一种复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法转让专利
申请号 : CN201510745637.8
文献号 : CN105410358B
文献日 : 2019-09-27
发明人 : 邓先余 , 陈晗 , 门文卉 , 李先永 , 林连兵 , 郭军
申请人 : 昆明理工大学
摘要 :
本发明公开一种复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，该方法是采用库氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，该方法将库氏毕赤酵母与融合魏斯氏菌分别活化培养，至有效活菌数≥1010CFU/mL，混合后添加到水与粉碎后的橡胶籽仁混合的培养基中培养；经研究发现，复合发酵对氰化物的脱除效果均很好，氰化物脱除率均在88.9%以上。乳酸菌产酸能抑制杂菌生长，酵母发酵增加香味，在保证橡胶籽不变质的前提下，有效脱除氰化物。
权利要求 :
1.一种复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）将库氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）菌种在30℃-37℃分别活化至有效活菌数≥1010CFU/mL；
（2）将步骤（1）活化好的两种菌液按体积比1-2:1-2的比例混合；
（3）按体积百分比5-10%的比例将混合菌液接种在发酵培养基中，在20℃-37℃下静置培养120-144h获得发酵后橡胶籽，发酵完成后制得脱除氰化物的发酵橡胶籽，其中发酵培养基是水和粉碎到20-60目的橡胶籽按质量比1-2:1-2的比例混合后制得。
说明书 :
一种复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 橡胶（Hevea brasiliensis）大戟科乔木，高可达30米，有丰富乳汁。橡胶树是一种典型的热带作物，原产巴西；现广泛栽培于亚洲热带地区。云南河口、西双版纳、瑞丽种植较多；广东、广西、海南、福建南部和台湾有栽培。蒴果椭圆形，直径5-6厘米，有3纵沟，顶端有喙尖，基部略凹，外果皮薄，下后有网状脉纹，内果皮厚，木质；种子椭圆形，浅灰褐色，有斑纹。橡胶籽是橡胶树的副产物。过去很长时间，大量的橡胶籽没有得到合理的综合利用，被作为废弃物丢弃与橡胶林地中腐烂。橡胶籽仁含油40%-50%。在橡胶籽油的脂肪酸组成（其含软脂酸：5%-10%，油酸：20%-28%，亚油酸：30%-42%，亚麻酸：15%-22%）中，不饱和脂肪酸占80%以上，其中多不饱和脂肪酸占50%以上，而饱和脂肪酸仅占16.5%-17.5 %。C18:3是n-3家族多不饱和脂肪酸的前体，机体摄入后可转变为DHA和EPA，DHA对脑神经生长发育、婴儿视觉发育、儿童智能发育和抗过敏、增强免疫有至关重要的作用。EPA具有帮助降低胆固醇和甘油三酯的含量，促进体内饱和脂肪酸代谢，从而起到降低血液粘稠度，增进血液循环，提高组织供氧而消除疲劳，二者在医药保健方面具重要价值，然而橡胶籽粕中氨基酸含量与豆粕很相似，脱除氰化物以后可作为饲料资源使用。因此作为一种废弃物，橡胶籽有巨大的开发价值。
[0003] 氰化物是指含氰基的化合物，植物中的氰化物是以苷形式存在的氢氰酸有机衍生物，即使氰甙本身无毒性，但当其水解释放出游离的氰化氢后，就会引起动物中毒。富含氰甙的植物有青饲料木薯、高粱和玉米的幼苗、亚麻以及蔷薇科植物的叶子和种子。氰离子对细胞线粒体内呼吸链的细胞色素氧化酶具有很高的亲和力，与细胞色素氧化酶的结合后使之失去活性，从而阻断细胞呼吸和氧化磷酸化过程。细胞色素氧化酶是以铁卟啉为辅基的蛋白质，含有两个血红素A基团和两个铜原子，分别为细胞色素a和a3。a和a3两个成分至今未能分离，故将细胞色素a和a3合称为细胞色素氧化酶。在化学结构上，血红素a和a3具有一致性。近年来的研究指出，可能血红素a和a3结合于不同的蛋白亚基上。氢氰酸对细胞色素氧化酶的抑制作用，主要是—C≡N与细胞色素a3中的铁离子（Fe3+）配位结合，阻止其还原成Fe2+所造成。由于橡胶籽中含有少量的生氰葡萄糖苷，分子中含有氰基 (—C≡N )，其化学性质不稳定，可被植物中的酶或稀酸水解，因此橡胶籽粕或饼使用前均须脱毒。
[0004] 1969年首次发现某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，此后，用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注。库氏毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白，有很好的发酵基础，其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。魏斯氏菌属于乳酸菌，常被发现于泡菜等腌制食品中，其在卫生、医学、发酵、食品加工等方面的作用开始受到广泛关注。微生物发酵脱除方法有单一发酵脱毒和复合发酵脱毒，单一发酵脱毒的研究和开发较多，目前的发展趋势是研制复合发酵。复合发酵能适应多种环境条件，达到更好的效果。
发明内容
[0005] 针对现有微生物复合发酵脱除氰化物的研究较少，本发明的目的在于提供一种库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌混合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法。
[0006] 本发明方法具体步骤如下：
[0007] （1）将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母以体积百分比的5%的比例接种于5mL YPD10
液体培养基中30℃-37℃摇床培养15-24h，至有效活菌数≥10 CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌以体积百分比的5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，30℃-37℃摇床培养15-24h，至有效活菌数≥1010CFU/mL；
液体培养基中30℃-37℃摇床培养15-24h，至有效活菌数≥10 CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌以体积百分比的5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，30℃-37℃摇床培养15-24h，至有效活菌数≥1010CFU/mL；
[0008] （2）将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比1-2:1-2混合后，再按体积百分比5%-10%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在20℃-37℃条件下静置培养120-144h，发酵完成后制得脱出氰化物的发酵橡胶籽，其中发酵培养基是水和粉碎到20-60目的橡胶籽按质量比1-2:1-2的比例混合后制得。
[0009] 上述库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌的活化中所用的液体培养基成分分别为：①YPD液体培养基组成为酵母浸粉10.0g/L、蛋白胨20.0g/L、葡萄糖20.0g/L。
[0010] ②MRS培养基组成为蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母粉5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0g/L、硫酸镁（MgSO4）0.58g/L、硫酸锰（MnSO4）0.25g/L、碳酸钙（CaCO3）10.0g/L、吐温-80 1.0 mL/L。
[0011] 本发明的菌株均为食源性的微生物，库氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）可用于酿造果酒，融合魏斯氏菌（Weissella confusa）可用于酿造酱油，因此安全性可以得到保证；其次微生物复合发酵脱毒的效果比单一发酵的效果好很多，乳酸菌产酸能抑制杂菌生长，酵母发酵增加香味，在保证橡胶籽不变质的前提下，更有效脱除氰化物。经实验研究，该两种菌株不同比例复合发酵对氰化物的脱除效果均很好，氰化物脱除率均在88.9%以上。本发明所述菌种均可以从美国模式培养物集存库(ATCC) 和中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买得到，菌株号分别为ATCC-24210和CICC-23406。
具体实施方式
[0012] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0013] 实施例1：本库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌混合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，具体操作如下：
[0014] （1）将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母按体积百分比5%的比例接种于5mL YPD液体培养基中30℃摇床培养18h，至有效活菌数≥1010CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌按体积百分比5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，37℃摇床培养16h，至有效活10
菌数≥10 CFU/mL；
菌数≥10 CFU/mL；
[0015] （2）将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比1:1混合后，再按体积百分比5%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在25℃条件下静置发酵培养144h，其中发酵培养基成分为水和粉碎后的橡胶籽过20目筛，两者比例为1:1，发酵完成后制得脱出氰化物的发酵橡胶籽。经检测，发酵后氰化物含量由90 mg/kg下降至发酵后的9.4 mg/kg，降解率为89.6%，且橡胶籽粉发酵后未变色，无臭味，有淡淡酒香（见表1）。
[0016] 其中MRS液体培养基配方为蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖 (C6H12O6·H2O)20.0g/L，磷酸氢二钾 (K2HPO4·3H2O)2.0g/L，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H5O7] 2.0g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O) 0.2g/L，硫酸锰 (MnSO4)0.04g/L，吐温-80 1.0mL/L ，115℃条件灭菌30min。
[0017] YPD液体培养基组成为酵母浸粉10.0 g /L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，115℃条件灭菌30min。
[0018] 实施例2：本复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，具体操作如下：
[0019] （1）将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母按体积百分比5%的比例接种于5mL YPD液10
体培养基中32℃摇床培养20h，至有效活菌数≥10 CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌以5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，35℃摇床培养20h，至有效活菌数≥
1010CFU/mL；
体培养基中32℃摇床培养20h，至有效活菌数≥10 CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌以5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，35℃摇床培养20h，至有效活菌数≥
1010CFU/mL；
[0020] （2）将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比2:1混合后，再按体积百分比8%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在30℃条件下静置培养144h，其中发酵培养基成分为水和粉碎后的橡胶籽过40目筛，两者比例为1:2，发酵完成后制得脱出氰化物的发酵橡胶籽。经检测，发酵后氰化物含量由90 mg/kg下降至发酵后的10 mg/kg，降解率为88.9%。且橡胶籽粉发酵后未变色，无臭味，有淡淡酒香（见表1）。
[0021] 其中MRS液体培养基配方为蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H5O7] 2.0g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O) 0.2g/L，硫酸锰(MnSO4)0.04g/L，吐温-80 1.0mL/L ，115℃条件灭菌30min。
[0022] YPD液体培养基组成为酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，115℃条件灭菌30min。
[0023] 实施例3：本复合发酵橡胶籽脱除氰化物的方法，具体操作如下：
[0024] （1）将纯化后冷冻保存的库氏毕赤酵母按体积百分比5%的比例接种于5mL YPD液体培养基中30℃摇床培养24h，至有效活菌数≥1010CFU/mL；将纯化后冷冻保存的融合魏斯氏菌以5%的接种量接种于5mL MRS液体培养基中，30℃摇床培养培养24h，至有效活菌数≥1010CFU/mL；
[0025] （2）将活化好的库氏毕赤酵母和融合魏斯氏菌按菌液体积比1:2混合后，再按体积百分比10%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在37℃条件下静置培养120h获得，其中发酵培养基是水和粉碎到20目左右的橡胶籽粉过60目筛，两者比例为2:1，发酵完成后制得脱除氰化物的发酵橡胶籽；发酵后氰化物含量由90 mg/kg下降至发酵后的10 mg/kg，降解率为88.9%。且橡胶籽粉发酵后未变色，无臭味，有淡淡酒香（见表1）。
[0026] MRS液体培养基配方为蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H5O7] 2.0g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O) 0.2g/L，硫酸锰(MnSO4)
0.04g/L，吐温-80 1.0mL/L ，115℃条件灭菌30min。
0.04g/L，吐温-80 1.0mL/L ，115℃条件灭菌30min。
[0027] YPD液体培养基组成为酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L， 115℃条件灭菌30min。
[0028] 橡胶籽粉发酵情况对比见表1。
[0029] 表1 橡胶籽粉发酵情况对比
[0030] 。