一种海绵二萜类化合物和制备方法及其应用转让专利
申请号 : CN201510800208.6
文献号 : CN105461514B
文献日 : 2017-05-10
发明人 : 方圣涛 , 杨翠云 , 王建华 , 焉炳飞 , 刘苏静
申请人 : 中国科学院烟台海岸带研究所
摘要 :
本发明涉及海洋天然防污剂领域，具体地说是一种海绵二萜类化合物和制备方法及其在海洋防污剂中的应用。海绵二萜类化合物结构为式Ⅰ所示，制备方法为将Hymerhabdia属潮间带海绵经海水冲洗干净、去除表面附着砂砾及附着物，切成小块、冷冻干燥后粉碎，经有机溶剂浸提、溶剂分配和反复的柱层析分离，得到式Ⅰ所示化合物。本发明化合物结构新颖的小分子天然有机化合物，容易制备获得，本发明所得二萜类化合物具有显著的抗海洋生物污损活性，可用作制备高效的海洋防污剂。
权利要求 :
1.一种海绵二萜类化合物，其特征在于：海绵二萜类化合物结构为式Ⅰ所示，
2.一种按权利要求1所述的海绵二萜类化合物的制备方法，其特征在于：
1)将清洗粉碎后海绵Hymerhabdia sp.用有机溶剂反复冷浸提取，合并提取液，减压浓缩至无溶剂蒸出，得到粗提物浸膏；
2)取步骤1)中所得的粗提物浸膏用其8–10倍体积的蒸馏水溶解稀释，然后加入溶解粗提物浸膏蒸馏水体积1–1.5倍的乙酸乙酯反复萃取，合并萃取液浓缩得到提取物浸膏，备用；
3)取步骤2)中得到的提取物浸膏进行硅胶柱层析分离，以石油醚–丙酮或石油醚–乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，收集各组分洗脱液，经薄层层析检测；
4)收集上述体积比20:1–10:1洗脱剂洗脱下的洗脱液组分依次进行凝胶柱、反相硅胶柱和正相硅胶柱层析分离纯化，并用薄层层析检测Rf为0.4—0.5即为式Ⅰ所示化合物。
3.按权利要求2所述的海绵二萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)将海绵Hymerhabdia sp.用海水冲洗、除去杂物、切碎、冷冻干燥后粉碎，然后用有机溶剂常温浸提取3–4次，每次24小时，合并每次的提取液，待用。
4.按权利要求2或3所述的海绵二萜类化合物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂可为丙酮、乙醇、甲醇或体积比为1:1的二氯甲烷–甲醇。
5.按权利要求2所述的海绵二萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤4)中凝胶柱层析洗脱液为氯仿–甲醇或二氯甲烷–甲醇；反相硅胶柱层析洗脱液为甲醇–水或乙醇–水；正相硅胶柱层析洗脱液为石油醚–丙酮或石油醚–乙酸乙酯。
6.按权利要求2所述的海绵二萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述薄层层析检测展开剂为体积比10:1-2:1的石油醚–丙酮。
7.一种权利要求1所述的海绵二萜类化合物的应用，其特征在于：所述式Ⅰ所示海绵二萜类化合物作为海洋防污剂的应用。
8.按权利要求7所述的海绵二萜类化合物的应用，其特征在于：所述式Ⅰ所示海绵二萜类化合物作为抑制藤壶幼虫的海洋防污剂的应用。
说明书 :
一种海绵二萜类化合物和制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及海洋天然防污剂领域，具体地说是一种海绵二萜类化合物和制备方法及其在海洋防污剂中的应用。
背景技术
[0002] 海洋生物污损一直以来是人类从事海洋活动所面临的一个重大问题。海洋环境中，一些污损生物附着在船舶和海洋人工设施上，不但加速金属的腐蚀，增加船舶燃油消耗，影响水产养殖的产量和质量，而且还会带来外来物种，对海洋生态系统的平衡和生物多样性造成威胁。在船舶和海洋人工设施上涂装含有防污剂的海洋防污涂料是解决海洋污损问题的有效方法。一直以来被广泛使用的有机锡类防污剂，由于较强的毒性和非特异性，而且在海洋环境中不能很快降解，对海洋生态环境造成了严重威胁，于2008年已被国际海事组织禁用。目前，有机锡类防污剂已被含铜化合物结合的有机杀虫剂的新型防污剂所代替。但近年来，像Irgarol 1051和Diuron等有机杀虫剂对海洋环境的危害也越来越引起各国科学家的重视。因此，研制和开发环境友好无毒防污剂已成为国内外海洋生物污损防治研究的热点。
[0003] 一直以来，从海洋生物中寻找具有抗污损活性天然产物，并以此为先导化合物通过化学和仿生学手段开发绿色环保防污剂，是海洋生物污损防治的主要研究方向。Sea-Nine 211的开发就是一个很好的例子。Sea-Nine 211属于环境友好型防污剂，是上世纪90年代美国Rohm&Haas公司成功开发并投放市场的无毒防污剂，其噻唑啉酮结构就是通过仿生学手段对一种海洋天然防污剂的结构改造而成。因此，从海洋生物中寻找抗污损先导化合物是开发海洋防污剂的一种有效途径。
[0004] 海绵是海洋中最原始的多细胞海洋生物，分布广泛，种类繁多。其生物种类多样性，代谢途径的多样性，生存环境的复杂性以及共生体的不确定性，决定了其次生代谢产物和生理活性的多样性。海绵作为海洋中一类常见的固着海洋生物，在进化过程中会产生各种各样的次生代谢产物作为化学防御物质来抵御生存环境中所受到的威胁，如捕食者的捕食、病原菌的侵袭以及海洋污损生物的附着。由此可见，海绵是海洋抗污损活性物质的主要来源，研究表明，从海洋生物中获得的抗污损活性化合物中有一半以上是从海绵中获得。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种海绵二萜类化合物和制备方法及其在海洋防污剂中的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 一种海绵二萜类化合物，海绵二萜类化合物结构为式Ⅰ所示，
[0008]
[0009] 一种海绵二萜类化合物的制备方法：
[0010] 1)将清洗粉碎后海绵(Hymerhabdia sp.)用有机溶剂反复冷浸提取，合并提取液，减压浓缩至无溶剂蒸出，得到粗提物浸膏；
[0011] 2)取步骤1)中所得的粗提物浸膏用其8–10倍体积的蒸馏水溶解稀释，然后加入溶解粗提物浸膏蒸馏水体积1–1.5倍的乙酸乙酯反复萃取，合并萃取液浓缩得到提取物浸膏，备用；
[0012] 3)取步骤2)中得到的提取物浸膏进行硅胶柱层析分离，以石油醚–丙酮或石油醚–乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，收集各组分洗脱液，经薄层层析检测；
[0013] 4)收集上述体积比20:1–10:1洗脱剂洗脱下的洗脱液组分依次进行凝胶柱、反相硅胶柱和正相硅胶柱层析分离纯化，并用薄层层析检测Rf为0.4—0.5即为式Ⅰ所示化合物。
[0014] 所述步骤1)将海绵(Hymerhabdia sp.)用海水冲洗、除去杂物、切碎、冷冻干燥后粉碎至40-100目，然后用有机溶剂常温浸提取3–4次，每次24小时，合并每次的提取液，待用。
[0015] 所述有机溶剂可为丙酮、乙醇、甲醇或体积比为1:1的二氯甲烷–甲醇。
[0016] 所述步骤4)中凝胶柱层析洗脱液可为体积比1:1的氯仿–甲醇或二氯甲烷–甲醇；反相硅胶柱层析洗脱液可为体积比80:20-95:5的甲醇–水或乙醇–水；正相硅胶柱层析洗脱液可为体积比为8:1-3:1的石油醚–丙酮或体积比为15:1-5:1的石油醚–乙酸乙酯。
[0017] 步骤4)中所述薄层层析检测展开剂为体积比10:1-2:1的石油醚–丙酮。
[0018] 一种海绵二萜类化合物的应用，所述式Ⅰ所示海绵二萜类化合物作为海洋防污剂的应用。
[0019] 所述式Ⅰ所示海绵二萜类化合物作为抑制藤壶幼虫的海洋防污剂的应用。
[0020] 本发明具有以下优点：
[0021] 1.本发明通过对海绵样品的提取、分离纯化获得的二萜类天然产物，属于新的小分子天然有机化合物，结构新颖，容易制备获得。
[0022] 2.本发明涉及的海绵为Hymerhabdia属是环渤海地区一种常见的温带潮间带海绵，广泛分布于中国山东、辽宁等沿海地区，生物样品容易采集。
[0023] 3.本发明的海绵二萜类化合物经海洋生物污损活性测试得出该化合物具有显著的对藤壶幼虫致死的活性，其LC50值为3.63±0.30微克/毫升。
附图说明
[0024] 图1为本发明实施例提供的海绵二萜类化合物结构图。
具体实施方式
[0025] 以下实施实例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。
[0026] 实施例1：
[0027] 海绵二萜类化合物结构式为式Ⅰ，所示：
[0028]
[0029] 式Ⅰ所示化合物的制备：
[0030] 材料来源：样品采集自山东烟台沿海温带潮间带，属于寻常海绵纲(Demospongiae)软海绵目(Halichondrida)小轴海绵科(Axinellidae)Hymerhabdia属的海绵。
[0031] 提取和分离：
[0032] 将采集到的海绵样品用海水冲洗、除去杂物、切碎、冷冻干燥后备用。取1kg干燥后的样品，用甲醇常温提取4次，每次24小时，合并提取液，在温度40℃左右减压浓缩，回收甲醇，得到粗提物浸膏100g。将所得的粗提物浸膏加入2L蒸馏水使其混悬于水中，然后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液浓缩得到萃取物浸膏。将乙酸乙酯萃取物浸膏(20g)进行正相硅胶柱(200—300目)层析分离，以石油醚—丙酮为洗脱剂按体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1比例进行梯度洗脱，收集各组分洗脱液，根据薄层层析(TLC)检测，10％硫酸—乙醇显色剂的显色特征及Rf值，合并相同或类似部分，得到6个组分(A—F)。将组分C(500mg，石油醚—丙酮5:1的洗脱部分)依次经Sephadex LH-20凝胶柱、反相硅胶柱和正相硅胶柱层析分离纯化，Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液用体积比1:
1的二氯甲烷-甲醇，反相柱层析用体积比为90:10的甲醇-水进行洗脱，硅胶柱层析用体积比为8:1的石油醚-丙酮系统进行洗脱。并用TLC检测，展开剂为体积比5:1的石油醚—丙酮系统，纯化收集Rf值为0.4—0.6部分，即得到式Ⅰ所示化合物(30mg)。经TLC检测，呈单个、均匀的黄绿色斑点，确定为纯化合物。经核磁共振谱分析，其结构鉴定为一种结构新颖的二萜类化合物，结构式Ⅰ所示，命名为Hymerhabdrin A(表1)。
1的二氯甲烷-甲醇，反相柱层析用体积比为90:10的甲醇-水进行洗脱，硅胶柱层析用体积比为8:1的石油醚-丙酮系统进行洗脱。并用TLC检测，展开剂为体积比5:1的石油醚—丙酮系统，纯化收集Rf值为0.4—0.6部分，即得到式Ⅰ所示化合物(30mg)。经TLC检测，呈单个、均匀的黄绿色斑点，确定为纯化合物。经核磁共振谱分析，其结构鉴定为一种结构新颖的二萜类化合物，结构式Ⅰ所示，命名为Hymerhabdrin A(表1)。
[0033]
[0034] 式Ⅰ化合物(Hymerhabdrin A)的理化性质及波谱特征：无色晶体(甲醇)，易溶于二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯，可溶于甲醇，难溶于水。高分辨质谱(HRESIMS)m/z：329.2449[M+Na]+，计算值为C20H34O2Na，329.2457。核磁共振氢谱(1H-NMR,CDCl3,500MHz)δ2.01(1H，dd，J＝14.5，2.5Hz，H-1a)，1.21(1H，m，H-1b)，4.13(1H，m，H-2)，3.23(1H，d,J＝4.0Hz,H-3)，0.91(1H，dd，J＝11.7，3.0Hz，H-5)，1.62(2H，m，H-6)，1.89(1H，dt，J＝12.5，3.3Hz，H-7a)，
1.24(1H，m，H-7b)，1.18(1H，m，H-9)，1.50(2H，m，H-11)，1.79(1H，m，H-12a)1.68(1H，m，H-
12b)，1.97(1H，brd，J＝9.6Hz，H-13)，4.90(1H，s，H-15a),4.69(1H,s,H-15b),1.74(3H，s，H-16)，0.70(3H，s，H-17)，1.04(3H，s，H-18)，1.03(3H，s，H-19)，1.20(3H，s，H-20)。核磁共振碳谱(13C-NMR，CDCl3，125MHz)δ43.9(t，C-1)，71.1(d，C-2)，78.8(d，C-3)，38.1(s，C-4)，
56.3(d，C-5)，19.0(t，C-6)，41.0(t，C-7)，43.5(s，C-8)，63.5(d，C-9)，36.5(s，C-10)，19.6(t，C-11)，24.9(t，C-12)，58.4(d，C-13)，145.6(s，C-14)，111.2(t，C-15)，24.8(q，C-16)，
14.9(q，C-17)，16.9(q，C-18)，29.7(q，C-19)，16.2(q，C-20)。
1.24(1H，m，H-7b)，1.18(1H，m，H-9)，1.50(2H，m，H-11)，1.79(1H，m，H-12a)1.68(1H，m，H-
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56.3(d，C-5)，19.0(t，C-6)，41.0(t，C-7)，43.5(s，C-8)，63.5(d，C-9)，36.5(s，C-10)，19.6(t，C-11)，24.9(t，C-12)，58.4(d，C-13)，145.6(s，C-14)，111.2(t，C-15)，24.8(q，C-16)，
14.9(q，C-17)，16.9(q，C-18)，29.7(q，C-19)，16.2(q，C-20)。
[0035] 表1式Ⅰ化合物的1H-1H COSY、HMBC和NOESY谱主要相关数据
[0036]
[0037] 式Ⅰ化合物(Hymerhabdrin A)的结构推导：化合物的高分辨质谱显示其分子式为C20H34O2，不饱和度为4。化合物的13C-NMR谱有20个碳信号(4个C，5个CH，6个CH2及5个CH3)，以及该分子的不饱和度可知该化合物为一个三环结构的二萜类化合物。1H-NMR谱δH 4.90(1H，s)和4.69(1H，s)以及13C-NMR谱δC 145.6(C)和111.2(CH2)显示分子中有一个末端双键的结构片段。δC 78.8(CH)和71.1(CH)为两个连有羟基的次甲基碳信号。结合对其二维核磁共振(1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY)谱(表1)的分析，对1H-和13C-NMR谱中的氢信号和碳信号以及取代基的位置进行了确定，从而得到式Ⅰ化合物的具体结构，为一个结构新颖的6/6/5稠环结构的二萜类化合物，如图1所示。
[0038] 同时根据式Ⅰ所示结构式，本领域技术人员也可通过合成方式获得。
[0039] 实施例2：
[0040] 与实施例1不同之处在于
[0041] 将采集到的海绵样品用海水冲洗、除去杂物、切碎、冷冻干燥后备用。取1kg干燥后的样品，用二氯甲烷：甲醇1:1的常温提取4次，每次24小时，合并提取液，在温度40℃左右减压浓缩，回收溶剂，得到粗提物浸膏。将所得的粗提物浸膏加入2L蒸馏水使其混悬于水中，然后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液浓缩得到萃取物浸膏。将乙酸乙酯萃取物浸膏进行正相硅胶柱(200—300目)层析分离，以石油醚—乙酸乙酯为洗脱剂按体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1比例进行梯度洗脱，收集各组分洗脱液，根据薄层层析(TLC)检测，10％硫酸—乙醇显色剂的显色特征及Rf值，合并相同或类似部分，得到6个组分(A—F)。将组分C(石油醚—乙酸乙酯5:1洗脱部分)依次经Sephadex LH-20凝胶柱、反相硅胶柱和正相硅胶柱层析分离纯化，Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液用体积比1:1的氯仿-甲醇，反相柱层析用体积比为85:15的乙醇-水进行洗脱，硅胶柱层析用体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯系统进行洗脱，并用TLC检测，展开剂为体积比4:1的石油醚—乙酸乙酯，纯化收集Rf值为0.3—0.5部分，即得到式Ⅰ所示化合物。经TLC检测，呈单个、均匀的黄绿色斑点，确定为纯化合物。经核磁共振谱分析，其结构鉴定为一种结构新颖的二萜类化合物，结构式Ⅰ所示，命名为Hymerhabdrin A(表1)。
[0042] 实施例3：式Ⅰ化合物的抗污损活性实验
[0043] 活性筛选模型：本发明采用的抗污损活性实验模型是目前应用最广泛的针对藤壶Ⅱ期幼虫的致死活性。
[0044] 藤壶幼体的培养：取藤壶成体置于2000毫升烧杯中，加入新鲜海水1500毫升，用一小充气泵缓缓充气，强光照射，室温25℃以上，1—2小时可释放Ⅱ期幼虫。
[0045] 藤壶幼虫致死方法：取24孔细胞培养板，每孔加入950微升含20——25个藤壶Ⅱ期幼虫的新鲜过滤海水，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设四个平行孔，空白对照组每孔加50微升二甲基亚砜(DMSO)溶剂，样品组每孔加入50微升用DMSO溶解的式(Ⅰ)所示的化合物样品，使各组样品终浓度分别为5、10、20、40、80、100微克/毫升。20℃培养箱中无光照培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数藤壶幼虫死亡个体数目。
[0046] 藤壶幼虫致死活性以校正死亡率表示，计算公式如下：
[0047] 校正死亡率＝(对照组存活率—处理组存活率)/对照组存活率×100％。
[0048] 实验结果：式(Ⅰ)所示二萜类化合物在24小时时对藤壶幼虫具有显著的致死活性，其LC50值为3.63±0.30微克/毫升。