一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法

摘要

一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法，属于植物器官组织增殖培养的方法。本发明将金铁锁不定根组织块接种于MS+1.0mg/L IBA+30g/L白砂糖或MS+1.0mg/L KT+30g/L白砂糖的固体培养基中培养不定根，其中在MS+1.0mg/L KT+30g/L白砂糖的培养基中产生的不定根干重和干物率较高，而以30g/L白砂糖为MS固体培养基的碳源时，其干物率优于葡萄糖，成本低于蔗糖。以上条件于40d内可获得较丰富的金铁锁不定根。本发明可为产业化生产实践提供依据和指导。

权利要求

1.一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法,包括:(1) 切取金铁锁无菌苗的顶芽接种于1/2MS+0.3mg/L IBA +0.1mg/L NAA+0.3g/L活性炭的生根培养基中，于60d后形成毛状不定根丛；

其特征是：

（2）按块状方式切取扩繁后的金铁锁不定根丛，接种于添加了激素和白砂糖的MS固体基本培养基中，每瓶分装25mL的培养基，每瓶接种4块金铁锁不定根丛；

所述的培养基为以下之一种：

（1） MS固体基本培养基与生长素的结合：MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L IBA；

（2）MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合：MS+30g/L白砂糖+1.0mg/LKT；

以上（1）（2）培养条件为：25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500 2000lx,培养时间~ ~

40d。

2.根据权利要求1所述的金铁锁不定根快速增殖培养的方法，其特征是：所述的培养基为MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合：MS+1.0 mg/L KT。

3.根据权利要求1或2所述的金铁锁不定根快速增殖培养的方法，其特征是：接种于所述的培养基的金铁锁不定根组织块为0.05g/块，该组织块干重为0.0056±0.0004 g/块。

说明书

一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物器官组织培养，特别是药用植物不定根培养基。

背景技术

[0002] 金铁锁（Psammosilene  tunicoides  W.C.Wu et  C.Y.Wu）为石竹科（Caryophyllaceae）金铁锁属（Psammosilene）单种属多年生药用草本植物，又名昆明沙参、独定子等。金铁锁根含皂苷成分，并含氨基酸、有机酸、三萜等，其根干燥后入药，是云南白药、雪上一枝蒿、痛血康胶囊、金骨莲胶囊等的主要成分。我国缺乏中药资源有效保护措施，野生资源濒临灭绝，以人工培养和产业化生产可弥补植物资源的匮乏。金铁锁不定根的培养主要受外植体、接种量、植物激素、蔗糖以及无机盐等几方面的影响。相关报道中，赵爽和李景滨曾分别利用发根农杆菌金铁锁获得毛状根，并研究金铁锁毛状根的最优培养条件。但该技术需要较高技术和设备条件，尚有局限。（赵爽等. 金铁锁毛状根诱导的初步研究[J].中药材，2012，35（2）：176-179；李景滨等. 金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立[J]. 中国中药杂志，2011, 36(5): 547-551）。文献：“影响金铁锁毛状根生长及皂苷积累的因素”是以发根农杆菌ACCC10060菌株感染金铁锁茎段、叶片诱导出毛状根，经抗卡那霉素筛选培养，获得的毛状根为不定根液体培养材料，分别接种5种添加了外源激素的液体培养基中，以添加NAA、IAA、IBA的1/2MS液体培养基对金铁锁不定根增殖较好，且发现增长率与皂苷产量呈正相关。（田思迪等，时珍国医国药[J]，2012，23(4):824-826.）。另一文献：“不同培养条件对金铁锁毛状根生长的影响”（高帅，王洪峰，侯丽丽，等，广东林业科技[J], 
2012, 28(2):16-21.）选择1/2MS固体培养基为最佳培养基，以发根农杆菌侵染后的不定根为材料进行培养。

[0003] 糖是外植体生长发育形成碳架的元素，同时维持培养基的渗透压。不同种类的糖，分子结构不同，其形式与浓度对不定根生长影响较为明显。以上两篇文献认为蔗糖作为培养基的碳源，金铁锁毛状根生物量积累最大。

发明内容

[0004] 本发明旨在建立一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法，它包括由基本培养基及其与不同种类激素组合构成的培养基体系，以便于根据生产实际选择相应的培养基进行生产，从而降低生产成本，提高效率，为工厂化生产金铁锁不定根提供指导。

[0005] 本发明以下述方法实现：

[0006] （1）切取金铁锁无菌苗的顶芽接种于1/2MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA+ 0.3g/L 活性炭的生根培养基中，于60d后形成毛状不定根丛；

[0007] （2）按块状方式切取扩繁后的金铁锁不定根丛，接种于添加了激素和白砂糖的MS固体基本培养基中，每瓶分装25mL的培养基，每瓶接种4块金铁锁不定根丛。

[0008] 进一步，所述的培养基为以下之一种：

[0009] （1）MS固体基本培养基与生长素的组合：MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L IBA；

[0010] （2）MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合：MS+30 g/L白砂糖+1.0 mg/L KT；

[0011] 以上（1）～（2）培养条件为: 25±2℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养时间40d。

[0012] 优选的，所述的培养基为MS固体基本培养基与细胞分裂素的组合：MS+1.0 mg/L KT。

[0013] 进一步，所述的培养基是：接种于所述的培养基的金铁锁不定根组织块为0.05g/块，该组织块干重约合0.0056±0.0004g/块。

[0014] 本发明的显著进步在于：

[0015] （1）本发明通过2种不同组成成分的培养基培养结果认为：除考虑所选材料的基因型不同外，应当以MS固体培养基为金铁锁毛状根的基本培养基，在该基本培养基下，即使不添加激素其鲜重也可以达到较高数值，这与目前一般选择1/2MS培养基不同。

[0016] （2）与现有技术取蔗糖和葡萄糖不同，本发明从不定根生长效果和生产成本考虑：在MS培养基中加入30 g/L的白砂糖更适宜于金铁锁不定根的生长和生物量积累。在30 g/L的白砂糖下，不添加激素其鲜重可达到5.088 g的较高数值，其干重为0.480g，也是较高数值。它反映出：白砂糖作为培养基的补充碳源，以30 g/L的用量，既能有效降低成本，又能获得较高的毛状根产出。

[0017] （3）本发明在添加了30g/L白砂糖的MS基本培养基中附加1.0 mg/L IBA培养金铁锁不定根，也可获得较好的效果。

[0018] （4）评价金铁锁不定根生长情况的指标包括鲜重、干重的生长量及干物率。其中，干物率是指不定根的干重与鲜重的比值，它反映了不定根的净得率。在添加了30g/L白砂糖的MS固体培养基上，本发明改变了金铁锁组织培养的植物激素，在添加1.0 mg/L KT的MS培养基中不定根干重和干物率最高，且与其他处理差异显著，KT更有利于金铁锁不定根的生长。相对于现有文献的数据，该MS+1.0 mg/L KT的固体培养基所获得的金铁锁不定根的干物率为11.96%，其鲜重为173.2 g·L-1，干重为20.72 g·L-1，干重是现有文献的1.52倍。

附图说明

[0019] 图1为WPM基本培养基中不定根生长情况。

[0020] 图2为MS基本培养基中不定根生长情况。

[0021] 图3为MS+30 g/L白砂糖的培养基中不定根生长情况。

[0022] 图4为MS+IBA 1.0 mg/L培养基中不定根生长情况。

[0023] 图5为MS+KT 1.0 mg/L培养基中不定根生长情况。

[0024] 图6为MS+ NAA 0.5 mg/L +KT 0.5 mg/L培养基中不定根生长情况。

[0025] 以上MS是指MS固体培养基，KT是指激动素，IBA是指3-吲哚丁酸，NAA是指α-萘乙酸。

[0026] 以下结合实施例对本发明做进一步说明。本发明包括但不限于实施例的内容。

具体实施方式

[0027] 1材料与方法

[0028] 1.1 材料

[0029] 在无菌条件下，切取金铁锁无菌苗的顶芽接种于1/2MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA+ 0.3g/L活性炭的生根培养基中生根培养，于60天后，培养成毛状不定根丛，备用。

[0030] 1.2 方法

[0031] 接种时，按块状方式切取上述不定根丛进行培养。

[0032] 1.2.1不同基本培养基对金铁锁不定根生物量的影响

[0033] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，干重约合0.0056±0.0004g/块，分别接种于分别添加了30 g/L蔗糖的MS、1/2MS、WPM三种固体基本培养基中，每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接种4块，重复3次，于第40d时测定金铁锁不定根的鲜重、干重。培养条件为: 温度 25±2℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000 lx。下同。

[0034] 1.2.2不同浓度碳源种类对金铁锁不定根生物量的影响

[0035] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，干重约合0.0056±0.0004g/块，分别接种于不同碳源的基本培养基上。该培养基分别加入浓度为20、30及40 g/L的白砂糖、蔗糖和葡萄糖，试验共计9种处理，每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接4块，重复3次，于第40 d时测定金铁锁不定根的鲜重、干重。

[0036] 1.2.3不同浓度生长素对金铁锁不定根生物量的影响

[0037] 基于1.2.1和1.2.2筛选得到的基本培养基和碳源，附加不同浓度的IBA和NAA作为附加了生长素的培养基。

[0038] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，其干重约合0.0056±0.0004g/块，分别接种于附加了生长素的培养基上。试验共计9种培养基处理。每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接4块，重复数为3，于第40 d时测定金铁锁不定根的鲜重及干重。

[0039] 1.2.4不同浓度细胞分裂素对金铁锁不定根生物量的影响

[0040] 基于1.2.1和1.2.2筛选得到的基本培养基和碳源，附加不同浓度的KT、6-BA和TDZ作为附加了细胞分裂素的培养基。

[0041] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，其干重约合0.0056±0.0004g/块，分别接种于附加了细胞分裂素的培养基上。试验共计11种培养基处理，每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接4块，重复数为3，于第40 d时测定金铁锁不定根的鲜重及干重。

[0042] 1.2.5不同激素配比对金铁锁不定根生物量的影响

[0043] 基于1.2.1和1.2.2筛选得到的基本培养基和碳源，附加不同浓度的KT、6-BA、IBA、NAA和TDZ作为附加了外源激素的培养基。

[0044] 切取金铁锁不定根组织块，每块约0.05g，其干重约合0.0056±0.0004g/块，分别接种于附加了外源激素的培养基上，试验共设计8种处理培养基，每处理5瓶，每瓶分装25mL培养基，每瓶接种4块，重复3次，于第40 d时测定金铁锁不定根的鲜重及干重。

[0045] 1.3数据分析

[0046] 所得数据均在SPSS17.0及EXCELL 2007软件中进行统计分析，其中：

[0047] 鲜重：1瓶培养基中新鲜不定根的重量

[0048] 干重：1瓶培养基中新鲜不定根烘干后的重量

[0049] 干物率=干重/鲜重

[0050] 每克糖作用量=1升培养中不定根的干重增加量 /1升培养基中的糖用量[0051] 2结果与分析

[0052] 2.1不同基本培养基对金铁锁不定根生物量的影响

[0053] 金铁锁不定根分别接种于MS、1/2MS、WPM培养基中，接种第4d均可生长出少许嫩白色不定根。其结果见表1。

[0054] 表1 不同基本培养基对金铁锁不定根生物量的影响

[0055]培养基种类 鲜重（g） 干重（g） 干物率% 根生长情况
MS 4.968a 0.474a 9.54a 分枝多且粗，淡黄色
1/2MS 4.018a 0.361b 8.98b 分枝多且粗，淡黄色
WPM 3.599b 0.359c 9.97a 分枝多且细，紫红色

[0056] 注：表中相同列不同字母代表在0.05水平上差异显著，下同。

[0057] 由表1可知，在3种培养基中，不定根分支均较多，从金铁锁不定根生长情况和其鲜重、干重的增长以及干物率来评价，认为MS为金铁锁不定根生长的较优基本培养基（图1）。

[0058] 2.2 不同浓度碳源种类对金铁锁不定根生物量的影响

[0059] 在MS基本培养基中，附加不同浓度和不同种类的碳源，接种后金铁锁不定根生物量的积累情况见表2。

[0060] 表2 不同碳源种类及浓度对金铁锁不定根生物量的影响

[0061]

[0062] 从表2看出，培养40d时，白砂糖和蔗糖在浓度为30g/L和40g/L时，其鲜重和干重均较高，且差异不显著（分别为5.088 g和0.48 g、4.899 g和0.392 g 、5.158 g和0.486 g以及5.956 g和0.515 g）；而以葡萄糖为碳源的培养基，金铁锁不定根的积累效果较差。从每克糖的作用效果来看，在MS基本培养基中加入分别20 g/L、30 g/L蔗糖和30 g/L白砂糖对不定根生物量积累的作用效果之间无显著差异，作用效果最差的是加入40 g/L葡萄糖的MS培养基，其糖的作用量仅为0.250。由于在碳源同样的用量情况下，蔗糖的成本要远高于白砂糖，因此，结合试验结果，并从生产成本的经济角度考虑，30 g/L白砂糖为金铁锁不定根在MS培养基上培养的最适碳源（图2）。

[0063] 2.3不同浓度生长素对金铁锁不定根生物量的影响

[0064] 在分别附加了不同浓度生长素的MS培养基中，金铁锁不定根生物量积累情况见表3。

[0065] 表3不同浓度生长素对金铁锁不定根生物量的影响

[0066]

[0067] 表3显示，金铁锁不定根培养40 d后，IBA浓度为1.0 mg/L时，不定根生长较好，此处理下不定根的鲜重为4.754 g，干重为0.504 g，均显著高于其他处理，且均分别约为对照（2.918 g和0.337 g）的1.5倍；但当IBA浓度为3.0 mg/L时，金铁锁不定根生物量干重仅为0.306 g，为所有处理中的最低值。可见，合适的外源生长素及其浓度是金铁锁不定根生长的必需条件。表3还表明，当培养基为MS+IBA 1.0 mg/L时，其干物率也表现为10.60%较高水平。对金铁锁不定根生物量增长情况综合考虑，在附加有1.0 mg/L IBA+30g/L白砂糖的MS固体培养基中，金铁锁不定根生长较好（图3）。

[0068] 2.4不同浓度细胞分裂素对金铁锁不定根生物量的影响

[0069] 将金铁锁不定根接种于附加有不同浓度细胞分裂素的MS固体培养基中，观察并测定其不定根生物量增加情况。

[0070] 表4不同浓度细胞分裂素对金铁锁不定根生长的影响

[0071]

[0072] 不定根培养40d后，附加有1.0 mg/L KT、0.01 mg/L 6-BA和 0.001 mg/L TDZ的MS培养基中不定根鲜重均较高，且三者之间无显著差异；在附加0.3 mg/L 6-BA 的培养基中，不定根鲜重最低，仅为0.619 g；在MS+ 1.0 mg/L KT的培养基中，不定根干重最高，为0.518g，且与其他处理均差异显著。而所得干重最低的培养基为MS+ 0.3 mg/L 6-BA，该培养基中不定根的干重仅为0.094g。

[0073] 在附加1.0 mg/L KT 培养基中，获得了较高水平的不定根干物率（表4），且不定根生长较好(图4) 。因此，在MS+1.0 mg/L KT+30g/L白砂糖的固体培养基中，金铁锁不定根生长较好。以干重0.518g/25mL计算，MS固体培养基所获得的金铁锁不定根的干重为20.72 g·L-1，是文献“影响金铁锁毛状根生长及皂苷积累的因素”（田思迪等，时珍国医国药[J]，2012，23(4):824-826.）报道的1.52倍。

[0074] （注：按照以上文献，其1/2MS+0.5mg/L IBA干重得率最高，为13.67g/L。与本发明比较，在MS+1.0 mg/L KT的固体培养基中，其干重每25mL为0.518g，则1L的干重为0.518 g/25mL×（40×25mL）=20.72g，故本发明与文献干重得率之比：20.72g/13.67g=1.52倍。）[0075] 2.5不同激素配比对金铁锁不定根生物量的影响

[0076] 金铁锁不定根接种于含有不同生长素与细胞分裂素配比的固体培养基中培养，其结果列于表5。

[0077] 表5不同培养基方案对金铁锁不定根生长的影响

[0078]

[0079] 从表5可以看出，在培养后的第40 d，8个组合的干重存在一定的差异，其中干重最低的为组合MS+0.01 mg/LTDZ +0.05 mg/L NAA+30g/L白砂糖，其干重仅为0.224g；而组合MS+0.5 mg/LNAA +0.5 mg/L KT+30g/L白砂糖，其干重为0.474g（图5），为8个组合的最大值，但均小于MS+1.0 mg/L KT+30g/L白砂糖和1.0 mg/L IBA+30g/L白砂糖中的产出。