地特胰岛素或其类似物的制备方法

摘要

本发明公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，属于胰岛素类似物的制备领域。本发明以B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30蛋白为原料，在未保护desB30蛋白双链N末端α‑氨基的条件下，在pH 8.0‑11的碱性环境下利用活化酯一步选择性地酰化B29位赖氨酸的ε‑氨基，高效生成地特胰岛素或其类似物。本发明对胰岛素前体的酰化反应的pH值、原料比以及酰化时间等参数进行了优化，显著提升了地特胰岛素或其类似物的收率，具有酰化效率高、副产物少、酰化反应时间短、酰化步骤少、工艺简单、生产成本低等优点，为规模化、工业化一步酰化制备地特胰岛素或其类似物提供了一种简捷、高效的方法。

权利要求

1.地特胰岛素的制备方法，包括以下步骤：(1)将人双链胰岛素前体desB30溶解于水相缓冲液中得到desB30前体溶液，调节desB30前体溶液的pH值后加入有机相，混匀得到混合溶液；(2)向混合溶液中加入活化酯溶液进行选择性酰化反应；(3)终止反应，分离纯化，即得；其特征在于：步骤(1)中调节desB30前体溶液的pH值至9.0；

步骤(1)所述水相缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液；

步骤(2)所述选择性酰化反应中，活化酯与人双链胰岛素前体desB30的摩尔比为1∶1；

所述活化酯选自肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯、棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯或辛酸N-琥珀酰亚胺基酯中的任意一种；所述选择性酰化反应的时间为25-60min。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述选择性酰化反应的时间为25-45min。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为50-

120mmol/L，pH值为2-4。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为

100mmol/L，pH值为3。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述活化酯溶液是将活化酯溶解于有机相中，使活化酯的浓度为8-12mg/ml；其中，所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种；

步骤(2)所述选择性酰化反应是利用活化酯酰化人双链胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸的ε-氨基。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述活化酯溶液是将活化酯溶解于有机相中，使活化酯的浓度为10mg/ml；其中，所述有机相为乙醇。

7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述desB30前体溶液中，人双链胰岛素前体desB30的终浓度为4-8mg/ml。

8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述desB30前体溶液中，人双链胰岛素前体desB30的终浓度为6mg/ml。

9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述有机相的体积是混合溶液总体积的30-50％；其中，所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种。

10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述有机相的体积是混合溶液总体积的40％；其中，所述有机相为乙醇。

11.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述选择性酰化反应的温度为15-30℃；步骤(3)所述终止反应为调节反应液的pH值至6.5-7.5。

12.按照权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述选择性酰化反应的温度为25℃；步骤(3)所述终止反应为调节反应液的pH值至7.0。

说明书

地特胰岛素或其类似物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及胰岛素类似物的制备方法，尤其涉及由人双链胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸的ε-氨基选择性酰化生成地特胰岛素或其类似物的方法，属于胰岛素类似物的制备领域。

背景技术

[0002] 糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病，尤其是它所带来的视网膜病变、周围神经病变、糖尿病肾病等并发症严重影响了人们的生活质量。

[0003] 胰岛素及其类似物是最直接和最有效的糖尿病治疗药物，中国胰岛素市场潜力巨大。地特胰岛素(Insulin detemir)是一种中性、可溶的长效胰岛素。它是原型胰岛素去除了B链第30位苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链ε-氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，是一种胰岛素类似物。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性结合，使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。

[0004] 由于胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物都具有位于A1、B1位置氨基酸的游离α-氨基与B29位赖氨酸侧链上的游离ε-氨基，这三种游离氨基均可与活性酯、酰卤或酸酐形成共价键，从而形成单酰化胰岛素、双酰化胰岛素甚至三酰化产物。从诺和诺德申请的多项专利中公开的酰化路线，首先利用二碳酸二叔丁酯(BOC)衍生保护胰岛素两条链的N末端α-氨基，再利用肉豆蔻酸琥珀酰亚胺酯酰化B29位赖氨酸的ε-氨基，最后利用TFA脱保护，生成地特胰岛素。如果酰化剂过量会生成大量的二取代或者三取代衍生物，因此该工艺步骤繁琐、副产物多，会增加下游纯化的难度，同时不利于整体收率的提高。ε-氨基选择性酰化专利(中国专利CN1171742A)中采用一步选择性酰化，在pH 10.5的碱性条件下，利用优选活化酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)进行酰化反应，酸性条件终止反应，该方法虽然在一定程度上提升了酰化效率，其最终的酰化效率仍然不高，距规模化的工业应用尚有一定的距离，有待改进。

[0005] 现有由胰岛素前体通过酰化反应制备地特胰岛素或其类似物的方法中不同程度的存在酰化效率低、副产物多、成本高等缺点。因此，开发一种新的可产业化的酰化效率高、副产物少，生产成本低的地特胰岛素或其类似物的高效制备方法，将为工业化应用奠定重要的基础。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，该方法将B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30，在未保护desB30蛋白双链N末端α-氨基的条件下，利用活化酯一步选择性地酰化B29位赖氨酸的ε-氨基，从而生成地特胰岛素或其类似物。本发明方法的选择性酰化具有效率高、酰化反应时间短、副产物少等优点。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

[0008] 本发明首先公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，包括以下步骤：(1)将人双链胰岛素前体desB30溶解于水相缓冲液中，得到desB30前体溶液，调节desB30前体溶液的pH值，然后加入有机相，混匀得到混合溶液；(2)向混合溶液中加入活化酯溶液，进行选择性酰化反应；(3)终止反应，分离纯化，即得；其中，步骤(1)调节desB30前体溶液的pH值至8.0-11.0；优选的，步骤(1)调节desB30前体溶液的pH值至9.0-9.5，更优选为9.0。

[0009] 步骤(2)所述活化酯溶液是将活化酯溶解于有机相中，使活化酯的浓度为8-12mg/ml，优选为10mg/ml(活化酯溶液要现配现用)。

[0010] 步骤(2)所述选择性地酰化反应中，活化酯与人双链胰岛素前体desB30的摩尔比为4:1-1:4，优选为2:1-1:2，更优选为1:1。其中，所述活化酯选自肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯、棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯中的任意一种；所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种，优选为乙醇。

[0011] 步骤(2)所述选择性地酰化反应是在未保护人双链胰岛素前体desB30蛋白双链N末端α-氨基的条件下，利用活化酯酰化人双链胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸的ε-氨基；其中，当活化酯为肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯时，人双链胰岛素前体desB30经一步选择性酰化，得到的目的产物是地特胰岛素。

[0012] 本发明所述制备方法中，步骤(2)所述选择性酰化反应的时间为15-60min，优选为25-60min，更优选为25-45min。所述选择性酰化反应的温度为室温，即15-30℃，优选为25℃。

[0013] 步骤(1)所述水相缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液；优选的，所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为50-120mmol/L，pH值为2-4；更优选的，所述磷酸氢二钠缓冲液的浓度为100mmol/L，pH值为3。

[0014] 步骤(1)所述desB30前体溶液中，人双链胰岛素前体desB30的终浓度为4-8mg/ml，优选为6mg/ml。步骤(1)所述有机相的体积是混合溶液总体积的30-50％，优选为40％；其中，所述有机相选自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一种，优选为乙醇。

[0015] 本发明所述制备方法中，步骤(3)所述终止反应为调节反应液的pH值至6.5-7.5，优选为7.0。本发明加入1mol/L HCl调节反应液的pH值。

[0016] 一步酰化反应首先需氨基去质子化，其次酰基的供体需要较高的活化能。本发明中当desB30前体溶液的pH在8-11的范围内，优选pH为9，使胰岛素前体在水溶液中ε-氨基处于未离子化，而α-氨基则被重新离子化的状态。本发明通过实验发现，desB30前体溶液的pH值在8-11之间都可以发生酰化反应；其中pH值偏8的条件下，易产生A1，B1位单酰化产物；而pH为9.0与9.5的酰化反应产率较高，pH 9.0的酰化反应产率为81.7％，pH 9.5的酰化反应产率为73％；根据统计学显著性差异计算，p＝0.00021<0.05，说明pH 9.0与pH 9.5的酰化反应产率具有显著性差异。因此，本发明中desB30前体溶液的pH优选9.0。

[0017] 本发明还发现，活化酯与desB30的摩尔比在4:1-1:4之间都可以发生酰化反应；活化酯与desB30的摩尔比在2:1-1:2之间时酰化反应产率达70％-87.2％。活化酯加入量少，会导致desB30有未酰化的；活化酯加入量过高，会导致产生大量的二酰化。因此，最优选为活化酯与desB30的摩尔比为1:1，酰化反应产率达到87.2％，达到优化的条件下还可减少成本。

[0018] 本发明通过实验发现，在优选的条件下，酰化反应进行25min即可达到86.8％的酰化率，时间继续加长，对酰化率的影响不大，酰化反应45min的酰化率为86％、60min的酰化率为85.7％。

[0019] 本发明通过将人双链胰岛素前体desB30在不同的缓冲液下溶解然后与活化酯进行酰化反应，结果表明，磷酸氢二钠的效果比硼酸好，因为硼酸溶液存在下会产生一个较大脱氨杂峰，影响酰化率。因此，本发明的水相缓冲液优选为磷酸氢二钠缓冲液。

[0020] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0021] 本发明建立了一种采用活化酯一步选择性酰化胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸侧链ε-氨基转化成地特胰岛素或其类似物的方法。利用该方法酰化目的产物的得率超过80％，二酰化产物低于6％。本发明在pH7.0碱性条件下终止反应，便于下一步阴离子纯化的上样。本发明的酰化反应时间较短，副产物少，整体收率增加，生产成本明显降低，对于规模化、工业化制备地特胰岛素或其类似物，提供了一种简捷、高效的方法。

[0022] 本发明所涉及到的术语定义

[0023] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

[0024] 地特胰岛素：是原型胰岛素去除了B链第30位苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链ε-氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，是一种胰岛素类似物。

[0025] 蛋白质的“酰化”是指在蛋白质的一个或多个游离氨基上共价引入酰基的过程。氨基的酰化是常见的蛋白质化学修饰方式之一。

[0026] 选择性酰化：是原型胰岛素去除了B链第30位苏氨酸在进行酰化反应时，在游离α氨基存在的情况下，不需要酰化前将α氨基保护，酰化后再去保护的操作。

附图说明

[0027] 图1为重组人胰岛素前体蛋白酶切后获得desB 30蛋白；

[0028] 图2为活化酯与desB30的摩尔比对酰化效果的影响；

[0029] 图3为HPLC检测本发明一步酰化制备地特胰岛素的酰化效率结果；

[0030] 图4为本发明方法所制备地特胰岛素与地特胰岛素标准品的HPLC测定结果。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0032] 实施例1重组人双链胰岛素前体(desB30)的制备

[0033] 重组人双链胰岛素前体(desB30)的制备参考有关文献(刘海峰，重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究，华东理工大学，博士学位论文.2013)。具体如下：

[0034] 1.1试验材料及仪器

[0035] 氯化钠(NaCl)、盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈(CH3CN，HPLC级)、三氟乙酸(TFA，HPLC级)购自J&K Chemical公司；分析型高效液相仪器为安捷伦1260，分析型色谱柱为Kromasil-C18-5μm- (4.6mm×250mm)；层析纯化系统为瑞典Pharmacia Biotech公司AKTA explorer 100层析工作站，所用层析柱为XK 5.0cm×20.0cm(装填体积为300ml)，所用阳离子填料为CM Sepharose FF，购自GE。

[0036] 1.2样品纯度检测方法

[0037] 采用反相层析方法对粗样和纯化收集的样品进行检测，仪器为安捷伦1260分析型高效液相，分析色谱柱：Kromasil-C18-5μm- (4.6mm×250mm)。流动相A相为0.1％TFA；流动相B相：0.1％TFA与80％乙腈混合液。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为280nm。15-50％B相梯度洗脱25min。保留时间在10-11min的主峰即为重组人胰岛素前体蛋白，保留时间在11-12min的主峰为desB 30蛋白。纯度计算采用面积归一法。

[0038] 1.3含有重组人胰岛素前体的发酵上清的制备

[0039] 人工合成ILP基因和质粒pPIC9K分别用Xho I和EcoRI进行酶切，回收相应的目的片段和质粒大片段，将两个片段用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pPIC9K::ILP，然后将构建好的重组质粒pPIC9K::ILP大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastorisGS115，涂布MGY(His-)平板，挑选高拷贝的阳性克隆，其中，构建的胰岛素前体蛋白(ILP)的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为：

[0040] eeaeaeaepk(间隔肽)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk(缺少30位苏氨酸的B链)aak(小C肽)giveqcctsicslyqlenycn(A链)。

[0041] 培养所述工程酵母菌株，分泌表达出人胰岛素前体蛋白；将发酵液通过离心获得含有目的蛋白的上清液。

[0042] 1.4重组人胰岛素前体的纯化和酶切制备desB 30蛋白

[0043] 将发酵上清用0.45μm的微孔滤膜过滤后，用去离子水稀释10倍，调pH 3.5，稀释后的上清液连续上样，上样量不超过介质最大结合量的70％，层析流速为40ml/min。

[0044] 层析所用平衡液为50mmol/L柠檬酸钠，pH 3.5；洗涤液为平衡液+0.1mol/L NaCl，pH 3.5；洗脱液为平衡液+0.5mol/L NaCl，pH 3.5；上样完毕，用平衡液平衡至基线稳定，用洗涤液洗涤杂蛋白，用洗脱液洗脱收集目的蛋白。

[0045] 将经CM Sepharose FF离子交换层析得到的CM收集液进行C18反相层析：层析柱为瑞典AkzoNobel公司的Kromasil半制备型色谱柱，规格为250mm×21.2mm，填料为C18-10μm-层析方法：A相为0.1％TFA ddH2O；B相为100％CH3CN；流速为20ml/min；20％B相平衡反相柱至基线稳定；CM收集液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上样，20％B相再平衡，线性梯度洗脱程序为0-20min，20-40％(B)，收集洗脱峰。收集液旋蒸去除有机相后，冻干得胰岛素前体蛋白粉末。

[0046] 用50mmol/L，pH 8.0的Tris缓冲液把胰岛素前体蛋白粉末配制成2.0mg/ml的溶液。按胰蛋白酶与胰岛素前体为1:200(w/w)的比例，加入胰蛋白酶，混匀。室温(25℃)酶切4h，得到目的产物desB 30(图1)。

[0047] 实施例2地特胰岛素的制备

[0048] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末分别溶于120mmol/L pH 2的磷酸氢二钠和120mmol/L pH 2的硼酸溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度均为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于纯乙腈中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0049] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液均调pH至9.5，均加入纯乙腈，使得乙腈所占体积是总反应液体积的50％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2，搅拌反应60min，反应的温度为25℃。

[0050] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测。根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出，采用磷酸氢二钠的条件下的酰化反应产率为70％，采用硼酸的条件下的酰化反应率为55％。

[0051] 可以看出，desB30溶液在不同的缓冲液下溶解，磷酸氢二钠的效果比硼酸好，因为硼酸溶液存在下会产生一个较大脱氨杂峰，影响酰化率。

[0052] 实施例3地特胰岛素类似物的制备

[0053] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0054] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.5，加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2，搅拌反应60min，反应的温度为25℃。

[0055] 各加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式(酰化反应产率＝(地特胰岛素类似物含量/desB30含量)×100％)，计算出酰化反应产率为72.3％。

[0056] 实施例4地特胰岛素的制备

[0057] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度均为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0058] 平分desB30前体溶液，用1mol/L NaOH将desB30前体溶液，分别调pH至8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11，均加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2，搅拌反应
60min，反应的温度为25℃。

[0059] 各加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出pH 8.0条件下的酰化反应率为46％，纯度为58％，副产物为单酰化及二酰化；pH 8.5条件下的酰化反应率为65％，纯度为73％，副产物为单酰化所及二酰化；pH 9.0条件下的酰化反应率为81.7％，纯度为87.2％，副产物为二酰化；pH 9.5条件下的酰化反应率为73％，纯度为79.8％，副产物为二酰化及三酰化；pH 10.0条件下的酰化反应率为71.5％，纯度为78％；pH 10.5条件下的酰化反应率为65.8％，纯度为72％；pH 11.0条件下的酰化反应率为57％，纯度65％。

[0060] 可见，酰化反应液的pH在8-11之间都可以发生酰化反应，其中pH偏8的条件下，易产生A1，B1位单酰化产物，故pH为9.0与9.5较优。

[0061] 实施例5地特胰岛素的制备

[0062] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0063] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.5，加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2，搅拌反应60min，反应的温度为25℃。

[0064] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，重复试验5次，计算出酰化反应产率分别为74.72％，73.58％，74％，74.78％，72.8％。

[0065] 实施例6地特胰岛素的制备

[0066] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0067] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:2，搅拌反应60min，反应的温度为25℃。

[0068] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，重复试验5次，计算出酰化反应产率分别为81.73％，80.6％，81.27％，82.38％，81.96％。

[0069] 对比实施例5和实施例6，根据统计学显著性差异计算，p＝0.00021<0.05，说明pH 9.0与pH 9.5的酰化反应产率具有显著性差异，故desB30前体溶液的pH优选9.0。

[0070] 实施例7地特胰岛素的制备

[0071] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0072] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，平分混合液，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比分别为4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，搅拌反应60min，反应的温度为25℃。

[0073] 各加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出，摩尔比为4:1时酰化反应产率为45％，摩尔比为3:1时酰化反应产率为58％，摩尔比为2:1时酰化反应产率为70％，摩尔比1:1时酰化反应产率为87.2％，摩尔比为1:2时酰化反应产率为76.5％，摩尔比为1:3时酰化反应产率为63.8％，摩尔比为1:4时酰化反应产率为52％。

[0074] 可以看出，加入的活化酯与desB30的摩尔比4:1-1:4之间，最优值为1:1，达到优化的条件下亦可减少成本。活化酯加入量少，会导致desB30有未酰化的，活化酯加入量过高，会导致产生大量的二酰化(图2)。

[0075] 实施例8地特胰岛素的制备

[0076] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0077] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应15min、20min、25min、45min、60min，反应的温度为25℃。

[0078] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出反应15min的酰化反应产率为74％、反应20min的酰化反应产率为79％、反应25min的酰化反应产率为86.8％、反应
45min的酰化反应产率为86％、反应60min的酰化反应产率为85.7％。

[0079] 本发明发现反应25min即可达到86.8％的酰化率(图3)，时间加长，对酰化率的影响不大。由此可见，酰化25min达到工艺最优。本发明方法所制备的地特胰岛素与地特胰岛素标准品的HPLC测定结果见图4。

[0080] 本发明实施例4、实施例7和实施例8的具体酰化产率见表1。

[0081] 表1酰化条件与酰化产率

[0082]

[0083]

[0084] 实施例9地特胰岛素的制备

[0085] 将重组人双链胰岛素前体(desB30)冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度约为6mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为10mg/ml。

[0086] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为25℃。

[0087] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.0，终止酰化反应，存放4℃冰箱内。存放0天，1天，3天，5天。采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×
100％，存放0天的酰化产率为86.3％，存放1天的酰化产率为85.8％，存放2天的酰化产率为
85.13％，存放3天的酰化产率为83.27％，存放4天的酰化产率为80％，存放5天的酰化产率降低较为明显为75％。

[0088] 结果表明，pH 7.0的终止条件下存放3天，酰化产率变化不大(少量在碱性条件下转换成脱氨胰岛素)，且酰化制备的地特胰岛素可以直接完成后期的阴离子纯化分离工作。

[0089] 实施例10地特胰岛素的制备

[0090] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于100mmol/L pH 3的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度为4mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为8mg/ml。

[0091] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是总反应液体积的40％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为15℃。

[0092] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至6.5，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出酰化反应率为78％。

[0093] 实施例11地特胰岛素的制备

[0094] 将重组人双链胰岛素前体desB30冻干粉末溶于50mmol/L pH 4的磷酸氢二钠溶液中，将溶液搅拌至冻干粉末全部溶解(肉眼观察)，使得desB30终浓度为8mg/ml。将活化酯(肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯)固体溶于纯乙醇中，超声至完全溶解，使得活化酯浓度为12mg/ml。

[0095] 用1mol/L NaOH将desB30前体溶液调pH至9.0，加入纯乙醇，使得乙醇所占体积是总反应液体积的30％，用磁力搅拌器缓慢搅拌至完全混合，缓慢加入活化酯，使活化酯与desB30的摩尔比约为1:1，搅拌反应25min，反应的温度为30℃。

[0096] 加入1mol/L HCl调节反应液的pH至7.5，终止酰化反应，采用液相检测，根据公式：酰化反应产率＝(地特胰岛素含量/desB30含量)×100％，计算出酰化反应率为78.7％。