基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物的制备方法

摘要

本发明涉及基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物，属于寡糖合成技术领域，其结构式为：该化合物适用于肿瘤疫苗GM3的合成研究。本发明还提供了该化合物的制备方法，合成路线简洁，操作简单，原料成本低，通用性强，糖基化反应立体选择性好，适用于各类寡糖化合物的合成。

权利要求

1.一种用于合成GM3的关键中间体二糖化合物的制备方法，所述的关键中间体二糖化合物的结构式为：其特征在于，所述的制备方法以葡萄糖为起始原料通过一系列反应得到单糖受体化合物9；以半乳糖为起始原料通过一系列反应得到单糖供体化合物15；然后单糖受体化合物9和单糖供体化合物15通过糖苷化脱保护得到目标化合物；其中，单糖受体化合物9的结构式为：单糖供体化合物15的结构式为：

2.如权利要求1所述的关键中间体二糖化合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的合成路线为：

说明书

基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体地说，是基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物的制备方法。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤严重威胁着人类健康，世界卫生组织下属的国际癌症研究机构在位于法国里昂的总部发表了《2014年世界癌症报告》。该报告显示，全球癌症负担正在以惊人的速度不断加重，平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症。预计在未来20年达到每年2200万的水平，同期癌症死亡人数也将飙升至1300万。无论是发达国家还是发展中国家，癌症都已经成为人类死亡的主要杀手之一。目前，临床常用的抗肿瘤药物存在毒性大且远期疗效差等不足。因此，研究开发新结构类型抗肿瘤化合物，探究其合成条件，具有重要的理论意义。

[0003] 肿瘤抗原疫苗已经成为当今肿瘤治疗学的热点，在新药研发方面前景可观。细胞表面糖抗原为新型抗肿瘤疫苗研制提供新的方向。GM3是细胞表面的重要唾液酸三糖抗原，具有多种生物学功能。GM3可诱导脂类癌细胞的分化；促进血管内皮细胞蛋白激酶A的活性，抑制蛋白激酶C的活性，调节血脑屏障；GM3还可调节跨膜间钙离子的传递，在细胞生长、分化过程中发挥重要作用，对细胞的一些代谢起重要的调节作用；调节受体与酶的特异结合，抑制免疫反应及瘤交联；另外，GM3还可直接促神经组织的再生。GM3在多种肿瘤细胞均有表达，是设计治疗癌症疫苗的一个非常重要的靶标。随着肿瘤治疗学研究的不断深入，GM3的合成及药理研究逐渐成为人们关注的焦点。

[0004] 对于GM3的合成，传统的方法是唾液酸和保护好的乳糖进行糖苷化反应，而保护好的乳糖常规合成方法是以乳糖为起始原料，通过一系列反应得到3,4位羟基裸露，其他位置羟基用乙酰基保护的乳糖，此类方法合成的反应效率较低，并且过程中反应原料和产物的分离有极大困难。本发明旨在用一种较为简易的方法来合成保护好的乳糖，是以葡萄糖和半乳糖为起始原料，其合成路线至今未见报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物。

[0006] 本发明的再一的目的是，提供一种基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物的制备方法。

[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于合成GM3的关键中间体二糖化合物，所述的关键中间体二糖化合物的结构式为：

[0009]

[0010] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的制备方法以葡萄糖为起始原料通过一系列反应得到单糖受体化合物9；以半乳糖为起始原料通过一系列反应得到单糖供体化合物15；然后单糖受体化合物9和单糖供体化合物15通过糖苷化脱保护得到目标化合物；其中，单糖受体化合物9的结构式为：

[0011]

[0012] 单糖供体化合物15的结构式为：

[0013]

[0014] 所述的制备方法的合成路线为：

[0015]

[0016] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的关键中间体二糖化合物在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

[0017] 所述的关键中间体二糖化合物在制备GM3中的应用。

[0018] 本发明优点在于：

[0019] 1、本发明提供了一种基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物，乳糖的保护基团上面引入苄基为后面的监测带来方便，二糖化合物的中葡萄糖的端位引入叠氮乙醇更加容易。通过该关键中间体二糖化合物可高效合成抗肿瘤疫苗GM3。

[0020] 2、本发明的关键中间体二糖化合物合成路线简洁，操作简单，原料成本低，通用性强，糖基化反应立体选择性好，适用于各类寡糖化合物的合成。

具体实施方式

[0021] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0022] 本发明提供了基于抗肿瘤疫苗GM3关键中间体二糖化合物1，其结构如下：

[0023]

[0024] 式1目标化合物1的结构

[0025] 上述化合物的制备方法：以葡萄糖为起始原料通过保护脱保护等一系列反应得到单糖受体化合物9；以半乳糖为起始原料通过保护脱保护等一系列反应得到单糖供体化合物15；然后单糖受体化合物和单糖供体化合物通过糖苷化脱保护得到目标化合物1。

[0026] 单糖受体化合物9的合成

[0027] 以葡萄糖2为起始原料，其上羟基经过乙酰化保护，得到化合物3，化合物3在三氟化硼乙醚的催化下，与2-氯乙醇反应生成化合物4，化合物4再与叠氮化钠反应得化合物5，化合物5在甲醇甲醇钠的作用下，脱去保护基生成化合物6，在试剂PhCH(OCH3)2作用下，化合物7选择性保护C4位、C6位上羟基，然后对化合物7上裸露羟基进行保护得化合物8，在THF.HCl和NaCNBH3的作用下，化合物8选择性开环，得到二糖受体化合物9。合成路线如下：

[0028]

[0029] 式2单糖受体化合物9的合成路线

[0030] 反应条件:(a)Ac2O/NaOAc,reflux,2h；(b)HOCH2CH2Cl,BF3·Et2O, M.S.,DCM,rt,10h；(c)NaN3,DMF,18-crown-6,85℃,5h；(d)NaOCH3(cat.),MeOH,rt,2h；(e)PhCH(OCH3)2,Camphorsulfonic acid,DMF,rt,5h；(f)Ac2O,pyridine,rt,overnight；(g)NaCNBH3,Methyl Orange, M.S.,THF,THF.HCl,0℃,2h.

[0031] 单糖供体化合物15的合成

[0032] 以半乳糖10为起始原料，经过乙酰化反应，对其羟基进行保护，得到化合物11，化合物11在三氟化硼乙醚催化下，与乙硫醇反应生成化合物12，化合物12在甲醇和甲醇钠的作用下生成化合物13，在试剂丙酮叉作用下，化合物13选择性保护C3位和C4位羟基，然后化合物14在吡啶中与醋酸酐反应生成化合物15。合成路线如下：

[0033]

[0034] 式3供体化合物15的合成路线

[0035] 反应条件:(a)Ac2O/NaOAc,reflux,3h；(b)EtSH,BF3·Et2O, M.S.,DCM,rt,10h；(c)NaOCH3(cat.),MeOH,rt,2h；(d)Me2C(OCH3)2,(1S)-(+)-10-Camphorsulfonic acid,DMF,rt,3h；(e)Ac2O,pyridine,rt,overnight.

[0036] 目标化合物1的合成

[0037] 单糖供体化合物15和单糖受体化合物9，糖苷化反应生成二糖化合物16，在65％醋酸的作用下，化合物16脱掉保护基丙酮叉，得二糖受体化合物1。合成路线如下：

[0038]

[0039] 式4目标化合物1的合成路线

[0040] 反应条件:(a)NIS, M.S.,AgOTf,DCM,0℃,2h；(b)65％acetic acid in H2O,65℃,3h

[0041] 上述制备方法中涉及的具体化合物的制备如下：

[0042] 实施例1化合物3的制备

[0043] 1000ml三颈瓶，加入NaOAc(16.0g,0.20mol)，200ml Ac2O将其溶解，加热搅拌，当温度升至100℃时，向反应瓶中缓慢加入化合物2(53.0g,0.32mol)，以及76ml Ac2O，继续加热反应3h。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.5)检测，反应完全后，停止加热，并迅速将反应体系转移至冰水浴中，并用恒温恒压滴液漏斗向其中逐滴滴加甲醇250ml，除去多余的醋酸酐。反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，蒸干溶剂，固体用甲醇重结晶。得白色泡沫状固体3(80.0g,52.3％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.72(d,J＝8.2Hz,1H),5.30-5.21(t,J＝9.0Hz,1H),5.19-5.10(m,2H),4.30(dd,J＝12.5,4.5Hz,1H),4.11(dd,J＝12.5,2.1Hz,
1H),3.84(m,1H),2.12,2.09,2.04,2.04,2.02(5s,5×3H,-OAc).

[0044] 实施例2化合物4的制备

[0045] 100ml茄形瓶，加入17(5.0g,11.98mmol)，加入15ml二氯甲烷将其溶解，再加入HOCH2CH2Cl(1.6ml,23.96mmol)，以及粉末状分子筛2.5g，氮气保护下室温搅拌1h。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.7)检测，反应完全。将反应体系转移至冰水浴，在向其中缓慢加入BF3.Et2O(6.0ml,47.92mmol)，继续反应9h。用三乙胺将反应液的pH调至7～8，并用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1.5:1)。得白色泡沫状固体4(3.2g,60.0％)。

[0046] 实施例3化合物5的制备

[0047] 100ml茄形瓶，加入化合物4(2.6g,6.33mmol)，15ml DMF将其溶解，再加入叠氮化钠(2.1g,31.62mmol)，18-O-6(167mg,0.63mmol)，85℃加热反应5h。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.6)检测，反应完全。用三乙胺将反应液的pH调至7～8，并用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，
1
减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1.5:1)。得白色泡沫状固体5(2.05g,99.0％)。H NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.22(t,J＝9.4Hz,1H),5.15-4.97(m,2H),4.61(t,J＝8.4Hz,1H),4.31-
4.11(m,2H),4.04(m,1H),3.78-3.62(m,2H),3.50(m,1H),3.37-3.23(m,1H),2.09(s,3H,-OAc),2.06(s,3H,-OAc),2.03(s,3H,-OAc),2.01(s,3H,-OAc).

[0048] 实施例4化合物6的制备

[0049] 50ml茄形瓶，加入化合物5(500mg,1.20mmol)，加入10ml甲醇将其溶解，再加入NaOCH3(12.9mg,0.24mmol)，氮气保护下室温反应2h。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.05)检测，反应完全。用酸性离子交换树脂将反应液的pH调节至4～5，过滤，减压浓缩，离心干燥。得棕色固体6(280mg,93.3％)，继续下一步反应。

[0050] 实施例5化合物7的制备

[0051] 50ml茄形瓶，加入6(280mg,1.12mmol)，加入10ml DMF将其溶解，再加入phCH(OMe)2(0.25ml,1.69mmol)，D-樟脑-10-磺酸(26mg,0.11mmol)，氩气保护下室温反应5h。TLC(EA:MeOH＝8:1,Rf＝0.8)检测，反应完全。用三乙胺将反应液的pH调至7～8，减压浓缩，得类白色固体7(2.0g,55.6％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.58-7.44(m,2H,aromatic H),
7.44-7.33(m,3H,aromatic H),5.56(s,1H,phCH(O)2-),4.47(d,J＝7.7Hz,1H,H-1),4.36(dd,J＝10.5,4.9Hz,1H),4.15-4.03(m,1H),3.92-3.72(m,3H),3.65-3.46(m,4H),3.41(m,
1H).

[0052] 实施例6化合物8的制备

[0053] 50ml茄形瓶中加入化合物7、DMAP(6mg,0.05mmol)和Ac2O 4ml，再加入吡啶8ml，混匀，氩气保护下室温反应。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.8)检测，反应完全。用甲醇除去反应液中多余的醋酸酐，反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝2.5:1)。得类白色固体8(290mg,90.8％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.70-7.32(m,5H,aromatic H),5.52(s,1H,phCH(O)2-),5.34(t,J＝9.4Hz,1H),5.11-4.98(m,1H),4.68(d,J＝7.8Hz,
1H,H-1),4.38(dd,J＝10.5,4.8Hz,1H),4.10-3.99(m,1H),3.88-3.66(m,3H),3.62-3.41(m,2H),3.32(m,1H),2.08(s,3H,-OAc),2.06(s,3H,-OAc).

[0054] 实施例7化合物9的制备

[0055] 100ml茄形瓶，加入化合物8(1.43g,3.41mmol)，加入20ml四氢呋喃(重蒸)将其溶解，再加入NaCHBH3(2.2g,34.1mmol)，适量的甲基橙，以及粉末状分子筛2.0g，混匀，氩气保护下室温反应2h。TLC(PE:EA＝2:1,Rf＝0.3)检测，反应完全。用三乙胺将反应液pH调至中性，并用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝2:1)。得棕色粘稠状固体9(1.2g,90.3％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.42-7.29(m,5H,aromatic H),5.05(t,J＝9.3Hz,1H),4.99-4.91(m,1H),4.74-4.48(m,3H),4.08-3.94(m,1H),3.84-3.61(m,4H),
3.60-3.39(m,2H),3.34-3.19(m,1H),3.06(s,1H),2.08(s,3H,-OAc),2.05(s,3H,-OAc).[0056] 实施例8化合物11的制备

[0057] 500ml单口瓶，加入10(53.0g,0.32mol)，乙酸酐370ml和醋酸钠(16.0g,0.20mol)，140℃条件下加热反应。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.5)检测，反应完全后，将反应体系转移至冰水浴中，并向其中缓慢加入350ml甲醇，反应2h。反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1:1)。得白色泡沫状固体11(80.0g,52.3％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.70(d,J＝8.3Hz,1H),5.43(d,J＝3.2Hz,1H),5.34(m,1H),5.08(dd,J＝10.4,
3.4Hz,1H),4.14(m,2H),4.06(dd,J＝12.2,5.5Hz,1H),2.17,2.13,2.05,2.05,2.00(5s,5×3H,-OAc).

[0058] 实施例9化合物12的制备

[0059]

[0060] 式5化合物12的合成路线

[0061] 250ml茄形瓶，加入化合物11(10.0g，0.0256mol)，加入25ml二氯甲烷将其溶解，再加入乙硫醇3.84ml和粉末状分子筛5.0g，氮气保护下室温反应1h。将反应体系转移至冰水浴中，并向其中缓慢滴加三氟化硼乙醚12.8ml，继续过夜反应。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.55)检测，反应完全。抽滤，收集滤液，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1:1)。得淡黄色固体12。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.44(d,J＝2.6Hz,1H,H-1),5.26(m,1H),5.05(dd,J＝10.0,3.4Hz,1H),4.50(d,J＝9.9Hz,1H),4.14(m,2H),3.94(t,J＝6.6Hz,1H),2.85-2.60(m,2H,-SCH2CH3),2.16(s,3H,-Ac),2.07(s,3H,-Ac),2.05(s,3H,-Ac),1.99(s,3H,-Ac),
1.29(t,J＝7.4Hz,3H,-SCH2CH3).

[0062] 实施例10化合物13的制备

[0063] 100ml茄形瓶，加入化合物12(2.0g,5.10mmol)，加入20ml甲醇将其溶解，再加入甲醇钠(55mg,1.02mmol)，氮气保护下室温反应2h。TLC(EA:MeOH＝8:1,Rf＝0.8)检测，反应完全。用酸性离子交换树脂将反应液的pH调至4～5，过滤，减压浓缩，离心干燥。得棕色固体13(1161mg,93.3％)，继续下一步反应。

[0064] 实施例11化合物14的制备

[0065] 100ml茄形瓶，加入化合物13(1150mg,5.10mmol)，加入20ml DMF将其溶解，再加入Me2C(OMe)2(0.95ml,7.70mmol)，对甲苯磺酸(98mg,0.51mmol)，氮气保护下室温反应。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.2)检测，反应完全。用三乙胺将反应液的pH调至7～8，并用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤有机相两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1:1)。得棕色固体14(1.1g,86.1％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:4.27(d,J＝10.2Hz,1H,H-1),4.22(m,1H),4.14-4.07(m,
1H),3.99(m,1H),3.93-3.86(m,1H),3.81(dd,J＝11.2,3.8Hz,1H),3.57(dd,J＝10.2,
7.1Hz,1H),2.81-2.72(m,2H,-SCH2CH3),1.53(s,3H,-CH3),1.37(s,3H,-CH3),1.35-1.27(m,3H,-SCH2CH3).

[0066] 实施例12化合物15的制备

[0067] 100ml茄形瓶，加入化合物14(1.0g,3.78mmol)，加入10ml吡啶将其溶解，再加入DMAP(46mg,0.38mmol)，Ac2O(5.3ml,56.75mmol)，混匀，氩气保护下室温反应。TLC(PE:EA＝1:1,Rf＝0.8)检测，反应完全。用甲醇除去反应液中多余的醋酸酐，并用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝1:1)。得棕色粘稠状固体15(624mg,65.0％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:5.01(m,1H),4.42-4.29(m,3H),4.23-4.14(m,2H),4.04-3.94(m,
1H),2.77-2.61(m,2H,-SCH2CH3),2.11(s,3H,-OAc),2.09(s,3H,-OAc),1.55(s,3H,-CH3),
1.34(s,3H,-CH3),1.27(t,J＝7.4Hz,3H,-SCH2CH3).

[0068] 实施例13化合物16的制备

[0069] 100ml茄形瓶，加入化合物9(1.23g,3.54mmol)和15(1.0g,2.36mmol)，加入15ml二氯甲烷将其溶解，再加入粉末状分子筛1.0g，混匀，氩气保护下室温搅拌过夜。再向反应体系中加入NIS(1.60g,7.09mmol)，继续搅拌1h；将反应体系转移至冰水浴中，并向其中加入AgOTf(61mg,0.21mmol)，反应1h。TLC(PE:EA＝2:1,Rf＝0.4)检测，反应完全。抽滤(硅藻土助滤)，用二氯甲烷洗涤滤饼，收集滤液，有机相用15％硫代硫酸钠洗涤两次，饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝4:1～PE:EA＝3:1)。得浅棕色固体16(1.0g,59.8％)。HR-MS Calcd for C32H43N3O15[M+Na]+:732.2592；found:732.2587。

[0070] 实施例14目标化合物1的制备

[0071] 100ml茄形瓶，加入16(820mg,1.16mmol)，15ml 65％的乙酸将其溶解，75℃条件下加热反应1.5h。TLC(EA,Rf＝0.3)检测，反应完全。停止加热，冷却至室温。反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤两次，再用饱和碳酸氢钠溶液与饱和氯化钠溶液分别洗涤两次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(PE:EA＝3:1～PE:EA＝2:1)。得棕色固体1(360mg,46.5％)。

[0072] 实施例15GM3的制备

[0073]

[0074] 目标化合物1与N-乙酰神经氨酸、亲脂的神经酰胺(Cer)等通过一系列反应合成GM3。经1H NMR分析为GM3，得率高。

[0075] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。