一种特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA及其应用

摘要

本发明提供了一种特异性抑制TWIST1基因的小干扰RNA及其应用。本发明小干扰RNA的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。该小干扰RNA干扰的TWIST1靶序列如SEQ ID NO.3所示，其通过作用于TWIST1靶序列实现抑制TWIST1基因表达，可用于制备调节细胞或生物体中TWIST1基因表达的药物，也可用于制备治疗肿瘤、尤其是黑色素瘤的药物，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种小干扰RNA，其特征在于，其正义链和反义链序列分别为：正义链：5’-CAUUCUGAUAGAAGUCUGAdTdT -3’，反义链：5’-UCAGACUUCUAUCAGAAUGdTdT-3’；

所述小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为：5’- CATTCTGATAGAAGTCTGA -3’。

2.一种编码如权利要求1所述的小干扰RNA的DNA片段。

3.一种表达载体，其包括权利要求2所述的DNA片段。

4.一种含有权利要求1所述小干扰RNA的药物。

5.如权利要求4所述的药物，其为抗肿瘤药物。

6.权利要求1所述的小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的TWIST1基因表达药物中的用途。

7.权利要求1所述的小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的药物中的用途。

8.权利要求1所述的小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病为黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌或胰腺癌。

说明书

一种特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA及其应用。

背景技术

[0002] RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，RNA分子通过破坏特定的mRNA，以抑制某种基因表达的生物学过程。该技术具有以下几点优势：1高效性；2特异性；3位置效应；4高稳定性；5可传播性；6浓度时间依赖性。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

[0003] 恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)：是源自于黑色素细胞的一种恶性肿瘤，好发于皮肤，恶性程度高，治疗难度大。虽然黑素瘤仅占全部皮肤肿瘤的4％,但却占皮肤肿瘤死亡人数的80％,是皮肤肿瘤中死亡率最高的一种恶性肿瘤。美国国家癌症研究所(NCI)的数据显示，在2003-2007年间，患病人数为每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估计有68130个患者被诊断患有黑色素瘤，其中8700个患者将因此丧生(http://
www.cancer.gov/)。恶性黑色素瘤的发生率在全世界范围内正在不断地上升，包括以前发病率低的地区，它已成为一种严重威胁人们健康的恶性疾病。在中国黑色素瘤患者有逐年增高的趋势。北京市八城区统计资料显示，2000年MM发病率为0.2例/10万，到了2004年已达
1例/10万。根据中国临床肿瘤协会(CSCO)黑色素瘤专家委员会发表的《中国黑色素瘤诊治指南(2011版)》，我国每年新发病例约2万例，已经成为了严重危及我国人民健康的疾病之一。

[0004] Twist1是属于b螺旋-环-螺旋家族的转录因子，位于7q21.2，包含2个外显子和1个内含子。该转录因子的分子量约为21kDa。Twist1的b螺旋-环-螺旋结构域在人类，小鼠，蛙，果蝇等很多物种中高度保守。Twist1蛋白中109Q-T121是最主要的结构域，负责结合DNA。该基因主要在中胚层来源的组织中表达。在人体正常组织中，Twist1在胎盘，心肌和骨骼肌等组织中高表达，在胰腺，肾脏等组织中低表达，而在脑(外胚层来源)，肺和肝(内胚层来源)的组织中不表达。Twist1可以调控很多下游靶基因，通过这种方式，来参与控制各种各样的生物学进程和信号通路件，例如FGF信号通路，SHH信号通路，以及TGFβ信号通路等。

[0005] 除了在正常组织中发挥作用，Twist1还与包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胃癌，膀胱癌，食道鳞状细胞癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤密切相关。在这些肿瘤中，Twist1可以在肿瘤发生，发展和转移中扮演多种角色。特别是可以阻碍肿瘤诱导的细胞衰老和凋亡，增强肿瘤干细胞群体，并且可以帮助癌细胞侵袭和转移，以及上皮-间叶转化(EMT)。其中EMT是肿瘤细胞发生转移的第一个步骤。近来发现，乳腺癌、恶性黑色素瘤以及其他肿瘤中Twist过表达可作为预后不良的一个指标，许多证据表明Twist1蛋白也参与调节细胞凋亡。在人类肿瘤中Twist1活化可能具有非常重要的临床意义，Twist1很可能作为指导诊断、判断预后的指标，并可作为肿瘤生物治疗的一个新靶点。

[0006] 下调TWIST1的表达，可以有效降低肿瘤抵抗衰老和凋亡的能力，抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA(siRNA)及其应用。

[0008] 本发明根据RNAi发生原理，设计并合成了针对TWIST1基因的小干扰RNA，其GC含量为36.84％，且正义链和反义链的长度均为19nt。

[0009] 进一步地，本发明的小干扰RNA双连体分子的正义链和反义链序列分别为：

[0010] 正义链：5’-CAUUCUGAUAGAAGUCUGAdTdT-3’，(SEQ ID NO.1)

[0011] 反义链：5’-TdTdGUAAGACUAUCUUCAGACU-3’(SEQ ID NO.2)。

[0012] 本发明提供的上述小干扰RNA，能够特异性下调细胞或生物体中TWIST1基因的表达量。

[0013] 进一步地，本发明的小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为：5’-CATTCTGATAGAAGTCTGA-3’(SEQ ID NO.3)。

[0014] 一种编码本发明所述小干扰RNA的DNA序列属于本发明的保护范围。

[0015] 本发明提供一种表达载体，其包含编码上述小干扰RNA的DNA序列。

[0016] 一种宿主细胞，其为可表达本发明所述小干扰RNA的细胞。

[0017] 一种含有上述小干扰RNA的药物属于本发明的保护范围。

[0018] 进一步地，所述的药物为抗肿瘤的药物。所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌和胰腺癌。

[0019] 进一步地，所述的药物为免疫治疗剂。

[0020] 一种可表达上述小干扰RNA的细胞系也属于本发明的保护范围。

[0021] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的TWIST1基因表达药物中的用途。

[0022] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的药物中的用途。

[0023] 优选地，所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞、食道鳞状细胞癌细胞和胰腺癌细胞。

[0024] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病为黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌和胰腺癌。

[0025] 有效的靶向治疗是目前国内外不断寻找的辅助治疗方法，本发明提供的特异性靶向针对TWIST1基因的siRNA转染黑色素瘤细胞后，发现siRNA能够显著下调TWIST1基因的表达，有效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物的治疗效果具有重要指导作用，可用于开发制备抗肿瘤药物，将会取得巨大的社会效益和经济价值。

附图说明

[0026] 图1为本发明的siRNA对A375细胞TWIST1基因表达的敲低效果。其中1：未转染siRNA的A375细胞；2：转染阴性对照序列的A375细胞；3：转染siRNA的A375细胞。

[0027] 图2为A375细胞中TWIST1基因mRNA敲低水平的电泳检测结果，其中泳道1：分子量标记；泳道2：转染siRNA的A375细胞；泳道3：转染阴性对照序列的A375细胞；泳道4：未转染siRNA的A375细胞。

[0028] 图3为A375细胞TWIST1蛋白敲低水平的Western blot检测，其中泳道1：未转染siRNA的A375细胞；泳道2：转染阴性对照序列的A375细胞；泳道3：转染siRNA的A375细胞。

具体实施方式

[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0030] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0031] 实施例1特异性靶向TWIST1基因的siRNA的设计合成及转染黑色素瘤细胞[0032] 1、特异性靶向TWIST1基因的siRNA的设计

[0033] 在公共的siRNA设计网站(网址为：http://sirna.wi.mit.edu/home.php；https://www.thermofisher.com/cn/zh/home.html；http://sidirect2.rnai.jp/等)上输入TWIST1的mRNA序列，按照网站指示预测可以敲低TWIST1mRNA表达的siRNA序列。

[0034] 比对多个网站的给出的预测结果，选择在至少同时在两个网站均被预测到的siRNA。

[0035] 筛选未有文献报道的siRNA序列。本实施例筛选的siRNA序列GC含量为36.84％，且正义链和反义链的长度均为19nt。

[0036] 具体来说，其正义链和反义链序列分别为：

[0037] 正义链：5’CAUUCUGAUAGAAGUCUGAdTdT-3’，(SEQ ID NO.1)

[0038] 反义链：5’-dTdTGUAAGACUAUCUUCAGACU-3’(SEQ ID NO.2)。

[0039] 本发明的小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为：5’-GAGTATGTGATCAAGGTCA-3’(SEQ ID NO.3)。

[0040] SiRNA及阴性对照序列交由广州锐博生物科技有限公司合成。

[0041] 2、本发明的siRNA转染黑色素瘤细胞

[0042] 黑色素瘤细胞A375(购自ATCC，American type culture collection)在10cm培养皿中培养至80％后，用胰酶消化，加入6孔板，使每个孔的最终细胞数为5×105个细胞。

[0043] 转染试剂准备：

[0044] A.250μl Opti-MEM(赛默飞世尔科技，美国)+5μl siRNA(20uM)，静置5分钟。

[0045] B.250μl Opti-MEM(赛默飞世尔科技，美国)+3μl Lipofeactmine 2000(赛默飞世尔科技，美国)，静置5分钟，

[0046] C.将A与B所得试剂混合后，静置20分钟。将混合后的转染试剂加入6孔板中，与A375细胞混匀。37℃,培养48小时后，收集细胞。

[0047] 实施例2 siRNA转染后鉴定TWIST1基因的mRNA表达水平

[0048] 1、实时定量PCR(q-PCR)鉴定实施例1中转染了本发明siRNA的黑色素瘤细胞A375的TWIST1基因的mRNA表达水平

[0049] 表1 q-PCR反应体系

[0050]

[0051] 前引物：AGCTACGCCTTCTCGGTCT

[0052] 后引物：CCTTCTCTGGAAACAATGACATC。

[0053] q-PCR反应程序：95℃5min；95℃15sec，62℃30sec，循环35次。

[0054] 使用实时定量自带软件分析TWIST1基因表达量的水平，结果见图1。图1显示，A375细胞转染TWIST1特异性siRNA后，TWIST1表达量仅相当于转染阴性对照序列(NC)的32％。1：未转染siRNA的A375细胞；2：转染阴性对照序列的A375细胞；3：转染siRNA的A375细胞。

[0055] 将PCR产物进行电泳检测，A375细胞中TWIST1基因mRNA敲低水平的电泳检测结果见图2，图2显示转染siRNA后，可以有效的敲低TWIST1基因的表达。

[0056] 实施例3 siRNA转染后鉴定TWIST1蛋白表达水平

[0057] 1、Western blot鉴定TWIST1基因的蛋白表达水平

[0058] 样品准备：贴壁的黑色素瘤细胞A375：1×PBS洗两遍，100μl胰酶消化，500μl培养液终止放入1.5ml EP管中。用14000rpm的转速离心5分钟。弃上清，200μl 1×PBS洗一次。加入50μl细胞裂解缓冲液，剧烈震荡，使细胞充分裂解，-20℃保存。用BCA方法检测总蛋白量。5×上样缓冲液稀释到1×，加入到裂解的细胞样品中。95℃热变性5min，随后用11500rpm的转速离心5分钟。

[0059] 2、配置12％SDS-PAGE胶。

[0060] 3、蛋白质电泳：点样，每个样品最少20μg，蛋白分子量标记点3μl。恒压100V，30分钟，随后调整电压至120V，1小时。转膜：纤维素膜预先用甲醇浸泡，用预冷的转膜缓冲液进行转膜，恒流300mA，2小时。封闭：将膜放入5％脱脂奶粉溶液(1g脱脂奶粉+20ml 1×TTBS)中，振荡1小时。倒掉脱脂奶粉溶液，加入一抗，振荡1小时。去掉一抗后，用1×TTBS洗三次，每次10分钟。随后加入二抗，振荡1小时。去掉二抗后，用1×TTBS洗三次，每次10分钟。配制显色液并均匀滴在膜上，曝光显影。将三种细胞总蛋白进行Western blot检测，结果见图3，结果显示转染siRNA后，可以有效的敲低TWIST1蛋白的表达。

[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。