本发明提供了一种药物组合物，包括：(i)至少一种噬菌体菌株，其能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染；以及(ii)药学上可接受的载体；用于治疗炎性肠疾病。本发明进一步提供了一种治疗炎性肠疾病的方法，包括向有需要的主体施用能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株，从而治疗所述主体。本发明还提供了新的噬菌体菌株。
(i)能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株；以及(ii)药学上可接受的载体；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的一个或多个肠部位，所述肠部位包括大肠和小肠。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株是LF82、
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述炎性肠疾病是克罗恩病。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述炎性肠疾病是溃疡性结肠炎。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述炎性肠疾病是手术后回肠病变的复发。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性和相同的表型特征。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性和相同的表型特征。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性和相同的表型特征。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性和相同的表型特征。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性和相同的表型特征。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性和相同的表型特征。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性和相同的表型特征。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性和相同的表型特征。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其特征在于，所述噬菌体菌株包括以下噬菌体菌株中的两种或更多种的任何组合：保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述噬菌体菌株包括：
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
17.噬菌体菌株在制备用于治疗炎性肠疾病的药物中的应用，所述噬菌体菌株能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染；所述噬菌体菌株包括以下噬菌体菌株中的至少一种：保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的一个或多个肠部位，所述肠部位包括大肠和小肠。
19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株是LF82，
06259、06254、06256、06072、06073、06075、06076、06087、06088、06089、06398、06011、
06023、06024、06026、06027、06028、06029、06030、06031、06033、06150、06151、06152、
06166、06167、06168、06169、06170、06171、06172、06173、06280、06281、06283、06271、
06278、06351、06352、06353、06354、06356、06357、06358、06359、06360、06361、06362、
07074、07075、07076、07077、07078、07081、07082、07086、07093、07035、07045、07046、
07048、07051、07003、07006、07022、07101、07103、07107、07111、07113、07126、07127、
07128、07134、07135、07136、07137、06066、06381、06258、06086、06384、06386、06097、
06099、06100、06006、06007、06016、06019、06394、06020、06021、06022、06396、06037、
06040、06080、06042、06043、06045、06046、06049、06057、06101、06160、06164、06176、
06177、06293、06295、06301、06329、06338、06341、07064、07065、07066、07067、07068、
07073、07120、07121、07122、07123、07131、07138、06235、06242、06103、06105、06106、
06108、06142、06143、06121、06122、06145、06146、06126、06135、06136、06137、06127、
06129、06158、06196、06197、06198、06200、06201、06204、06212、06213、06216、06217、
06218、06221、06222、06223、06224、06225、07032、07033和07125；或者是LF31、LF71、LF123、LF138、LF9、LF15、LF28、LF50、LF65、LF119、LF128、LF130、LF73、LF100、LF110、LF134、LF105、LF49-2、LB11和LF45-2。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的应用，其特征在于，所述炎性肠疾病是克罗恩病。
21.根据权利要求17-19中任一项所述的应用，其特征在于，所述炎性肠疾病是溃疡性结肠炎。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性和相同的表型特征。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性和相同的表型特征。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性和相同的表型特征。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性和相同的表型特征。
26.根据权利要求17-25中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性和相同的表型特征。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性和相同的表型特征。
28.根据权利要求17-27中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性和相同的表型特征。
29.根据权利要求17-28中任一项所述的应用，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性和相同的表型特征。
30.根据权利要求17-29中任一项所述的应用，其特征在于，所述噬菌体菌株包括以下噬菌体菌株中的两种或更多种的任何组合：保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述噬菌体菌株包括：
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性；
保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4670的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性；以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性。
32.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
33.根据权利要求32所述的噬菌体菌株P1或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
34.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
35.根据权利要求34所述的噬菌体菌株P2或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
36.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
37.根据权利要求36所述的噬菌体菌株P3或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
38.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
39.根据权利要求38所述的噬菌体菌株P4或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
40.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
41.根据权利要求40所述的噬菌体菌株P5或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
42.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
43.根据权利要求42所述的噬菌体菌株P6或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
44.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的噬菌体菌株P8或其变种，其中，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。
45.根据权利要求44所述的噬菌体菌株P8或其变种，其特征在于，所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
噬菌体的应用
技术领域
[0001] 本发明属于用于治疗炎性肠疾病的噬菌体疗法领域。
背景技术
[0002] 噬菌体是通过特异相互作用影响细菌的病毒。
[0003] 克罗恩病(CD)(也被称为局限性回肠炎)是一种肠的炎性疾病，可影响从口腔到肛门的胃肠道的任何部分，导致多种症状。它主要导致腹痛、腹泻、呕吐或体重减轻，但是也可能会引起胃肠道之外的并发症，例如皮疹、眼睛发炎、疲倦以及注意力衰退。
[0004] 虽然还不知道CD的准确原因，但是似乎是环境因素和遗传倾向二者的结合导致了该疾病。CD被认为是一种自身免疫疾病，其中机体的免疫系统进攻胃肠道，引起炎症；其被归类为炎性肠疾病(IBD)的一种类型。
[0005] 在患CD的病人中，在回肠上皮细胞的顶端表面上的癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)的不正常表达被观察到，并且CD回肠病变被致病性侵袭性大肠杆菌(AIEC)定殖。
[0006] 对于克罗恩病，没有已知的药物或手术治疗。特别是，通常的IBD和特别的 CD二者都不能用抗生素(目的在于与致病性大肠杆菌对抗)治疗。治疗选择局限于控制症状、维持缓解以及防止复发。
发明内容
[0007] 本发明提供了一种用于治疗炎性肠疾病(IBD)的药物组合物，包括：(i) 能够在黏附侵袭性(adherent-invasive)大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株；和(ii)药学上可接受的载体。
[0008] 本发明进一步提供了一种治疗炎性肠疾病的方法，包括向有需要的主体施用能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株，从而治疗所述主体。
[0009] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心 (the French National Collection of Microorganisms at the InstitutPasteur)的保藏号为CNCM I-4694噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0010] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0011] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0012] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0013] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0014] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0015] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0016] 本发明还使用了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0017] 出于本发明的目的，如果噬菌体菌株的变种对在描述于下文的实施例3的“噬菌体在AIEC菌株中传染性的离体分析”中的AIEC菌株LF82、07081、07082、 07076和06075中的至少一种实施至少“+”，则噬菌体菌株的变种被视为具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性。在一个优选实施方式中，如果噬菌体菌株的变种对在描述于下面的实施例3的“噬菌体在AIEC菌株中传染性的离体分析”中的全部五种AIEC菌株LF82、LF06075、LF07076、LF07081和LF07082(AIEC 菌株LF06075、LF07076、LF07081和LF07082也被分别简称为06075、07076、
07081和07082)实施至少“+”，则噬菌体菌株的变种被视为具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性变种。这些AIEC菌株已经被里尔大学2–(Université Lille 2 –Droit et Santé,42 Rue Paul Duez,59000 Lille，法国)保藏在巴斯德研究院法国微生物国家保藏中心，保藏号为CNCM I-4712(LF 82)、CNCM I-4713(LF 06075)、 CNCM I-4714(LF 07076)、CNCM I-
4715(LF 07081)和CNCM I-4716(LF 07082)。
[0018] 出于本发明的目的，如果噬菌体菌株P1至P6、P8和CLB_P2中的一种的变种与噬菌体wV8(对于P1至P6的变种)或噬菌体RB69(对于P8的变种)或噬菌体JS98(对于CLB_P2的变种)的主要衣壳蛋白在至少70％的长度上具有至少 80％序列一致性，优选在至少80％的长度上具有至少90％序列一致性，更优选在至少90％的长度上具有完全序列一致性(由BLAST算法确定)，如“主要衣壳蛋白的鉴别”部分中描述的，那么噬菌体菌株P1至P6、P8和CLB_P2中的一种的变种被视为具有与所述噬菌体菌株相同的相同的表型特征。
[0019] 在一个优选实施方式中，噬菌体的变种具有与噬菌体相同的溶解活性。在另一个实施方式中，噬菌体的变种与噬菌体相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0020] 发明详述
[0021] 本发明提供了一种用于治疗炎性肠疾病(IBD)的药物组合物，包括：(i)能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株；和(ii)药学上可接受的载体。
[0022] 本发明进一步提供了一种治疗炎性肠疾病的方法，包括向有需要的主体施用能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株，从而治疗所述主体。
[0023] 本文所使用的“黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)菌株”应当被理解为是指在肠道细胞系I-407的细胞培养中具有等于或高于0.1％的平均侵袭能力的大肠杆菌菌株。换句话说，当根据在下文“侵袭试验”部分描述的侵袭试验检测时(也可参见Darfeuille-Michaud et al.(2004)，Gastroenterology 127:412-421)，AIEC菌株具有侵袭I-407的肠道细胞培养的能力，侵袭指数等于或高于原接种物(作为100％) 的0.1％。
[0024] AIEC菌株的非限制性的示例是LF82、LF82SK(被保藏在 Universitéd'Auvergne，49 Boulevard Mitterand，63001Clermont-Ferrand (法国)巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4723)，列在本文表1的那些以及在以下逐条记录中的那些(cf.Darfeuille-Michaud et al. (2004)，Gastroenterology 127:412-421，尤其是第417页，表2)：LF31、LF71、 LF123、LF138、LF9、LF15、LF28、LF50、LF65、LF119、LF128、LF130、LF73、 LF100、LF110、LF134、LF105、LF49-2、LB11和LF45-2。在一个实施方式中，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株是LF82、07081、07082、07076或06075，尤其是 LF82。
[0025] 在一个实施方式中，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的结肠中。在另一个实施方式中，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的回肠中。在又一个实施方式中，所述黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的一个或多个肠道部分 (小肠和/或大肠)。
[0026] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0027] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0028] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0029] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0030] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0031] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0032] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的P8，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0033] 在一个实施方式中，所述至少一种噬菌体菌株是保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4675的CLB_P2，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0034] 在一方面，按照设想，所述药物组合物包括一种以上的噬菌体菌株，也称为“噬菌体混合物”。本发明的噬菌体混合物包括P1、P2、P3、P4、P5、P6、P8 和CLB_P2及其变种的任意组合，所述变种为具有相同的溶解活性的变种、优选为具有相同的溶解活性和相同的表型特征的变种。优选地，意图用于治疗特定主体或主体群的噬菌体混合物中的噬菌体将在为了对抗而识别和选择的AIEC菌株或AIEC菌株的基础上被选择。
[0035] 炎性肠疾病的非限制性的示例是克罗恩病(CD)，溃疡性结肠炎(UC)，慢性炎性肠疾病(慢性IBD)，例如但不限于显微镜结肠炎、脂泻病和血管炎。在一个实施方式中，所述IBD是CD或UC。在另一个实施方式中，所述炎性肠疾病是手术(例如去除CD病人的小肠的至少一部分的手术)之后回肠病变的复发。所述复发由Rutgeerts评分来测量。
[0036] 在一个实施方式中，所述炎性肠疾病(IBD)不是由细菌感染引起的。该实施方式是基于通常不认为是细菌性疾病。相反，细菌感染可能与IBD相伴，但不是必然的病原体。该观察增加了本发明的令人惊奇的发现，即为了治疗不是由细菌引起的疾病而应用噬菌体疗法。
[0037] 因此，作为一个实施例，罹患IBD的主体的家族成员中可以有AIEC菌株，虽然这些家族成员并没有罹患该疾病。同样地，AIEC菌株也可能在既没有罹患 IBD并且与罹患IBD的主体也没有关系的主体中被发现，如还可以从下表1中可以当看到的。
[0038] 本文所使用的“治疗”应当被理解为包括疾病的一种或多种症状特点的减少；疾病进展的速率的减小；从疾病中康复，疾病的治愈，缓解和预防(例如预防复发)的维持。
[0039] 本文所使用的“主体”可以是雄性或雌性主体。主体可以是人类或任何其他哺乳动物。
[0040] 本发明的药物组合物的剂量和给药方案将必然地取决于要达到的治疗效果 (例如IBD的治疗)，并且可根据组合物中的具体噬菌体菌株、给药途径以及被给药以该药物的个体主体的年龄和病况而变化。
[0041] 对于人类的剂量有可能包含104-1011空斑形成单位(pfu)的噬菌体剂量。所需剂量可以每日一剂或以适合间隔给药的多个亚剂的形式提供。
[0042] 在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的载体”涉及药学上可接受的、非毒性的载体、填料或稀释剂，其被定义为用于配制用于动物或人类给药的药物组合物的常用媒介物。
[0043] 本发明的药物组合物可进一步包括本发明的药物药学上可接受的助剂，以及任选的其他治疗剂。助剂，也被称为配合剂，包括本领域常规的那些，例如，但不限于基体形成剂、增稠剂、粘合剂、润滑剂、pH调节剂、保护剂、粘度增强剂、吸水剂(wicking agents)、崩解剂(包括非泡腾和泡腾的崩解剂)、表面活性剂、抗氧剂、湿润剂、着色剂、调味剂、掩味剂、甜味剂、防腐剂等等。除了是药学上可接受的，就它们与该组合物的其他成分(包括噬菌体)相容意义而言，所述助剂必须是“可接受的”。
[0044] 药物组合物和给药途径包括适合用于或通过口腔(包括颊、舌下和眶内)、直肠、鼻、外用(包括透皮)、眼、耳、阴道、支气管、肺或肠胃外(包括皮下注射、肌肉注射、静脉内注射、真皮内注射、腹腔注射、胸膜注射、囊内和鞘内) 给药或植入物给药的那些。药物组合物和给药途径可被调整以提供本发明的噬菌体菌株的靶向性。在一个具体实施方式中，本发明的药物组合物通过口服施用。所述组合物可通过药学领域已知的任何方法制备。这样的方法包括将本发明的噬菌体菌株与药学上可接受的载体和任选的一种或多种助剂结合的步骤。
[0045] 适用于口服施用的药物组合物可作为离散的剂量单位(剂型)被提供，例如药丸，药片，糖衣丸或胶囊，或作为粉末或颗粒，或作为溶液或悬浮液。药物组合物还可作为大丸药或贴剂被提供。所述组合物可进一步被加工成用于直肠给药的栓剂或灌肠剂。
[0046] 对于肠胃外给药，适合的组合物包括有水和无水的无菌注射。该组合物可被提供在单位剂量或多剂量容器(例如密封的小瓶和安瓿瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在使用之前，仅需要添加无菌的液体载体(例如水)。
[0047] 为了经皮给药，可以考虑例如凝胶、贴片或喷雾。
[0048] 适用于呼吸道给药的组合物或制剂，例如，通过鼻用吸入剂，包括细粉或细雾，其可借助定量加压的气雾剂、喷雾器或吹药器产生的。
[0049] 本发明进一步包括一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的药物组合物和组合物用于上文所述的用途的说明书，任选地和包装材料一起。
[0050] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0051] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0052] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0053] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0054] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0055] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0056] 本发明进一步提供了一种保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。实施例
[0057] 在下面的实施例中进一步描述了本发明，这些实施例并不意图以任何方式限制本发明要求的保护范围。
[0058] 方法
[0059] 侵袭试验
[0060] 来源于人类胚胎空肠和回肠的肠道-407(I-407)细胞系被用作未分化的肠道上皮细胞的模型。其购买于Flow Laboratories(Flow Laboratories Inc.，Mc Lean，VA)。
[0061] 将肠道-407细胞接种于24-孔组织培养板(Polylabo，Strasbourg，France)中，密度为4105细胞/孔，孵育20小时。细胞单层用PBS(pH 7.2)洗涤两次。采用庆大霉素保护分析法(Falkow et al.(1987)，Rev.Infect.Dis.9(Suppl.5):S450-455) 测量上皮细胞的细菌侵袭。每个单层在没有抗生素的1mL细胞培养基中接种，感染复数是10细菌每上皮细胞。在37℃、5％CO2条件下的孵育期之后，用PBS 将所述单层洗涤3次。在用去离子水中的1％Triton X-100(Sigma)的细胞溶解单层之前，添加含有100μg/mL庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)的新鲜的细胞培养基1小时以杀死细胞外细菌。该浓度的Triton X-100对细菌活性至少30分钟没有影响。稀释该样品，并将其涂布在Mueller–Hinton琼脂板上以测定菌落形成单位的数量。大肠杆菌对肠-407细胞系的侵袭能力的全部结果均以细胞内细菌与初始接种液(作为100％)相比较的百分率的形式表达。全部分析均以单独试验的形式进行至少三次。
[0062] 主要壳蛋白的识别
[0063] 通过将每种噬菌体1011pfu/ml的60μl悬浮液煮沸10min来获得病毒蛋白质。 20μl的悬浮液在预制的4–12％聚丙烯酰胺凝胶上测试。该凝胶用考马斯亮蓝染色，主色带被切除，经胰蛋白消化，在巴斯德研究院(Institut Pasteur)的微量测序装置上通过质谱法进行分析。
[0064] 将获得的肽段质量数与蛋白质数据中的信息进行比较，允许识别最接近的已知蛋白质，即对于P1-P6最接近的已知蛋白质是wV8，对于P8最接近的已知蛋白质是RB69，对于CLB_P2最接近的已知蛋白质是JS98(参见A.Villegas et al， Virology Journal 2009，6:41 for characterization of wV8 and S.Zuber et al.，Journal of Bacteriology
2007，189:22，8206 for characterization of RB69 and JS 98)。
[0065] 噬菌体wV8的主要衣壳蛋白与由噬菌体P1至P6的主要衣壳蛋白的质谱获得的肽的比对：
[0066]
[0067] 噬菌体RB69的主要衣壳蛋白与由噬菌体P8的主要衣壳蛋白的质谱获得的肽的比对：
[0068]
[0069] 噬菌体JS98的主要衣壳蛋白与由噬菌体CLB_P2的主要衣壳蛋白的质谱获得的肽的比对：
[0070]
[0071] 实施例1
[0072] 菌株的分离
[0073] 一百六十六种(166)黏附侵袭性大肠杆菌(E.coli)菌株(包括大肠杆菌菌株 LF82(表1))进行如下分离：从CD患者、其家庭成员和对照主体的新鲜排泄物中分离AIEC菌株。该排泄物被十倍稀释至-9。各稀释物被涂布在不同的媒介上。孵育后，传代培养和识别菌落，并检测菌株的侵袭能力。
[0074] 具体地，排泄后立即地，将新鲜排泄物引入到无菌容器中。通过添加湿润的厌氧培氧灌 使气氛为厌氧气氛。在取样日处理样品。约1g的排泄物被引入到预先称重的试管中的9mL的半胱氨酸化的1/4强度的林格液中；在引入样品之后，它们被再次称重，以确定其精确重量(第一个十倍稀释)。制备八个进一步十倍稀释物，0.1mL的每种稀释物涂在不同的非选择性和选择性的媒介上，在适宜的条件下孵育：在厌氧条件下进行哥伦比亚血琼脂(CS)和CSH琼脂孵育一个星期，在富CO2的气氛中进行MRS媒介孵育48h，在空气中进行McConkey and Cetrimide琼脂孵育48h。所有的孵育都是在37℃完成。孵育后，将菌落计数、传代培养，并通过已建立的表型标准进行识别。
[0075] 挑选与CD患者相比的对照主体，以便对照主体的性别和年龄与CD患者相同，并具有与CD患者相似的家庭规模(以考虑家庭内的微生物菌落变化)。
[0076] 在2000年，该方案得到了当地伦理委员会的批准。通过EPIMAD注册系统对患者进行随访，该EPIMAD注册系统是根据法国国家卫生与医学研究院(Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale(INSERM))和法国公共卫生监测研究所(InVS))之间的协议组织，并且还得到了the Aupetit Association、法国西北部的狮子俱乐部(Lion’s Club of Northwestern France)、辉凌制药(Ferring Laboratories)、de Gastroentérologie和里尔大学医院的支持。
[0077] 表1–AIEC菌株
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085] 1 McC＝McConkey琼脂(bioMérieux)
[0086] Cet＝Cetrimide琼脂(bioMérieux)
[0087] CSana＝厌氧哥伦比亚血琼脂
[0088] MRS＝Man Rogosa Sharp琼脂(Oxoid)
[0089] CSH＝哥伦比亚SH琼脂
[0090] “2 大肠杆菌水平”是指排泄物中的AIEC菌株的量。
[0091] “3 总计数”是指排泄物中的所有细菌种类。
[0092] CSana培养基具有以下组分(每升培养基)：
[0093] -39g哥伦比亚血琼脂基础(Oxoid)
[0094] -5g葡萄糖
[0095] -0.3g半胱氨酸盐酸盐
[0096] -5g琼脂
[0097] -pH 7.0±0.2
[0098] 该混合物在121℃消毒15分钟。就在涂板之前，添加5％马血。
[0099] CSH培养基具有以下组分(每升培养基)；
[0100] -39g哥伦比亚血琼脂基础(Oxoid)
[0101] -3g半胱氨酸盐酸盐
[0102] -pH 6.8±0.2
[0103] 该混合物在121℃消毒15分钟。就在涂板之前，添加2ml无菌柠檬酸铵溶液 (0.25g/10ml水)。孵育后，使用半胱氨酸(并释放硫化物)的细菌导致了在该培养基上的黑色菌落。
[0104] 实施例2
[0105] 噬菌体分离
[0106] 将噬菌体从污水中进行如下分离：污水以0.2μm过滤，并与同等体积的2X Luria-Bertani(LB)培养基混合。该混合物被LF82菌株的新鲜培养物接种，在摇床上于37℃过夜孵育。向烧瓶中添加氯仿(1/10体积)，在摇床上放置一小时。培养基被离心分离，10000g 10min。收集1ml上层清液，并添加1/10体积的氯仿。在短暂的涡流混合之后，将微量离心管进行离心分离，7500g 5min。为了确定噬菌体是否存在于该提取物中，将一滴(10μl)上层清液涂在LB琼脂板上，并干燥。使用铂丝将板上加上条纹，from the drop通过板的其余部分以分离个体噬菌体。 1ml生长中的LF82菌株培养物被涂覆在整个板子上；除去过量的培养物，然后将该板在37℃孵育过夜。一个或两个斑块were picked up and重新悬浮于200μl SM缓冲液中(10mM Tris HCl pH7，NaCl 200mM，明胶0.03％)。每个试管都被添加20μl氯仿，通过涡流进行短暂混合，7500g离心分离5min。10μl上层清液被涂于LB板上，干燥，之前的程序重复至少三次。一旦分离的斑块中多数变均匀，将刚重悬过的10μl斑块添加到1ml的LF82菌株的生长培养基中在OD 0.1、在600nm。该培养管在37℃孵育2至4小时，直至发生细胞溶解。添加1/10vol. 氯仿之后，将该培养物转移到离心管中，7500g离心分离5min，冷却至4℃，从而获得基本的库存。将该库存的几种稀释物保持在4℃，用于使更大体积的培养物感染，从而制备更大量的噬菌体。获得了如下七种(7)噬菌体：
[0107] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4694的vB_EcoM_LF82_P1(在上下文中为P1)；
[0108] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4695的vB_EcoM_LF82_P2(在上下文中为P2)；
[0109] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4696的vB_EcoM_LF82_P3(在上下文中为P3)；
[0110] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4697的vB_EcoM_LF82_P4(在上下文中为P4)；
[0111] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4698的vB_EcoM_LF82_P5(在上下文中为P5)；
[0112] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4699的vB_EcoM_LF82_P6(在上下文中为P6)；以及
[0113] ●保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4699的vB_EcoM_LF82_P8(在上下文中为P8)。
[0114] CLB_P2，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家收集中心，保藏号为CNCM I-4675，其分离被详细描述于Maura et al.Environmental Microbiology(2012)14(8)，
1844–1854中。
[0115] P1至P6噬菌体属于wV8噬菌体家族。
[0116] P8属于RB69噬菌体家族。
[0117] CLB_P2属于JS98噬菌体家族。
[0118] 归类于wV8、RB69和JS98噬菌体家族是基于主要衣壳蛋白的序列。
[0119] 实施例3
[0120] AIEC菌株中的噬菌体的传染性的体外试验
[0121] 通过将噬菌体溶液的系列稀释物(从不稀释至10-8稀释)与表面被一种细菌覆盖的有盖培养皿接触来进行噬斑试验。37℃过夜温育后，将斑块计数。当测试的细菌是用于分离噬菌体的细菌宿主(参照宿主)时，认为噬斑试验的效率是 100％。当被测的细菌不是原宿主时，结果被表示为与参照宿主的比较。大于80％ (+++)的结果意味着与宿主细菌相比，该细菌是高效宿主，而0.1-80％(++)的结果意味着该细菌是有效宿主，低于0.1％(+)但是大于0的结果意味着该细菌是中等有效的宿主，最后，0(-)意味着该细菌是完全抵抗的。
[0122] 结果
[0123] 表2显示了在38种菌株(出自于实施例1、表1的166种菌株)上的8种噬菌体(如在实施例2中分离和确定的)的宿主范围的结果。
[0124] 表2测试菌株和获得的每种噬菌体的涂板的有效效率(EOP)
[0125]
[0126]
[0127] 表3被噬菌体感染的菌株的数量：
[0128]Efficacy P1 P2 P3 P4 P5 P6 P8 CLB_P2
+ 3 5 6 9 9 8 8 0
++ 10 8 8 6 6 7 1 13
+++ 5 6 5 4 4 4 4 5
总/38 18 19 19 19 19 19 13 18
[0129] 数字表明菌株被一种噬菌体感染的菌株的数量
[0130] 实施例4
[0131] 在小鼠肠内的噬菌体体内复制
[0132] 对小鼠肠内的噬菌体体内复制进行如下评估：
[0133] 首先，菌株LF82被设计以携带分别对链霉素和卡那霉素具有抗性的两种抗菌素抗性基因。该新的细菌l菌株被命名为LF82SK，其侵袭特性被证实与原始 LF82菌株相同。
[0134] 三(3)组，每组两只(2)小鼠：
[0135] 第1组：非移植的小鼠+噬菌体
[0136] 第2组：LF82SK移植的小鼠
[0137] 第3组：LF82SK移植的小鼠+噬菌体
[0138] 在第0天之前3天，向所有动物的饮用水中添加链霉素(5g/L)，在整个实验中保持。
[0139] 在第0天，将LF82SK施用于第2和3组，以使该菌株定殖在小鼠的肠内。
[0140] 在第4天，200μl的P2+P6噬菌体的混合物被施用于第1和3组(灌胃溶液 108pfu/ml)，上午一次，下午一次。P2+P6噬菌体还被添加至饮用水中(108pfu/ml)。在第5天的早上，将小鼠处死以评估回肠中和排泄物中的细菌和噬菌体的数目。结果：
[0141] 细菌(大肠杆菌)：
[0142] 第1组：无细菌；
[0143] 第2组：在回肠中–106cfu/g器官；在排泄物中–108cfu/器官；
[0144] 第3组：在回肠和排泄物中：细菌全部被噬菌体裂解。
[0145] 噬菌体：
[0146] 第1组：在回肠中–106pfu/g器官；在排泄物中–107pfu/器官；
[0147] 第2组：无噬菌体
[0148] 第3组：在回肠中–106pfu/g器官；在排泄物中–1010pfu/器官；
[0149] 在排泄物中，第3组的噬菌体比第1组多100倍，这表明噬菌体在体内增殖。
[0150] 实施例5
[0151] 在小鼠肠内的噬菌体体内复制
[0152] 在小鼠肠中的噬菌体体内复制进行了如下评价：
[0153] 12只小鼠被分为三(3)组，每组四只(4)小鼠：
[0154] 第1组：非移植的小鼠+噬菌体
[0155] 第2组：LF82SK-移植的小鼠
[0156] 第3组：LF82SK-移植的小鼠+噬菌体
[0157] 在第0天之前3天，向所有动物的饮用水中添加链霉素(5g/L)，在整个实验中保持。
[0158] 在第0天，将LF82SK给予第2和3组，以使该菌株定殖在小鼠的肠内。
[0159] 在第4天，噬菌体(P2+P6+P8的混合物，每种108pfu/mL)被加入到第1和 3组的饮用水中。
[0160] 在第5天的早上，小鼠被处死以评估回肠中和排泄物中的细菌和噬菌体的数目。
[0161] 取这三个组的100μl回肠匀浆以使用Promega公司的 组织DNA 纯化试剂盒提取全部DNA。
[0162] 结果：
[0163] 细菌(大肠杆菌)：
[0164] 第1组：无细菌；
[0165] 第2组：在回肠中–3.2·106cfu/g器官；在排泄物中–1.2·109cfu/g排泄物；
[0166] 第3组：在回肠和排泄物中：细菌全部被噬菌体裂解。
[0167] 噬菌体：
[0168] 第1组：在回肠中–1.4·106pfu/g器官；在排泄物中–5.2·106pfu/g排泄物；
[0169] 第2组：无噬菌体
[0170] 第3组：在回肠中–2.6·106pfu/g器官；在排泄物中–1.0·109pfu/g排泄物；
[0171] 在排泄物中，第3组的噬菌体比第1组多200倍，这表明噬菌体在体内增殖。
[0172] 从回肠部分提取的DNA用于进行使用两组引物的定量PCR。一组引物(SEQ ID NO:30-31)用于将来自于样品中存在的“全细菌”的DNA进行扩增，同时第二组引物(SEQ ID NO:
32-33)用于将来自"E.coli"细菌的DNA特异性扩增。归一化后，结果被表示为大肠杆菌与所有细菌的比值。
[0173] 第1组：使用全细菌引物的qPCR扩增成功，但是使用E.coli引物的qPCR 扩增没有成功。比值无法计算。
[0174] 第2组：两组引物的qPCR扩增均成功。平均比值是0.6(60％的总细菌是 E.coli细菌)。
[0175] 第3组：两组引物的qPCR扩增均成功。平均比值是0.1(10％的总细菌是 E.coli细菌)。注意一只小鼠显示出0.4的比值，而另外三只显示了低得多的比值(0.06；0.0002；0.002)。
[0176] 结果，噬菌体能够将四只中的三只小鼠中的LF82细菌的回肠定殖的水平减小至少一个量级。
[0177] 实施例6
[0178] 噬菌体传染性的体内试验
[0179] 选择两种噬菌体混合物用于检测野生型(WT)小鼠和被从CD患者分离的 LF82 E.coli菌株感染的CEACAM6小鼠。
[0180] 在WT小鼠和在被从CD患者分离的LF82 E.coli菌株感染的CEACAM6小鼠中，将噬菌体在CMC中通过口腔喂食向小鼠给药。这种给药具有很多优点：已知量的噬菌体给药和即时的胃酸中和。在整个研究期间，向小鼠每日施用噬菌体。
[0181] 将小鼠在给药后第5天处死。
[0182] -主要标准：小鼠的回肠和结肠附着的菌丛的量化。
[0183] -次要标准：
[0184] ○重量评估
[0185] ○大便性状.
[0186] ○大便潜血的存在(宏观和生物学)
[0187] -细胞腔菌丛(菌丛+LF82+噬菌体)
[0188] ○处死时：宏观和组织学检查，黏附回肠和结肠的菌丛+LF82+噬菌体，[0189] ○处死时：宏观和组织学检查，黏附回肠和结肠的菌丛+LF82+噬菌体，[0190] 监测炎症的生物学参数，肠系膜淋巴结(MLN)中的噬菌体易位，肝脏和脾脏被寻找。
[0191] 在接受噬菌体混合物而没有LF82菌株的小鼠的粪便中发生了后续的噬菌体消除。
[0192] 实施例7
[0193] LF82菌株上的噬菌体的混合物的体内试验。
[0194] 对小鼠肠中的噬菌体(P2+P6+P8+CLB_P2的混合物)的体内复制进行了如下评估：
[0195] 20只小鼠被派分为两(2)组，每组十只(10)小鼠：
[0196] 第1组：LF82SK-移植的小鼠
[0197] 第2组：LF82SK-移植的小鼠+噬菌体
[0198] 在第0天之前3天，向所有动物的饮用水中添加链霉素(5g/L)，在整个实验中保持。
[0199] 在第0天，向两个组给予LF82SK，以使该菌株定殖在小鼠的肠内。
[0200] 在第3天，通过灌胃向第2组的小鼠给予噬菌体(P2+P6+P8+CLB_P2的混合物，每种108pfu/mL)。
[0201] 在第4和7天，每组中有5只小鼠被处死以评估回肠、结肠和排泄物中的细菌和噬菌体的数量。使用 组织DNA纯化试剂盒将来自两个组的100μl 的回肠和结肠的匀浆进行全血DNA提取。
[0202] 结果：
[0203] 粪便中的LF82水平：
[0204] 在第4和7天，LF82水平是：
[0205] 第1组中：7 109；1 109cfu/g
[0206] 第2组中：8 107；5 108cfu/g
[0207] 粪便中的噬菌体水平：
[0208] 在第4和7天，噬菌体水平是：
[0209] 第1组中：无
[0210] 第2组中：5 109；6 109pfu/g
[0211] 噬菌体混合物存在条件下的粪便中的LF82水平明显低于其不存在时的情况，这表明噬菌体混合物能够在小鼠肠内感染LF82。
[0212] 器官中的LF82水平：
[0213] 在第4天，LF82水平是：
[0214] 在第1组的回肠中：100％的细菌是E.coli(LF82)
[0215] 在第2组的回肠中：20％的细菌是E.coli(LF82)
[0216] 在第1组的结肠中：40％的细菌是E.coli(LF82)
[0217] 在第2组的结肠中：2％的细菌是E.coli(LF82)
[0218] 在第7天，LF82水平是：
[0219] 在第1组的回肠中：100％的细菌是E.coli(LF82)
[0220] 在第2组的回肠中：50％的细菌是E.coli(LF82)
[0221] 在第1组的结肠中：25％的细菌是E.coli(LF82)
[0222] 在第2组的结肠中：10％的细菌是E.coli(LF82)
[0223] 器官中的噬菌体水平：
[0224] 在第4天，噬菌体水平是：
[0225] 在第1组的回肠中：无
[0226] 在第2组的回肠中：7 108pfu/g
[0227] 在第1组的结肠中：无
[0228] 在第2组的结肠中：5 1010pfu/g
[0229] 在第7天，LF82水平是：
[0230] 在第1组的回肠中：无
[0231] 在第2组的回肠中：7 108pfu/g
[0232] 在第1组的结肠中：无
[0233] 在第4组的结肠中：2 108pfu/g
[0234] 在第2和5天，被噬菌体处理的组中的回肠和结肠中的LF82水平降低了。这表明，噬菌体在肠部分中感染LF82，不仅仅在粪便中。同时，噬菌体水平在第 7天与第2天一样高，表明噬菌体能够在独特的初始给药后在肠内维持数天。
[0235] 实施例8
[0236] 噬菌体传染性的体内试验
[0237] 对被感染LF82SK的CEACAM6小鼠中的噬菌体传染性的体内试验 (P2+P6+P8的混合物)进行如下评估：
[0238] 48只小鼠被派分为如下四组(4)：
[0239] 第1组：非移植的小鼠(8只小鼠)
[0240] 第2组：非移植的小鼠+噬菌体(12只小鼠)
[0241] 第3组：LF82SK-移植的小鼠(16只小鼠)
[0242] 第4组：LF82SK-移植的小鼠+噬菌体(12只小鼠)
[0243] 在第0天之前3天，将DSS(硫酸葡聚糖)0.25％加入到饮用水中，并伴随整个试验过程。
[0244] 在第0天之前1天通过口腔喂食向所有动物给药链霉素(5mg)。
[0245] 在第0天，向第3和4组的小鼠给药LF82SK，从而使得菌株定殖在小鼠的肠中。
[0246] 在第1天，通过在CMC中口腔喂食向第2和4组中的每只小鼠给药噬菌体 (P2+P6+P8的混合物，每种107pfu/mL)。这种给药有许多优势：已知量的噬菌体给药以及即时的胃酸中和。
[0247] 第1天，将第3组的4只小鼠处死以评估噬菌体给药之前在回肠中、在结肠中、在排泄物中的细菌的数量。
[0248] 在第2天，将分别来自于第1、2、3和4组中的4只、6只、6只和6只小鼠处死以评估在回肠中、在结肠中、在排泄物中的细菌的数量。
[0249] 在第5天，将分别来自于第1、2、3和4组中的4只、6只、6只和6只小鼠处死以评估在回肠中、在结肠中、在排泄物中的细菌的数量
[0250] 使用Promega公司的 组织DNA纯化试剂盒将来自四个组的 100μl的回肠、结肠和排泄物匀浆进行全血DNA提取。
[0251] 每日监测重量、粪便稠度和排泄物中血的存在。
[0252] 使用一组引物(SEQ ID NO:44-45)将回肠部分提取的DNA进行定量PCR，以将LF82中的特异基因(pMT1)扩增。结果被表达为该基因的复制份数每克组织。
[0253] LF82 pMT1 F(SEQ ID NO:44)CCATTCATGCAGCAGCTCTTT
[0254] LF82 pMT1 R(SEQ ID NO:45)ATCGGACAACATTAGCGGTGT
[0255] 结果：
[0256] 数值代表每组小鼠获得的中值。
[0257] 在第1组中，LF82和噬菌体在整个实验中都没有被检测到。
[0258] 粪便中的LF82水平：
[0259] 在第1天：第3和4组的LF82水平分别是5 109和6 109cfu/g。
[0260] 在第2、3和5天，LF82水平是：
[0261] 第3组中：3 109；5 108；5 107cfu/g
[0262] 第4组中：5 105；5 105；5 103cfu/g
[0263] 粪便中的噬菌体水平：
[0264] 在第2、3和5天，噬菌体水平是：
[0265] 第2组中：5 105pfu/g；未检测到；未检测到
[0266] 第4组中：1 109；1 107；5 106pfu/g
[0267] 在噬菌体存在下，粪便中的LF82水平显著低于噬菌体不存在的情况。同时，被LF82定殖的小鼠中的噬菌体水平显著高于无LF82的小鼠中的噬菌体水平。两组数据都证实了噬菌体能够在肠内感染LF82。
[0268] 器官中的LF82水平：
[0269] 在第2天的LF82水平是：
[0270] 在第3组的回肠中：2 106份pMT1/g
[0271] 在第4组的回肠中：8 104份pMT1/g
[0272] 在第3组的结肠中：2 107份pMT1/g
[0273] 在第4组的结肠中：1 105份pMT1/g:
[0274] 在第5天的LF82水平是：
[0275] 在第3组的回肠中：5 104份pMT1/g
[0276] 在第4组的回肠中：8 104份pMT1/g
[0277] 在第3组的结肠中：6 106份pMT1/g
[0278] 在第4组的结肠中：2 105份pMT1/g
[0279] 器官中的噬菌体水平：
[0280] 在第2天的噬菌体水平是：
[0281] 在第2组的回肠中：未检测到
[0282] 在第4组的回肠中：8 105pfu/g
[0283] 在第2组的结肠中：5 104pfu/g
[0284] 在第4组的结肠中：5 106pfu/g
[0285] 在第5天的LF82水平是：
[0286] 在第2组的回肠中：未检测到
[0287] 在第4组的回肠中：未检测到
[0288] 在第2组的结肠中：未检测到
[0289] 在第4组的结肠中：2104pfu/g
[0290] 在第2天，在被噬菌体处理的组中，LF82水平在回肠和结肠中均被降低。这表明，噬菌体在肠部中感染LF82，不仅仅在粪便中。同时，被LF82定殖的小鼠的噬菌体水平高于无LF82的小鼠的噬菌体水平。
[0291] 在第5天，回肠中的LF82水平过弱以致看不到两个组之间的差别，而与没有接受噬菌体的组相比，接受噬菌体的组中的结肠样本LF82水平仍然降低了。同时，我们仅仅能够检测到在定殖LF82的小鼠的结肠中的噬菌体。这表明，在初始给药后，噬菌体降低LF82方面的作用可以持续数天。
[0292] 尽管在该实验中观察到了LF82的高定殖水平，但是在任何组中都没有观察到结肠炎的迹象。
具体实施方式
[0293] 本发明尤其涉及以下具体实施方式：
[0294] 1.一种用于治疗炎性肠疾病的药物组合物，包括：
[0295] (i)能够在黏附侵袭性大肠杆菌菌株中产生溶解性感染的至少一种噬菌体菌株；和
[0296] (ii)药学上可接受的载体。
[0297] 2.根据具体实施方式1所述的组合物，其特征在于，黏附侵袭性大肠杆菌菌株存在于主体的一个或多个肠部位(大肠和小肠)。
[0298] 3.根据具体实施方式1所述的组合物，其特征在于，，黏附侵袭性大肠杆菌菌株是LF82、07081、07082、07076或06075。
[0299] 4.根据具体实施方式1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述炎性肠疾病是克罗恩病或溃疡性结肠炎或手术后回肠病变的复发，所述手术例如是去除CD患者的小肠的至少一部分的手术。
[0300] 5.根据具体实施方式1至4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P1相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P2相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3 或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P3相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P4相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P5相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P5 相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P6相同的溶解活性和相同的表型特征，保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株P8相同的溶解活性和相同的表型特征，以及保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为 CNCM I-4675的噬菌体菌株CLB_P2或其变种，所述变种具有与所述噬菌体菌株 CLB_P2相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株CLB_P2相同的溶解活性和相同的表型特征中的至少一种。
[0301] 6.根据具体实施方式1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于口服施用。
[0302] 7.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4694的噬菌体菌株P1或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0303] 8.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4695的噬菌体菌株P2或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0304] 9.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4696的噬菌体菌株P3或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0305] 10.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4697的噬菌体菌株P4或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0306] 11.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4698的噬菌体菌株P5或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0307] 12.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4699的噬菌体菌株P6或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0308] 13.保藏在巴斯德研究院的法国微生物国家保藏中心的保藏号为CNCM I-4700的噬菌体菌株P8或其变种，其中所述变种具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性，优选具有与所述噬菌体菌株相同的溶解活性和相同的表型特征。
[0309] 打印(原始为电子形式)
[0310] (该表格不是国际申请的一部分并且不视为国际申请的表格)
[0311]
[0312]
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[0330] 仅供接收局使用
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