本发明属于发酵技术领域，特别涉及一种发酵产4‑Acetylantroquinonol B的方法。牛樟芝是一种专性寄生于台湾腐朽牛樟树上的真菌，其子实体中含有多种天然活性物质，其中4‑Acetylantroquinonol B是近几年从其子实体中分离出的一种具有较好的抗癌作用的物质，但目前牛樟芝的研究主要集中在提高菌体量、多糖产量方面，对樟芝特有的活性代谢产物4‑Acetylantroquinonol B为目标的发酵研究较少，本发明从牛樟芝菌种出发，通过分阶段发酵培养、培养条件和培养基组成的优化，最终在不添加任何诱导物和前提物的情况下，从牛樟芝液体发酵所获得的菌体中获得4‑Acetylantroquinonol B，其产量达2.6‑5mg/g。该方法是一种发酵生产4‑Acetylantroquinonol B的新方法。
1.一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，包括如下步骤:（1）菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌（Antrodia camphorata）接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；所述牛樟芝菌为Antrodia camphorata BCRC 35396菌株；
（2）牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；
（3）牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；
（4）第一阶段液体发酵：将步骤（3）的液体种子接种至液体发酵培养基中，100-180rpm，
20-26℃，培养8-12d；液体发酵培养基组成为: 葡萄糖15-25 g/L，蛋白胨5-10 g/L，K2HPO4
0.5-1.5 g/L，MgS04·7H2O 0. 1-0.8 g/L，麦芽浸粉 15-25 g/L，苯酚0.05-0.2 g/L；
（5）第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖， 调整发酵条件为180-
220rpm，27-35℃，培养5-10d；补加葡萄糖的质量按照每1L初始液体发酵培养基补加葡萄糖
（6）菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；
（7）菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4- Acetylantroquinonol B。
2.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（1）中固体培养基组成为：葡萄糖10-30 g/L，蛋白胨2-5 g/L，麦芽浸粉 10-30g/L，琼脂 20-35 g/L。
3.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（2）孢子悬液中含有孢子数为106-107个/mL。
4.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（3）中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30 g/L，蛋白胨5-15 g/L，KH2PO4 0.5-2 g/L，MgS04·7H2O 0.05-0.2 g/L，116℃灭菌25min。
5.如权利要求1所述一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（4）中液体种子的接种量为10%-30%。
6.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，利用高效液相色谱对所述步骤（7）提取得到的目标活性物质4- Acetylantroquinonol B进行测定。
7.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）菌种的扩大培养：利用挖块接种法，将牛樟芝菌Antrodia camphorata BCRC 35396菌株接种至新的固体培养基中，固体培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.5 g/L，麦芽浸粉 20 g/L，琼脂 25 g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径4-5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用；
（2）牛樟芝孢子悬液的制备：将4℃保存菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10-
15mL无菌水，用玻璃棒刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为106-
（3）牛樟芝液体种子的培养：装液量为100mL/250mL三角瓶，培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgS04·7H2O 0. 1 g/L，116℃灭菌25min；加入1-2 mL制备好的孢子悬液 ，置于110rpm，25℃的恒温摇床中培养3-4天，菌体呈规则的小球状，直径为1-2mm，可接种至发酵培养基中；
（4）第一阶段液体发酵：将步骤（3）的液体种子以20%的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，K2HPO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0. 8 g/L，麦芽浸粉 20 g/L，苯酚0.12 g/L，置于140rpm，24℃的恒温摇床中培养12天；
（5）第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加1g葡萄糖，置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养8天；
（6）菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；
（7）菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。
一种发酵生产4-Acetylantroquinonol B的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种发酵生产4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的方法。
背景技术
[0002] 牛樟芝子实体寄生于牛樟树树干腐朽的内壁或倒伏在地上靠近土表的无树皮表面，具有强烈的牛樟树香气，含有高含量精油，外形呈板形、钟形、马蹄形或是不规则形状，多年生、无柄，紧贴于木材表面生长。不少学者对牛樟芝子实体活性成分及其药理活性进行了研究，证实牛樟芝子实体含有高氧化度三萜、活性多糖、甾醇等多种活性成分等。
[0003] 近年来，牛樟芝子实体中又分离鉴定出的了4-Acetylantroquinonol B等三萜类化合物，其在保肝、抗癌方面具有卓越的疗效。Yu-Wei Lin等已研究证实4-Acetylantroquinonol B在治疗肝癌上有较好的效果；Tung-Cheng Chang等也已研究证实4-Acetylantroquinonol B在治疗大肠癌上同样具有较好的效果，其不仅能够抑制癌细胞的增长，也能够有效的降至癌细胞的抗药性，是一种具有应用前景的癌症治疗药物。
[0004] 但是，由于牛樟芝严格的寄主特性以及自然产量的稀少，而且其唯一寄主牛樟树资源也十分匮乏，致使牛樟芝子实体远不足供应市场需求且价格十分昂贵。而利用现代生物技术进行樟芝人工培养得到菌体产物是解决樟芝供需矛盾的有效解决方式，Yu-Wei Lin等已经从液体培养的牛樟芝菌体中鉴定出了4-Acetylantroquinonol B，但是其产量低；Chien-Chi Chiang等采用液体发酵的方式，通过加入诱导物有效的提高了液态发酵的菌体中4-Acetylantroquinonol B的含量，最终其产量达0.8mg/g；因此通过液体发酵法来获得
4-Acetylantroquinonol B的研究仍处于初级阶段，而不添加任何诱导物或前提物的条件下液态发酵产4-Acetylantroquinonol B的研究尚未见报导。本发明从实验室自主分离出的牛樟芝菌种出发，在不添加任何诱导物和前提物的情况下，分两阶段发酵培养，从牛樟芝液体发酵的菌体中获得了较高产量的4-Acetylantroquinonol B。
发明内容
[0005] 本发明目的是克服现有技术产量低的不足，提供一种利用牛樟芝菌丝体发酵获得高产量活性物质4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的新方法。
[0006] 本发明 为实现 上述目的 采取以 下技术 方案 ，一种发酵 生产4 -Acetylantroquinonol B的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；
[0008] (2)牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；
[0009] (3)牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；
[0010] (4)第一阶段液体发酵：将步骤(3)的液体种子接种至液体发酵培养基中，100-180rpm，20-26℃，培养8-12d；
[0011] (5)第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖，调整发酵条件为180-220rpm，27-35℃，培养5-10d；
[0012] (6)菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；
[0013] (7)菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
[0014] 进一步地，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麦芽浸粉10-30g/L，琼脂20-35g/L。
[0015] 进一步地，所述步骤(2)孢子悬液中孢子数含量为106-107个/mL。
[0016] 进一步地，所述步骤(3)中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O 0.05-0.2g/L，116℃灭菌25min。
[0017] 进一步地，所述步骤(4)中液体发酵培养基组成为:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O 0.1-0.8g/L，麦芽浸粉15-25g/L，苯酚0.05-0.2g/L。
[0018] 进一步地，所述步骤(4)中液体种子的接种量为10％-30％。
[0019] 进一步地，所述步骤(5)中补加葡萄糖的质量按照每1L初始液体发酵培养基补加葡萄糖10-50g。
[0020] 进一步地，利用高效液相色谱对所述步骤(7)提取得到的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B进行测定。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0022] (1)与其他培养方法相比，本发明所使用的方法在发酵过程中不添加任何诱导物或前提物的条件下获得了活性物质4-Acetylantroquinonol B。
[0023] (2)本发明所使用的两阶段发酵培养方法从牛樟芝菌丝体中获得较高产量的活性物质4-Acetylantroquinonol B，产量最高可达5mg/g。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体实例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 本发明实施方式中所述牛樟芝或牛樟芝菌，优选现有技术中一株Antrodia camphorata(同义名:Taiwanofungus camphorates；Ganoderma camphoratum；Antrodia cinnamomea)YMT 1002菌株，该菌株子实体保藏于台湾生物资源保存及研究中心(简称BCRC)(BCRC Number：35396)，可通过购买方式获得。本发明方法也可采用现有技术中其他牛樟芝菌株。
[0026] 实施例1
[0027] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体种子培养的操作工艺如下：
[0028] 1)牛樟芝孢子的制备：
[0029] 利用挖块接种法，将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中，固体培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麦芽浸粉20g/L，琼脂25g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径约4-5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用。
[0030] 2)牛樟芝孢子悬液的制备：
[0031] 经扩大培养后的新菌落可用于制备孢子悬液。4℃保存的菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10-15mL无菌水，用玻璃棒轻轻刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为106-107个/mL。
[0032] 3)牛樟芝液体种子的制备：
[0033] 装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.5g/L，MgS04·7H2O 0.1g/L，116℃灭菌25min。
[0034] 加入1-2mL制备好的孢子悬液，置于110rpm，25℃的恒温摇床中培养3-4天，菌体呈规则球状，直径约为1-2mm，可接种至发酵培养基中。
[0035] 实施例2
[0036] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0037] 1)第一阶段发酵培养：
[0038] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以15％的接种量接种至第一阶段液体发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，麦芽浸粉15g/L，苯酚0.05g/L。置于120rpm，22℃的恒温摇床中培养8天。
[0039] 2)第二阶段发酵培养：
[0040] 发酵培养基中加入1.5g葡萄糖，置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养5天。
[0041] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0042] 发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定菌体干重；
[0043] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为3.5mg/g干菌体。
[0044] 实施例3
[0045] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0046] 1)第一阶段发酵培养：
[0047] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以10％的接种量接种至第一阶段发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为:葡萄糖18g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，麦芽浸粉18g/L，苯酚0.1g/L。置于100rpm，20℃的恒温摇床中培养10天。
[0048] 2)第二阶段发酵培养：
[0049] 发酵培养基中加入0.5g葡萄糖，置于180rpm，27℃的恒温摇床中培养5天。
[0050] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0051] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为2.6mg/g干菌体。
[0052] 实施例4
[0053] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0054] 1)第一阶段发酵培养：
[0055] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以20％的接种量接种至第一阶段发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为:葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，麦芽浸粉20g/L，苯酚0.12g/L。置于140rpm，24℃的恒温摇床中培养12天。
[0056] 2)第二阶段发酵培养：
[0057] 发酵培养基中加入1g葡萄糖，置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养8天。
[0058] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0059] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为5mg/g干菌体。
[0060] 实施例5
[0061] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0062] 1)第一阶段发酵培养：
[0063] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以25％的接种量接种至第一阶段发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为:葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，麦芽浸粉15g/L，苯酚0.05g/L。置于120rpm，22℃的恒温摇床中培养8天。
[0064] 2)第二阶段发酵培养：
[0065] 发酵培养基中加入1.5g葡萄糖，置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养5天。
[0066] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0067] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为3.7mg/g干菌体。
[0068] 实施例6
[0069] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0070] 1)第一阶段发酵培养：
[0071] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以30％的接种量接种至第一阶段发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为:葡萄糖18g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，麦芽浸粉18g/L，苯酚0.1g/L。置于150rpm，25℃的恒温摇床中培养8天。
[0072] 2)第二阶段发酵培养：
[0073] 发酵培养基中加入1.8g葡萄糖，置于200rpm，30℃的恒温摇床中培养8天。
[0074] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0075] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为2.6mg/g干菌体。
[0076] 实施例7
[0077] 以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
[0078] 1)第一阶段发酵培养：
[0079] 以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以18％的接种量接种至第一阶段发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为:葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，麦芽浸粉25g/L，苯酚0.2g/L。置于180rpm，26℃的恒温摇床中培养8天。
[0080] 2)第二阶段发酵培养：
[0081] 发酵培养基中加入2.5g葡萄糖，置于220rpm，32℃的恒温摇床中培养10天。
[0082] 3)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
[0083] 取一定量烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。测得液体发酵培养的菌体提取物中有目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，其产量为4.3mg/g干菌体。
