一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于石蜡衬底膜的快速细胞捕获与释放芯片的制备方法，包括芯片制备中基底的选择、刻蚀图样的包埋、湿法刻蚀、基底的键合，在经过湿法刻蚀的基础上，通过将石蜡融于经过湿法刻蚀的基底上，同时将干净的基底片子在其朝上的一面均匀涂抹食用芝麻油置于热台上加热，通过将涂有食用芝麻油的基底片子的食用芝麻油面对齐的盖在融有石蜡的基底的片子上来完成石蜡膜的制备，得到石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片。解决了以往微流控芯片只能对细胞进行捕获而不能对细胞进行释放的问题，所需材料少、工艺方法简单，制备出来的芯片在医学分析领域具有很高的应用价值和经济价值。

权利要求

1.一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法，其步骤如下：

（1）基底的选择及清洗：选取玻璃、石英或硅作为基底，将选择好的两片基底进行清洗，去除基底表面的油污等杂质；

（2）刻蚀掩膜处理：对清洗好的基底在50℃ 100℃的烘箱中进行烘干处理，烘干处理之~后在两片基底的上下表面粘附耐化学腐蚀性的掩膜，通过激光切割，把即将要刻蚀的区域部分切出来，除去切割出来的防腐蚀掩膜，得到要刻蚀的区域；

（3）湿法刻蚀：将处理好的基底中的上片，通过夹具按照0.01mm/min-1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀，上片刻蚀出的凹槽底面为斜坡面，处理好的基底下片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀，下片刻蚀出的凹槽底面水平；

（4）打孔：去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔；

（5）石蜡膜的制备：切取少量石蜡置于下片的凹槽中，将下片置于热台上加热至55℃，此时石蜡完全融化，将油脂均匀的涂抹在一片干净的未经过刻蚀的基片上并进行加热，将涂有油脂的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的芯片缓慢降温直至下片上的石蜡完全凝固，然后将组合在一起的芯片拆开，去除掉下片凹槽外围多余的石蜡，这样便完成了下片石蜡膜的制备；

（6）上片与下片的组合：选取PDMS薄片对下片和上片进行键合，便得到了基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片；

所述的石蜡膜的厚度为0.1-1.5mm。

2.采用权利要求1所述的芯片捕获与释放细胞的方法，其步骤如下：

（1）将制备的带有石蜡衬底膜的芯片置于夹具中，通过注射泵以0.01μl/min-1μl/min的速率将培养好的细胞从入口孔注入到键合完全的芯片中，持续通入一定的时间后，细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出；

（2）对芯片中的石蜡膜用激光进行照射或者直接置于热台上加热，这时候部分石蜡开始融化，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，融化了的石蜡膜上面的细胞便被冲了出来，实现了对细胞的释放。

说明书

一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微流控芯片的制备方法，具体的说是一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法。

背景技术

[0002] 近年来，微流控芯片已经成为细胞分离研究的热点，微流控芯片的快速发展及推广应用，给分析领域提供了很大的便利。人体血液中CTCs(Circulating Tumor Cells血循环肿瘤细胞)的含量非常低，这对现有的分离分析方法来说是一个巨大的挑战。目前还没有其它好的方法能够把血液中原本数量就极少的CTCs很好的分离出来，即便能够分离出来也不能够进行高灵敏的检测计数及进行后续一系列的生化分析。这时候CTCs捕获芯片的出现能够极大的解决这个问题，细胞捕获芯片的出现对于CTCs的快速发现及早期诊断与治疗具有极大的意义。

[0003] 但是，目前报道的关于CTCs芯片的最新研究成果，其对CTCs的捕获效率虽然较高，但是捕获到的CTCs难以进行释放，不方便后续的再培养等生化分析。如专利申请公布号为CN 103235124 A和专利申请公布号为CN 104324768A所述他们虽然都能进行细胞的捕获且捕获效率较高，但是其捕获到的细胞不能够进行有效的释放，不方便后续的扩大培养及再分析。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法,低成本，加工简单。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种采用石蜡衬底膜芯片捕获与释放细胞的方法，捕获与释放效率高。

[0006] 为了实现上述目的，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 一种基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片的制备方法，具体步骤如下：

[0008] (1)基底的选择及清洗：选取玻璃、石英或硅作为基底，将选择好的两片基底进行清洗，去除基底表面的油污等杂质；

[0009] (2)刻蚀掩膜处理：对清洗好的基底在50℃～100℃的烘箱中进行烘干处理，烘干处理之后在两片基底的上下表面粘附耐化学腐蚀性的掩膜，通过激光切割，把即将要刻蚀的区域部分切出来，除去切割出来的防腐蚀掩膜，得到要刻蚀的区域；

[0010] 掩膜处理的目的在于裸露出需要进行刻蚀的基片的一部分，把不需要进行刻蚀的基片的其他部分保护起来。

[0011] (3)湿法刻蚀：将处理好的基底中的上片，通过夹具按照0.01mm/min-1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀，上片刻蚀出的凹槽底面为斜坡面，处理好的基底下片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀，下片刻蚀出的凹槽底面水平；

[0012] (4)打孔：去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔。

[0013] (5)石蜡膜的制备：切取少量石蜡置于下片的凹槽中，将下片置于热台上加热至55℃，此时石蜡完全融化，将油脂均匀的涂抹在一片干净的未经过刻蚀的基片上并进行加热，将涂有油脂的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的芯片缓慢降温直至下片上的石蜡完全凝固，然后将组合在一起的芯片拆开，去除掉下片凹槽外围多余的石蜡，这样便完成了下片石蜡膜的制备。

[0014] 所述的石蜡膜的厚度为0.1-1.5mm，即下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为0.1-1.5mm。

[0015] (6)上片与下片的组合：选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄片对下片和上片进行键合，便得到了基于石蜡衬底膜的细胞捕获与释放芯片。

[0016] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞捕获与释放方法，其步骤如下：

[0017] (1)将制备的带有石蜡衬底膜的芯片置于夹具中，通过注射泵以0.01μl/min-1μl/min的速率将培养好的细胞从入口孔注入到键合完全的芯片中，持续通入一定的时间后，细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出。

[0018] (2)对芯片的石蜡膜用激光进行照射或者置于热台上加热，这时候部分石蜡开始融化，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)，融化了的石蜡膜上面的细胞便被冲了出来，实现了对细胞的释放。

[0019] 有益效果：本发明改变了以往制作出的微流芯片不能够对捕获到的细胞进行释放的问题。本发明的制备方法，加工工艺简单，制备出来的芯片能够对捕获到的细胞进行释放，具有广阔的市场前景和市场价值，能够广泛的用于分析领域。

附图说明

[0020] 图1为芯片的示意图。其中1(a)为上片示意图，梯形四周区域为覆膜区域，1(b)为下片示意图，小梯形四周为覆膜区域。

[0021] 图2为不同注射速率下的细胞捕获效率。

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明在细胞捕获及释放中做出进一步的说明。刻蚀液为典型的缓冲氧化硅蚀刻液，其中含氟化铵，(BOE:Buffer Oxide Etcher)与去离子水按1：10的质量比例勾兑而成。

[0023] 实施例1

[0024] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞的捕获与释放方法，具体步骤如下：

[0025] 1.基底选择为玻璃，其中玻璃基底的长度为75mm、宽度为25mm、厚度为2mm,将选择好的两片基底在流动的去离子水下进行清洗，去除基底表面的油污等杂质，对清洗好的基底在50-100℃烘箱里进行烘干处理。

[0026] 2、在基底的上下表面黏贴耐化学腐蚀性的保护胶纸，在上片的保护胶纸上用激光雕刻机切出如图1中1(a)所述的梯形区域，梯形的上底为9mm，下底为18mm，整个梯形区域的高度为60mm，在下片上用激光雕刻机切出如图1中1(b)所述的小梯形区域梯形的上底为14mm，下底为18mm，整个梯形区域的高度为20mm，撕下上片和下片切割区域的保护胶纸，得到要刻蚀的区域。

[0027] 3、将处理好的基片中的上片，通过夹具按照1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀75min，下片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀，30min下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为1.5mm。

[0028] 4、去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔，加工出孔的直径为0.5-1mm。

[0029] 5、切取少量石蜡置于下片的凹槽中，置于55℃热台上加热，直至石蜡完全融化在下片的凹槽中；与此同时将食用芝麻油均匀的涂抹在干净的未经过刻蚀的一片基片上并置于热台上进行加热。

[0030] 6、将涂有食用芝麻油的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上面，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的基片缓慢降温直至融有石蜡的下片上的石蜡完全凝固，然后迅速将组合在一起的基片拆开，去除掉带有下片的凹槽外围多余的石蜡，同时将涂有食用芝麻油的基片进行清洗干净，这样便完成了带有石蜡膜的基片的制备。

[0031] 7、选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)对经过上述处理的上片和下片进行键合，便得到了本发明需要制备的基于石蜡衬底膜的快速细胞的捕获与释放芯片。

[0032] 8、将制备好的芯片置于夹具中，将培养好的乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞通过注射泵以1μl/minn的速率从入口孔注射1小时到键合完全的芯片中，乳腺癌细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出，完成对细胞的捕获。

[0033] 9、对芯片的石蜡膜部分用激光进行照射，这时候部分石蜡开始融化，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，被激光照射部分的石蜡膜上面的细胞便被冲了出来，实现了对细胞的释放。

[0034] 实施例2

[0035] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞的捕获与释放方法，具体步骤如下：

[0036] 1.基底选择为玻璃，其中玻璃基底的长度为75mm、宽度为25mm、厚度为2mm，将选择好的两片基底在流动的去离子水下进行清洗，去除基底表面的油污等杂质，对清洗好的基底在50-100℃烘箱里进行烘干处理。

[0037] 2、在基底的上下表面黏贴耐化学腐蚀性的保护胶纸，在上片的保护胶纸上用激光雕刻机切出如图1中1(a)所述的梯形区域梯形的上底为9mm，下底为18mm，整个梯形区域的高度为45mm，在下片上用激光雕刻机切出如图1中1(b)所述的小梯形区域梯形的上底为9mm，下底为18mm，整个梯形区域的高度为18mm，撕下上片和下片切割区域的保护胶纸，得到要刻蚀的区域。

[0038] 3、将处理好的基片中的上片，通过夹具按照0.5mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀70min，下片处理好的基片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀，刻蚀25min下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为1.25mm。

[0039] 4、去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔，加工出孔的直径为0.5-1mm。

[0040] 5、切取少量石蜡置于下片的凹槽中，置于55℃热台上加热，直至石蜡完全融化在下片的凹槽中；与此同时将食用芝麻油均匀的涂抹在干净的未经过刻蚀的一片基片上并置于热台上进行加热。

[0041] 6、将涂有食用芝麻油的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上面，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的基片缓慢降温直至融有石蜡的下片上的石蜡完全凝固，然后迅速将组合在一起的基片拆开，去除掉带有下片的凹槽外围多余的石蜡，同时将涂有食用芝麻油的基片进行清洗干净，这样便完成了带有石蜡膜的基片的制备。

[0042] 7、选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)对经过上述处理的上片和下片进行键合，便得到了本发明需要制备的基于石蜡衬底膜的快速细胞的捕获与释放芯片。

[0043] 8、将制备好的芯片置于夹具中，将培养好的乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞通过注射泵以0.75μl/min的速率从入口孔注射1小时到键合完全的芯片中，前列腺癌变细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出，完成对细胞的捕获

[0044] 9、将芯片整个置于热台上，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，将捕获到的细胞进行全部释放，这样便实现了对捕获到的细胞进行全部释放的目的。

[0045] 实施例3

[0046] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞的捕获与释放方法，具体步骤如下：

[0047] 1.基底选择为石英，其中石英基底的长度为75mm、宽度为25mm、厚度为2mm，将选择好的两片基底在流动的去离子水下进行清洗，去除基底表面的油污等杂质，对清洗好的基底在50-100℃烘箱里进行烘干处理。

[0048] 2、在基底的上下表面黏贴耐化学腐蚀性的保护胶纸，在上片和下片的保护胶纸上用激光雕刻机切出长为40mm、宽度为10mm的长方形，撕下上片和下片切割区域的保护胶纸，得到要刻蚀的区域。

[0049] 3、将处理好的基片中的上片，通过夹具按照0.8mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀65min，下片处理好的基片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀20min，下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为1mm。

[0050] 4、去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔，加工出孔的直径为0.5-1mm。

[0051] 5、切取少量石蜡置于下片的凹槽中，置于55℃热台上加热，直至石蜡完全融化在下片的凹槽中；与此同时将食用芝麻油均匀的涂抹在干净的未经过刻蚀的一片基片上并置于热台上进行加热。

[0052] 6、将涂有食用芝麻油的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上面，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的基片缓慢降温直至融有石蜡的下片上的石蜡完全凝固，然后迅速将组合在一起的基片拆开，去除掉带有下片的凹槽外围多余的石蜡，同时将涂有食用芝麻油的基片进行清洗干净，这样便完成了带有石蜡膜的基片的制备。

[0053] 7、选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)对经过上述处理的上片和下片进行键合，便得到了本发明需要制备的基于石蜡衬底膜的快速细胞的捕获与释放芯片。

[0054] 8、将制备好的芯片置于夹具中，将培养好的乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞通过注射泵以0.5μl/min的速率从入口孔注射1小时到键合完全的芯片中，乳腺癌乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出，完成对细胞的捕获[0055] 9、将芯片整个置于热台上，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，将捕获到的细胞进行全部释放，这样便实现了对捕获到的细胞进行全部释放的目的。

[0056] 实施例4

[0057] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞的捕获与释放方法，具体步骤如下：

[0058] 1.基底选择为石英，其中石英基底的长度为75mm、宽度为25mm、厚度为2mm，将选择好的两片基底在流动的去离子水下进行清洗，去除基底表面的油污等杂质，对清洗好的基底在50-100℃烘箱里进行烘干处理。

[0059] 2、在基底的上下表面黏贴耐化学腐蚀性的保护胶纸，在上片和下片的保护胶纸上用激光雕刻机切出长为30mm、宽度为15mm长方形的刻蚀区域，撕下上片和下片切割区域的保护胶纸，得到要刻蚀的区域。

[0060] 3、将处理好的基片中的上片，通过夹具按照0.1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀60min，下片处理好的基片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀18min，下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为0.9mm。

[0061] 4、去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔，加工出孔的直径为0.5-1mm。

[0062] 5、切取少量石蜡置于下片的凹槽中，置于55℃热台上加热，直至石蜡完全融化在下片的凹槽中；与此同时将食用芝麻油均匀的涂抹在干净的未经过刻蚀的一片基片上并置于热台上进行加热。

[0063] 6、将涂有食用芝麻油的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上面，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的基片缓慢降温直至融有石蜡的下片上的石蜡完全凝固，然后迅速将组合在一起的基片拆开，去除掉带有下片的凹槽外围多余的石蜡，同时将涂有食用芝麻油的基片进行清洗干净，这样便完成了带有石蜡膜的基片的制备。

[0064] 7、选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)对经过上述处理的上片和下片进行键合，便得到了本发明需要制备的基于石蜡衬底膜的快速细胞的捕获与释放芯片。

[0065] 8、将制备好的芯片置于夹具中，将培养好的乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞通过注射泵以0.25μl/min的速率从入口孔注射1小时到键合完全的芯片中，乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出，完成对细胞的捕获[0066] 9、将芯片整个置于热台上，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，将捕获到的细胞进行全部释放，这样便实现了对捕获到的细胞进行全部释放的目的。

[0067] 实施例5

[0068] 一种采用基于石蜡衬底膜的芯片进行细胞的捕获与释放方法，具体步骤如下：

[0069] 1.基底选择为硅片，其中硅片基底的长度为75mm、宽度为25mm、厚度为2mm，将选择好的两片基底在流动的去离子水下进行清洗，去除基底表面的油污等杂质，对清洗好的基底在50-100℃烘箱里进行烘干处理。

[0070] 2、在基底的上下表面黏贴耐化学腐蚀性的保护胶纸，在上片和下片的保护胶纸上用激光雕刻机切出长为30mm、宽度为15mm长方形的刻蚀区域，撕下上片和下片切割区域的保护胶纸，得到要刻蚀的区域。

[0071] 3、将处理好的基片中的上片，通过夹具按照0.1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀60min，下片处理好的基片直接浸泡在刻蚀液中进行刻蚀10min，下片刻蚀后其刻蚀区域的高度为0.5mm。

[0072] 4、去除掉上片和下片表面的刻蚀掩膜，使整个基底完整的裸露出来，对基底进行清洗处理之后，对上片进行打孔，在上片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔，加工出孔的直径为0.5-1mm。

[0073] 5、切取少量石蜡置于下片的凹槽中，置于55℃热台上加热，直至石蜡完全融化在下片的凹槽中；与此同时将食用芝麻油均匀的涂抹在干净的未经过刻蚀的一片基片上并置于热台上进行加热。

[0074] 6、将涂有食用芝麻油的基片缓慢的盖在融化有石蜡的下片上面，缓慢的从热台上移出，让组合在一起的基片缓慢降温直至融有石蜡的下片上的石蜡完全凝固，然后迅速将组合在一起的基片拆开，去除掉带有下片的凹槽外围多余的石蜡，同时将涂有食用芝麻油的基片进行清洗干净，这样便完成了带有石蜡膜的基片的制备。

[0075] 7、选取PDMS(聚二甲基硅氧烷)对经过上述处理的上片和下片进行键合，便得到了本发明需要制备的基于石蜡衬底膜的快速细胞的捕获与释放芯片。

[0076] 8、将制备好的芯片置于夹具中，将培养好的细胞乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞通过注射泵以0.01μl/min的速率从入口孔注射1小时到键合完全的芯片中，乳腺癌细胞和前列腺癌变细胞卡在刻蚀空间内，生物组织缓冲溶液从出口孔中流出，完成对细胞的捕获。

[0077] 9、将芯片整个置于热台上，与此同时注射泵开始工作向芯片里注射PBS缓冲液，将捕获到的细胞进行全部释放，这样便实现了对捕获到的细胞进行全部释放的目的。

[0078] 如图2所示，在一定的注入时间内，注射速度越低其捕获效率越高，捕获效率最高达到95％。通过将上述方法捕捉到的细胞通过显微镜进行观察，发现捕获到的细胞结构完整，无破损现象。本发明采用的细胞捕获效率是通过最后停留在芯片中的细胞数量与实验开始时注入相同大小的细胞数量的比值来计算细胞的捕获效率的。

[0079] 本发明改变了以往制作出的微流芯片不能够对捕获到的细胞进行释放的问题。本发明的制备方法，加工工艺简单，制备出来的芯片能够对捕获到的细胞进行释放，具有广阔的市场前景和市场价值，能够广泛的用于分析领域。