA，提取步骤按照说明书中进行。提取得到的总RNA采用M-MLV反转录酶(购自日本TaKaRa公司)以Oligo(dT)18为引物参照说明书将RNA反转录成cDNA，利用Primer5设计的引物PCR扩增BMP4，PCR产物采用2％的琼脂糖凝胶检测。对于蛋白水平的检测，RIPA裂解液(临用前加入Cocktail，购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5×上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性15-30min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测BMP4。
[0076] 结果如图5B所示，岩藻聚糖硫酸酯NDH01可以显著地抑制BMP4的表达。
[0077] f.NDH01能抑制BMP4诱导的管腔形成：
[0078] 4℃化冻的去除了生长因子的基质胶(50μL)加入到4℃预冷的96孔板中在37℃固化30分钟。5ng/mL BMP4单独、或者与10μg/mL的noggin(购自上海普欣生物技术有限公司)、或者与1000μg/mL的NDH01加入到含HMEC-1细胞(5×104个)的无血清培养基(100μL)中，noggin作为阳性对照，无血清培养基作为阴性对照，在培养箱中继续培养12h。结果用倒置显微镜(购自日本奥林巴斯公司)拍摄记录，放大倍数为200倍。
[0079] 结果如图5C所示，岩藻聚糖硫酸酯NDH01能显著抑制BMP4诱导的HMEC-1细胞在基质胶上的管腔形成。
[0080] g.NDH01能阻断BMP4/Smad信号通路：
[0081] HMEC-1细胞以5×105个/孔的密度种于6孔板中，培养24h后，加入1000μg/mL的NDH01或5μg/mL的noggin继续培养11h，然后向培养基中加入10ng/mL的BMP4再培养1h，弃上清，用预冷的PBS漂洗细胞。RIPA裂解液(临用前加入Cocktail，购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5×上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性15-30min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测Smad1/5/8的磷酸化水平和Smad1的表达水平。
[0082] 结果如图5D所示，岩藻聚糖硫酸酯NDH01可以显著地抑制Smad1/5/8的磷酸化，对Smad1的表达水平无显著影响。
